Name: endogenous protein tagging in human induced pluripotent stem cells using crispr/cas9
Uploaded: 2018-08-25T14:30:00
Duration: 14 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9 at JoVE.com

אנו מודים דפני Dambournet על תובנה דיונים רבים וייעוץ בנושא ג'ין עריכה, לעשות תאו להמחשה, אנג'ליק נלסון לקריאה ביקורתית של כתב היד, ו אנדרו טאקר ליצירת קו מתויג mEGFP תא B1 למינציה. ברצוננו להודות על תאי גזע, ג'ין ועריכה צוותי פיתוח Assay במכון אלן למדע תא על תרומתם ג'ין עריכה, תהליך בקרת איכות. הקו WTC שבהן השתמשנו כדי ליצור קו תא נערך-הגן שלנו סופק על ידי המעבדה קונקלין ר ברוס גלדסטון, קליפורניה בסן פרנסיסקו. אנו מודים מכון אלן תא המדע מייסד, פול אלן ג'י, על חזונו, עידוד, ותמיכה.

<ol>
	<li>Wood, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+editing+across+species+using+ZFNs+and+TALENs.">Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs.</a> Science. 333 (6040), 307 (2011).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Dambournet, D., Hong, S. H., Grassart, A., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tagging+endogenous+loci+for+live-cell+fluorescence+imaging+and+molecule+counting+using+ZFNs,+TALENs,+and+Cas9.">Tagging endogenous loci for live-cell fluorescence imaging and molecule counting using ZFNs, TALENs, and Cas9.</a> Methods in Enzymology. , 139-160 (2014).</li><li>Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+endogenous+protein+tagging+for+RESOLFT+super-resolution+microscopy+of+living+human+cells.">CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells.</a> Sci Rep. 5, 9592 (2015).</li><li>Hendriks, W. T., Warren, C. R., Cowan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Editing+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells:+Approaches,+Pitfalls,+and+Solutions.">Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells: Approaches, Pitfalls, and Solutions.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 53-65 (2016).</li><li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing.">Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Cell Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).</li><li>Doyon, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+clathrin-mediated+endocytosis+revealed+in+genome-edited+mammalian+cells.">Rapid and efficient clathrin-mediated endocytosis revealed in genome-edited mammalian cells.</a> Nature Cell Biology. 13 (3), 331-337 (2011).</li><li>Cho, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+of+fluorescently+labeled,+endogenous+RNA+Polymerase+II+in+living+cells+with+CRISPR/Cas9-mediated+gene+editing.">Super-resolution imaging of fluorescently labeled, endogenous RNA Polymerase II in living cells with CRISPR/Cas9-mediated gene editing.</a> Sci Rep. 6, 35949 (2016).</li><li>White, C. W., Vanyai, H. K., See, H. B., Johnstone, E. K. M., Pfleger, K. D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+nanoBRET+and+CRISPR/Cas9+to+monitor+proximity+to+a+genome-edited+protein+in+real-time.">Using nanoBRET and CRISPR/Cas9 to monitor proximity to a genome-edited protein in real-time.</a> Sci Rep. 7 (1), 3187 (2017).</li><li>Roberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+gene+tagging+using+CRISPR/Cas9+in+human+stem+cells+to+illuminate+cell+organization.">Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization.</a> Mol Biol Cell. 28 (21), 2854-2874 (2017).</li><li>Soldner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+isogenic+pluripotent+stem+cells+differing+exclusively+at+two+early+onset+Parkinson+point+mutations.">Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations.</a> Cell. 146 (2), 318-331 (2011).</li><li>Young, J. E., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease+in+a+dish:+promises+and+challenges+of+human+stem+cell+models.">Alzheimer's disease in a dish: promises and challenges of human stem cell models.</a> Human Molecular Genetics. 21 (R1), R82-R89 (2012).</li><li>Soares, F. A., Sheldon, M., Rao, M., Mummery, C., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+coordination+of+large-scale+human+induced+pluripotent+stem+cell+initiatives:+Wellcome+Trust+and+ISSCR+workshops+white+paper.">International coordination of large-scale human induced pluripotent stem cell initiatives: Wellcome Trust and ISSCR workshops white paper.</a> Stem Cell Reports. 3 (6), 931-939 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gene, NCBI- National Center for Biotechnology Information. , (2017).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gene, NCBI- National Center for Biotechnology Information. , (2017).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Allen Cell Methods: Single cell passaging human iPS cells. , (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Allen Cell Explorer. , (2017).</li><li>Lingeman, E., Jeans, C., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Purified+CasRNPs+for+Efficacious+Genome+Editing.">Production of Purified CasRNPs for Efficacious Genome Editing.</a> Curr Protoc Mol Biol. 120, 31-31 (2017).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Michael Davidson Fluorescent Protein Collection. , (2017).</li><li>Cox, D. B., Platt, R. J., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+genome+editing:+prospects+and+challenges.">Therapeutic genome editing: prospects and challenges.</a> Nature Medicine. 21 (2), 121-131 (2015).</li><li>Haas, S. A., Dettmer, V., Cathomen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+genome+editing+with+engineered+nucleases.">Therapeutic genome editing with engineered nucleases.</a> Hamostaseologie. 37 (1), 45-52 (2017).</li><li>Beumer, K. J., Trautman, J. K., Mukherjee, K., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+DNA+Utilization+During+Gene+Targeting+with+Zinc-Finger+Nucleases.">Donor DNA Utilization During Gene Targeting with Zinc-Finger Nucleases.</a> G3 (Bethesda). 3 (4), 657-664 (2013).</li><li>Orlando, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc-finger+nuclease-driven+targeted+integration+into+mammalian+genomes+using+donors+with+limited+chromosomal+homology.">Zinc-finger nuclease-driven targeted integration into mammalian genomes using donors with limited chromosomal homology.</a> Nucleic Acids Research. 38 (15), e152 (2010).</li><li>DeWitt, M. A., Corn, J. E., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+via+delivery+of+Cas9+ribonucleoprotein.">Genome editing via delivery of Cas9 ribonucleoprotein.</a> Methods. 121-122, 9-15 (2017).</li><li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li><li>Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+homology-directed+human+genome+engineering+by+controlled+timing+of+CRISPR/Cas9+delivery.">Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.</a> Elife. 3, e04766 (2014).</li><li>Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHOPCHOP+v2:+a+web+tool+for+the+next+generation+of+CRISPR+genome+engineering.">CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering.</a> Nucleic Acids Research. 44 (W1), W272-W276 (2016).</li><li>Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHOPCHOP:+a+CRISPR/Cas9+and+TALEN+web+tool+for+genome+editing.">CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).</li><li>Bae, S., Park, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas-OFFinder:+a+fast+and+versatile+algorithm+that+searches+for+potential+off-target+sites+of+Cas9+RNA-guided+endonucleases.">Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases.</a> Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> CRISPOR V4.3. , (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+non-canonical+PAMs+for+CRISPR/Cas9-mediated+DNA+cleavage+in+human+cells.">Comparison of non-canonical PAMs for CRISPR/Cas9-mediated DNA cleavage in human cells.</a> Sci Rep. 4, 5405 (2014).</li><li>Chen, X., Zaro, J. L., Shen, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+protein+linkers:+property,+design+and+functionality.">Fusion protein linkers: property, design and functionality.</a> Adv Drug Deliv Rev. 65 (10), 1357-1369 (2013).</li><li>Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scalable+strategy+for+high-throughput+GFP+tagging+of+endogenous+human+proteins.">A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (25), E3501-E3508 (2016).</li><li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+highly+efficient+mammalian+cell+engineering+via+Cas9+protein+transfection.">Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection.</a> Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).</li><li>Baker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+Genetic+Mosaicism+in+Cultures+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Detecting Genetic Mosaicism in Cultures of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 7 (5), 998-1012 (2016).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

השיטה המוצגת כאן עבור יצירת endogenously מוסדר חלבון פלואורסצנטי fusions ב hiPSCs היא גישה צדדי ורב עוצמה ליצירת שורות תאים ג'ין נערך עם יישומים ועד תא חי הדמיה תפקודית מחקרים שונים " מודלים מחלת בצלחת"באמצעות hiPSC החולה-derived קווים13,14,15. כאשר נעשה שימוש בשיטה זו כדי להציג תגיות FP גדולים N - או קצה קרבוקסילי של חלבונים אנדוגני, פוטנציאל ניתן לנצל אותה כדי להציג תגיות או קטן שינויים גנטיים אחרים מודל או הנכון גורמי מחלות מוטציות22,23 . עבור מוסיף קטנות יותר, בגודל של הזרוע הומולוגיה עשוי להצטמצם, אך שהגישה הכללית עריכה הציג בשיטה זו עדיין עשויות לחול24,25. בזמן השימוש hiPSCs מומלץ עבור השירות העצום שלהם, עם אופטימיזציה זהירה, פרוטוקול זה שעשוי להיות מותאם כדי לערוך את הגנום של קווים בתרבית של תאים אחרים.
בשעת זיהוי הגן עניין לתיוג FP, התעתיק שפע הערכות (מתוך microarray או נתונים RNA-Seq) הם נקודת התחלה טובה עבור הערכת אם מצאה ביטוי של גנים או isoform של עניין, למרות רמות תעתיק לא תמיד לתאם עם רמות חלבון. האסטרטגיה FACS-העשרה המתוארים כאן שישתלבו בצורה הטובה ביותר את הגנים באים לידי ביטוי לפחות בצורה מתונה גם בסוג התא עניין. אסטרטגיה זו הצליחה גם בבחירת עבור fusions המציגים לוקליזציה punctate ו/או דיסקרטית דפוסי כגון centrin, desmoplakin ו- paxillin איפה האות רקע יחס נמוך מאוד12,19. הגנים אינם מבוטאים מאוד או באים לידי ביטוי רק סוגי תאים נגזרות עשויים לדרוש אסטרטגיות נוספים לבחירה.
נקודת המוצא crRNA התורם תבנית פלסמיד עיצובים בשימוש שורות תאים אנושיים צריך להיות הגנום האנושי הפניה (GRCh38). כי הגנום של שורות תאים שונים יכול להשתנות בתוך מאותו המין, מכיוון CRISPR/Cas9 הוא רצף ספציפי, זה עוזר מאוד לזיהוי. גרסאות ספציפי לשורה תא (פולימורפיזמים נוקלאוטיד יחיד או הוספות/מחיקות (indels)) זה שונה מן הגנום הפניה ולשלב אלה על עיצוב. פעולה זו מבטיחה כי crRNAs יהיה תואם הגנום מארח ואת הזרועות הומולוגיה התורם פלסמיד תבנית ישמרו כל גרסאות ספציפיות של התא-קו. אסטרטגיה המוצע נועד לשלב גרסאות homozygous crRNAs ושל התורמים של הזרועות הומולוגיה של תבנית פלסמיד במהלך תהליך העיצוב. שילוב גרסאות משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים היא אופציונלית. ריאגנטים ספציפיים ניסויים בטוק גדול והוא עוד שיקולים מרכזיים עבור פרוטוקול זה נדונים להלן.
Cas9 חלבון
היתרון העיקרי של שימוש Cas9 חלבון זה מציגה את Cas9 ואת gRNA כמו RNP מורכבים הוכח לגרום מוגבל משך של פעילות נוקלאז לעומת גישות מבוססות פלסמיד שבו הביטוי של Cas9, gRNA עשוי להמשיך ימים ולהוביל ל גדול יותר בהנחה-ויעד פעילות26,27. יתרון נוסף של שימוש Cas9 חלבון היא שזה זמין קליב פעם אחת בתוך התאים. זה מנוגד קונבנציונליים יותר שיטות של שימוש Cas9 mRNA או Cas9/gRNA פלסמיד הדורשים תמלול, תרגום, חלבון עיבוד26,28. Wildtype Cas9 הפישחה ינפל תומימת ס חלבון זמין כעת ממקורות מסחריים רבים.
מדריך ה-RNA
ישנם כלים רבים בציבור למציאת מטרות crRNA ליד האתר הרצוי של ההכנסה FP שיש אפס או מספר החזוי את המטרות המארח הגנום29,30,31,32. יעילות HDR ו דיוק התוצאה HDR משתנים בצורה משמעותית בין היעדים crRNA בשימוש של לוקוס נתון12. מסיבה זו, בדיקת מספר crRNAs (2-4, רצוי במרחק 50 bp של אתר הכניסה הרצויה) לכל לוקוס זה מומלץ כי הדבר עשוי להגדיל את ההסתברות של עריכת ניסוי יירוט מוצלח. האפשרויות הנוכחיות להעברת gRNA לכלול סינתטי 2-חלק crRNA, tracrRNA, gRNAs יחיד סינתטי (sgRNAs), במבחנה עיבד sgRNAs, או העברה של פלסמיד לתאים לבטא את sgRNA של מקדם U6. פרוטוקול זה לא אופטימלי עבור פעילות גבוהה מחשוף. CrRNA 2-חלק שלא שונתה, tracrRNA (ראה טבלה של חומרים) שימשו עם המטרה של יצירת שורות תאים מתויג FP מונו-allelic תוך גרימת את ההפרעות הפחות פוטנציאלית על התאים.
התורם תבנית פלסמיד
כי חלק הומולוגיה זרוע רצף בתנאי ב התורם תבנית פלסמיד ישולבו לתוך הגנום מארח במהלך האירוע HDR, צריך להכיר מוטציות נקודה אל אתרי זיהוי crRNA כדי למנוע המחשוף מאת Cas9 בעקבות HDR. לעיתים קרובות השינוי משובש הפשוט ביותר הוא מתכוון להפוך למוטציות. את רצף פאם. כי כמה רצפים פאם קאנונית עדיין ניתן לזהות לפי סוג הפרוע Cas9 הפישחה ינפל תומימת ס , עדיף להימנע משימוש הגולה, לנדנד או נגה33. מוטציה הזרוע הומולוגיה, הימנע מוטציות שם נרדף, כניסתה של codons נדיר. אם שינוי שם נרדף רצף פאם אינו אפשרי, לשקול ביצוע שלוש מוטציות נקודה נרדף באזור זרע (10 bp proximal לפאם) של אתר איגוד crRNA. נקטו זהירות יש לנקוט בעת ביצוע שינויים אלה באזור לא מתורגם 5ʹ (UTR) מאז אזורים אלה עשויים להכיל רצפי תקינה חשוב. ייעוץ מסד נתונים של שימור גנטיות כגון רצועות גנומיקה השוואתית של הדפדפן הגנום UCSC יכולים לספק הדרכה במקרים אלה, כמו שינויים שאינם והתפאורה בסיסים עשוי להיות טוב יותר נסבלת מאשר שינויים בסיסים מאוד שנשמרת17. לפעמים עצם החדרת הרצף FP זה מספיק כדי לשבש את אתר קישור crRNA (כמו באיור 1); עם זאת, הרצף החדש מצורף צריך להיבדק על התמדתו של איגוד crRNA ורצפים פאם.
חומצת אמינו linkers בין FP החלבון מקורי מומלץ כדי לשמר את הפונקציה של חלבון פיוז'ן34. לעיתים קרובות מקשר חומצת אמינו עשוי להיבחר עבור תשלום מסוים או הגודל שלה. אם cDNA פיוז'ן עם עיצוב דומה המיועד אנדוגני חלבון כימרי טוב נחקרה, כי אותו רצף מקשר יכול לשמש את הניסוי בטוק CRISPR/Cas912,19. אם מידע כזה אינו זמין, מקשר (linker) קצר כגון GTSGGS היה גם בעבר בהצלחה12. מחקרים אחרים הראו הצלחה עם רצף כלליים קטנים מקשר חומצה אמינו 3 עבור מגוון של מטרות35.
תרביות תאים והעשרה FACS
ריאגנטים זמינים מסחרית תרביות תאים רבים מנוסחות למסירה של סוגים מסוימים של מולקולות תאים, ואילו מערכת אלקטרופורציה יכול לשמש כדי לספק ריאגנטים עם מגוון רחב של גודל, תשלום הרכב. בנוסף להיותו שיטה נפוצה תקנים עבור תאים קשה-עד-transfect כמו hiPSCs, אלקטרופורציה נושאת גם את היתרון של אספקת כל שלושת הרכיבים FP CRISPR/Cas9-מתווכת ' טוק-אין כמתואר בשיטה זו. אלקטרופורציה נמצאה כדי להפיק את התוצאות הטובות ביותר בהשוואה אחרים ריאגנטים זמינים מסחרית כאשר לפתח שיטה זו (נתונים לא מוצג), שימש גם על ידי אחרים עבור RNP משלוח26,28,36 .
בעת שימוש בפרוטוקול זה לצורך עריכה hiPSCs, טיפול מיוחד יש לנקוט על מנת להבטיח טיפול עדין של התאים לפני ואחרי הגן עריכת תהליכי הישרדות cell אופטימלית של בידול ספונטנית מינימלי. בפרט, השיטות העשרה FACS צריך להיות מותאם לצורך מיון תאי גזע באמצעות הגדול הזרבובית אפשרי (130 מיקרומטר), נמוך, קצב הזרימה (≤24 µL/דקה), נוזל הנרתיק ללא חומר משמר (כגון תמיסת מלח, ראה טבלה של חומרים), ודגימת נמוך לחץ (10 psi). במקום לתא בודד מיון, דבר המתבטא הכדאיות שיוצרת בתאי גזע, hiPSCs מועשר FACS ממוינת בתפזורת, מורחבת כאוכלוסייה כדי למטב את הכדאיות תא ותקינות תאי גזע. אולם, מיון תא יחיד עשוי להיות מתאים פחות סוגי תאים רגישים. כדי לקדם את הישרדות cell, התאים הם חזרה אל תרבות יותר מאשר שעה אחת לאחר קציר העשרה FACS, המשיך בטמפרטורת החדר לאורך כל תהליך המיון. עבור סוגים מסוימים של התא, הישרדות cell יכול גם להיות מוגברת על ידי תאים ומוכנסות על קרח (4° C) לאורך כל תהליך המיון.
הרחבת בכמות גדולה של תאים FP-חיוביות מספקת הזדמנות להעריך את האוכלוסייה על-ידי ניתוח ההדמיה של פיוז'ן לוקליזציה חלבון לפני יצירת קווים המשובטים. בעוד האוכלוסייה מועשר וכתוצאה מכך של תאים עשוי להיות מספיק עבור מחקרים, אוכלוסיות אלה מציגים לעתים קרובות FP אותות שונים, בעוצמות שונות. הקווים המשובטים מבודד יש אות אחידה (איור 3), שהופך אותם מתאים יותר עבור ניסויים פונקציונלי12.
תא המשובטים קו הדור
לאורך כל עריכה של המשובטים קו הדור התהליך, חשוב לעקוב אחר מורפולוגיה תאים. מושבות hiPSC גדל בתנאים ללא מזין צריך להפגין קצוות חלקים ו-18,12,19מרכז תיקו, ארוזה היטב. תאים להתייחס פחות מ 5% של התרבות. כאשר בוחרים מושבות בודדות, בחר באלה מורפולוגיה טוב את התערוכה. במהלך לצלחת 96-ובכן, passaging אירועים, בדוק שיבוטים על מורפולוגיה, להפסיק את אלה יש מגודל כמו זה עלול להוביל בידול או אינדיקציה לחוסר יציבות גנטית.
דור של שורות תאים המשובטים מאפשר לאישור גנטי של עריכה מדויקת, וזה חשוב כי Cas9-induced גדיל כפול שובר הגנום לעיתים קרובות תוקנו imprecisely למרות התאגדות של התג-מיקומה הרצוי. מבחני מבוססי ה-PCR שתואר לעיל הראה כי מצטברת על פני עשר לוקוסים גנומית ייחודיים רבים (% 45) המשובטים לבטא-FP סבלו מתורם שילוב של עמוד השדרה פלסמיד מיקומה יישוב או באופן אקראי (לעתים רחוקות) הגנום12. בנוסף, 23% של GFP-חיוביות שיבוטים (n = 177) על פני עשר לוקוסים ייחודי נמצאו מוטציות ליד או באתר חיתוך crRNA הצפויה אלל לא מתויגות, ככל הנראה עקב NHEJ12פונדקאים. זה ניתוח גנטי של קווים רבים המשובטים (~ 100 שכפולים/עריכה) הדגיש את החשיבות של אימות גנטי שאינו אפשרי בקרב אוכלוסיה תא מאז FP-ביטוי ולוקליזציה פיוז'ן הצפוי חלבון לבד אינם מבטיחים12 עריכה מדויקת . בנוסף, אין אפשרות לבצע מבחני אלה מבוססי ה-PCR על אוכלוסיה מועשר של תאים עם ממשות, המצדיקים את הצורך קו המשובטים דור לפני ניתוח משמעותי ניתן להשלים. אישור גנטי של התג FP שנוספו ואימות של שלמות גנטית אלל ערוך (ב ערוכות כפיל מונו-allelic) נמצאים שניהם הדרושים כדי להבטיח עריכה מדויקת על מיקומה יישוב מעבר ביטוי התג.
קצב נמוך של פעולות עריכה דו-allelic, חוסר חופש-יעד מוטציות (בתור לבדיקה על ידי סנגר ורצף exome) נצפו עד כה שימוש זו שיטה (נתונים שלא פורסמו)12. . זה עקבי עם מחקרים קודמים המתאר את השימוש RNP לטווח קצר עבור26,CRISPR/Cas9 ניסויים27. חוסר של שורות תאים המשובטים בעריכה דו-allelic יכול להיות גם לוקוס ספציפי או בשל חוסר היכולת של התא לסבול שניים מתויג עותקים של חלבון חיוני כפי שהוצע של ניסויים שפורסמו קודם לכן איפה היו תאים בשם הערוך דו-allelic ציין עבור אחד לוקוס (LMNB1), אבל לא עוד (TUBA1B)12. קווי דו-allelic תא המשובטים מאומת לחלוטין נוצרו באמצעות זו שיטה תג ST6 בטא-galactoside אלפא 2, 6-sialyltransferase 1 (ST6GAL1), וחבר RAB5A ראס אונקוגן המשפחה (RAB5A) עם mEGFP19.
מעבר המאשרת את הדיוק של ערוך הגנום, יש מגוון של מבחני בקרת איכות יכול לשמש עוד יותר לאפיין את הקו המשובטים ולזהות שיבוטים זה למלא את כל תאי גזע, גנומית, ולהשתמש התא הביולוגי לקריטריונים בעתיד מחקרים . תא ביולוגי, פונקציונלי מבחני יכול לשמש כדי לאשר את הביטוי המתאים, לוקליזציה, הפונקציה של חלבון פיוז'ן12. ההשוואה ערוך ל'בקרת הורים יעזרו להעריך את ההשפעה של תהליך העריכה על לוקליזציה, דינמיקה, ופועלים. מבחני אחרים כגון ניתוח גדילה, בדיקות יציבות גנומית יכולים גם לעזור לקבוע אם החלבון מתויג הוא perturbing לתא. בעת שימוש hiPSC ב פרוטוקול זה, הערכת סמנים pluripotency ופוטנציאל בידול יכול להיות קריטי בקביעת שיבוט זה יקר עבור במורד הזרם מחקרים12. כי מורחב של תרבות hiPSC הוכח להוביל לחוסר יציבות גנטית, ניטור קצב הגידול, קריוטיפ של שורות תאים המשובטים גם חשוב12,37. עם זאת, הסופי מיועד לשימוש של התאים הערוך בסופו של דבר יקבע את רמת ולרוחבה של בקרת איכות ניתוח משתנים בהתאם ליישום.

השימוש של אסטרטגיות לעריכת הגנום, במיוחד CRISPR/Cas9, ללמוד תהליכים תאיים הופכת יותר ויותר נגיש ובעל ערך1,2,3,4,5, 6 , 7. אחד היישומים רבים של CRISPR/Cas9 הוא המבוא (באמצעות תיקון הומולוגיה בוים (HDR)) של רצפי אקסוגני גדולים כגון GFP לתוך לוקוסים גנומית מסוים ואז לשרת ככתבים לפעילות של מוצר גן או חלבון8 . טכניקה זו ניתן לצרף רצף החלבון הניאון מסגרת קריאה פתוחה אנדוגני איפה החלבון פיוז'ן endogenously מוסדרים וכתוצאה מכך יכול לשמש כדי להמחיש את לוקליזציה subcellular ואת הדינמיקה של החלבון עניין5 ,6,9,10,11. בעוד חלבונים מתויגות endogenously מציעים יתרונות רבים לעומת מערכות ביטוי, החדרת רצפים גדולים לתוך הגנום האנושי הוא תהליך לא יעיל בדרך כלל בדרישה בחירה או העשרה אסטרטגיה להשגת אוכלוסיה של תאים שיכולים ניתן בקלות למדה5,12.
פרוטוקול זה מתאר את ההוספה של רצף ה-DNA קידוד חלבון פלואורסצנטי (FP) לתוך לוקוס גנומית הרצוי. הפרוטוקול כולל תכנון ואספקה של פלסמיד תבנית של התורם, את ribonucleoprotein (RNP) מורכבים (חלבון פראי סוג הפישחה ינפל תומימת ס Cas9 בשילוב עם CRISPR סינתטי RNA (crRNA), טרנס-הפעלת crRNA (tracrRNA)). תיאר גם הוא העשרת של תאים putatively הערוכות באמצעות תא פלורסצנטיות מופעל מיון (FACS) ואת התהליך דור קו תא המשובטים. עד כה, נעשה שימוש בשיטה זו כדי ליצור קווים hiPSC עם monoallelic או תגיות (לעתים רחוקות) דו-allelic חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תיוג חלבונים עשרים וחמש המייצג מבנים הסלולר העיקרי. תאים הערוך המתקבלת מן המאמצים האלה אושרו לעשות ההוספה גנטי הצפוי, אקספרס של חלבון כימרי לאיתור כראוי, לשמור על pluripotency, קריוטיפ יציב12 (, נתונים שלא פורסמו). שיטה זו שימש גם להפיק מספר השני יחיד, כפול (שני חלבונים שונים מתויגים באותו התא) נערך אוכלוסיות של hiPSCs (נתונים שלא פורסמו).
IPSCs האדם נגזר מתורם בריא נבחרו למאמצים אלו לעריכת הגנום כי, בניגוד שורות תאים קונבנציונליים רבים, הן דיפלואידי, karyotypically, שאינם טרנספורמציה ויציב המקדימות. מאפיינים אלה מספקות מודל אטרקטיבי ללמוד ביולוגיה של התא הבסיסי ומודלים המחלה. יתר על כן, הפוטנציאל בידול של hiPSCs מספק הזדמנות ללמוד בשלבים התפתחותיים רבים במקביל מעבר שושלות שונות, סוגי תאים באמצעות תאים isogenic כולל organoids, רקמות, "מחלת בצלחת" מודלים13 14, ,15. בעוד פרוטוקול זה פותחה עבור hiPSCs (קו WTC), זה יכול להיות אינפורמטיבי לפיתוח פרוטוקולים באמצעות קווים בתרבית של תאים אחרים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1169px;" width="1169">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Geneious R9</td>
			<td style="width:231px;">Biomatters, or similar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:515px;">bioinformatics software for in silico donor plasmid design</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">TE Buffer pH 8.0</td>
			<td style="width:231px;">IDT, or similar</td>
			<td style="width:119px;">11-01-02-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:305px;">HERAcell VIOS 160i CO2 incubator, or similar</td>
			<td style="width:231px;">ThermoFisher Scientific, or similar</td>
			<td style="width:119px;">51030408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">Pipettes (1000 &#181;L, 200 &#181;L, 20 &#181;L, 10 &#181;L, 2 &#181;L)</td>
			<td style="width:231px;">Rainin, or similar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Pipette tips (1000 &#181;L, 200 &#181;L, 20 &#181;L)</td>
			<td style="width:231px;">Rainin, or similar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Multi-channel Pipette (200 &#181;L)</td>
			<td style="width:231px;">Rainin, or similar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Serological pipetes (25 mL, 10 mL, 5 mL)</td>
			<td style="width:231px;">Costar, or similar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">BRAND 8-Channel Manifold for Quiksip, Autoclavable</td>
			<td style="width:231px;">Millipore Sigma, or similar</td>
			<td style="width:119px;">BR704526-1EA</td>
			<td style="width:515px;">use with non-filtered pipet tips, such as Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10, below</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10</td>
			<td style="width:231px;">Thermo Fisher, or similar</td>
			<td style="width:119px;">3501-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">XP2 Pipette Controller</td>
			<td style="width:231px;">Drummond, or similar</td>
			<td style="width:119px;">4-000-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Disposable Pasteur Pipets</td>
			<td style="width:231px;">VWR, or similar</td>
			<td style="width:119px;">53300-567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet</td>
			<td style="width:231px;">CELLGARD, or similar</td>
			<td style="width:119px;">NU-481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced</td>
			<td style="width:231px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">354230</td>
			<td style="width:515px;">lot tested before use with hiPSC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">DMEM/F12 (-phenol red)</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11039-021</td>
			<td>cold, for diluting Matrigel 1:30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">mTeSR1 Complete Media</td>
			<td style="width:231px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">85850</td>
			<td>recommended growth media for WTC hiPSC line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">WTC hiPSC line</td>
			<td style="width:231px;">Coriell</td>
			<td style="width:119px;">GM25256</td>
			<td>the hiPSC line used in this protocol is available through Coriell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Tissue culture dish 100 mm</td>
			<td style="width:231px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">6-well Cell Culture Plate</td>
			<td style="width:231px;">CELLSTAR</td>
			<td style="width:119px;">657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">StemPro Accutase</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">A11105-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">15 mL polystyrene conical</td>
			<td style="width:231px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">62.554.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Y-27632 (ROCK Inhibitor)</td>
			<td style="width:231px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">72308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic crRNA, unmodified (custom sequence)</td>
			<td style="width:231px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">Custom0247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA</td>
			<td style="width:231px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">U-002005-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">Recombinant wild-type Streptococcus pyogenes Cas9-NLS purified protein, 40 &#181;M</td>
			<td style="width:231px;">University of California-Berkeley QB3 Macrolab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">Custom donor plasmid (PriorityGENE)</td>
			<td style="width:231px;">Genewiz</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:515px;">donor insert design was synthesized and cloned into pUC57 backbone by Genewiz</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">DNA LoBind Tube 1.5 mL</td>
			<td style="width:231px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">NucleoBond Xtra Maxi EF</td>
			<td style="width:231px;">Clontech</td>
			<td style="width:119px;">740424.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Neon Transfetion System</td>
			<td style="width:231px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Neon Transfection System, 100 &#181;L kit</td>
			<td style="width:231px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MPK10096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">5 mL Polystyrene Round-bottom Tube with Cell Strainer Cap</td>
			<td style="width:231px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">15 mL High Clarity Polyproylene Conical Tube</td>
			<td style="width:231px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">FACSAriaIII Fusion</td>
			<td style="width:231px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">656700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">FACSDiva software</td>
			<td style="width:231px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">FlowJo version 10.2</td>
			<td style="width:231px;">TreeStar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">NERL Blood Bank Saline</td>
			<td style="width:231px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">8504</td>
			<td>used as preservative-free FACS Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Olympus SZX7 Stereo Microscope, or similar</td>
			<td style="width:231px;">Olympus, or similar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Tissue culture plate, 96-well</td>
			<td style="width:231px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">96 well Cell Culture Plate, V-Bottom</td>
			<td style="width:231px;">CELLSTAR</td>
			<td style="width:119px;">351180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">CryoStor CS10</td>
			<td style="width:231px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C2874-100ML</td>
			<td>used as cryopreservation buffer for cells in 96-well plate format</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Parafilm</td>
			<td style="width:231px;">Bemis</td>
			<td style="width:119px;">PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">24 well Cell Culture Plate</td>
			<td style="width:231px;">CELLSTAR</td>
			<td style="width:119px;">662160</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

endogenous protein tagging in human induced pluripotent stem cells using crispr/cas9

פרוטוקול מוצג ליצירת תאי גזע pluripotent המושרה אנושי (hiPSCs) כי חלבונים אקספרס אנדוגני דבוקה תגיות פלורסנט N - או C-מסוף במסגרת. מערכת CRISPR/Cas9 prokaryotic (קצר באופן קבוע interspaced באשכולות 9 חזרה/CRISPR-הקשורים palindromic) עשוי לשמש להציג רצף אקסוגניים גדולים לתוך לוקוסים גנומית באמצעות תיקון הומולוגיה בוים (HDR). כדי להשיג את טוק-in הרצוי, פרוטוקול זה מעסיקה את ribonucleoprotein (RNP)-המבוסס על הגישה שבה פראי סוג הפישחה ינפל תומימת סטרפטוקוקוס Cas9 חלבון, סינתטי 2-חלק ה-RNA (gRNA), הוראות פלסמיד תבנית של התורם נמסרות על התאים באמצעות אלקטרופורציה. תאים putatively הערוך לבטא את החלבונים fluorescently מתויג מועשרים ידי תא פלורסצנטיות מופעל מיון (FACS). קווים המשובטים אז נוצרות, ניתן לנתח לתוצאות עריכה מדויקת. על ידי הצגת את תג ניאון על מיקומה גנומית של הגן עניין, וכתוצאה מכך subcellular לוקליזציה של הדינמיקה של החלבון פיוז'ן שניתן ללמוד תחת שליטה תקינה אנדוגני, שיפור מפתח על-קונבנציונאלי ביטוי מערכות. השימוש hiPSCs כמערכת מודל עבור ג'ין תיוג מספק הזדמנות ללמוד את החלבונים מתויג בתאים דיפלואידי, nontransformed. מאז hiPSCs יכול להיות מובחן סוגי תאים מרובים, גישה זו מספקת את ההזדמנות ליצור וללמוד חלבונים מתויג במגוון של הקשרים הסלולר isogenic.

המטרה של הניסוי הזה היה שתתיך mEGFP (GFP משופרת monomeric) החלבון B1 מיטל זהר גרעינית על ידי החדרת את רצף mEGFP עד הסוף 5ʹ של הגן LMNB1 (קצה אמיני של החלבון). מקשר (חומצת אמינו רצף SGLRSRAQAS) נבחרה בהתבסס על הקודם cDNA בונה מייקל דוידסון אוסף החלבון הניאון21. כי האזור crRNA מחייב פלסמיד תבנית התורם עבור כל מועמד crRNA הופרעו לאחר ההוספה סיליקו mEGFP ואת הרצף מקשר, אין מוטציות נקודה צריכה להתבצע כדי לשבש את המחשוף מאת והכרה פוטנציאליים crRNA Cas9 של הרצף התורם (איור 1). הרצף התורם הכיל 1 kb הומולוגיה זרועות איגוף בשני הקצוות של הרצף mEGFP-מקשר. 2,734 וכתוצאה מכך bp של ה-DNA היה משובטים לתוך עמוד השדרה pUC57, רצף אומתה, וטיהרו פלסמיד תבנית וכתוצאה מכך התורם היה שימוש של הכנה ללא אנדוטוקסין maxi. התורם תבנית פלסמיד ואת RNP מורכבים היו transfected, תאים putatively הערוך היו מועשר, הלוקליזציה של חלבון כימרי B1 מיטל זהר גרעיני mEGFP אושרה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ (איור 2). רק תוצאות תרביות תאים crRNA1 מתוארים כאן, למרות שני רצפים crRNA המיוצר אוכלוסיות הערוך putatively12.
בהשוואה הפקד שליליים, אשר הכיל אין gRNA, Cas9 חלבון או תורם פלסמיד תבנית בהתגובה אלקטרופורציה (מאגר בלבד), את crRNA1 LMNB1 transfected התאים הכלולים 0.95% תאים mEGFP-חיוביות המייצג את הערוך putatively mEGFP גרעיני מיטל זהר B1 אוכלוסייה (איור 3 א). תוצאה זו היה בטווח של טוק-אין יעילות שנצפה על-פני לוקוסים גנומית רבים באמצעות שיטה זו, כפי שדווחה בעבר12.
התאים mEGFP-חיוביות היו מבודדים על ידי FACS, עם תמונה על ידי מיקרוסקופ בשידור חי כדי לאשר לוקליזציה הצפוי של גרעיני mEGFP מיטל זהר B1 פיוז'ן החלבון על המעטפה גרעיני. לאחר FACS-העשרה, כ- 90% של תאים ממוינים מהאוכלוסייה crRNA1 LMNB1 היו mEGFP-חיוביות (כפי שנקבע על ידי מיקרוסקופ), מציע את זה כמה תאים mEGFP-שלילי שיתוף טיהור עם תאי ה-GFP-חיוביות במהלך ההליך מיון. זה היה רמת העשרה מותרים עבור איסוף של שיבוטים 96 שהקרין יכול אז להיות גנטית לצורך עריכה מוצלחת. באופן כללי, ניתוק העשרה מוצלח הוא 50% חיובי GFP.
הרוב המכריע של האוכלוסייה הסלולרי ממויינת מוצגים פלורסצנטיות מעטפת הגרעין (הגרעין לפריפריה) בתאים nondividing הנדן גרעיני המורחבת בתוך הציטופלסמה במהלך מיטוזה מתן אמון הנכון גנומית לערוך LMNB1 לוקוס. האוכלוסייה מועשר הכיל תאים עם אות או בהירים או עמום. ההבדל בעוצמת האות ומשקפים שילוב של נכונות ושגויות עריכה תוצאות והדגשים השירות של יצירת קו המשובטים המאומת גנטית נוספת מחקרים (ראה דיון) (איור 3b)12. אחרי דור קו המשובטים, גנטית לאמת תאים הראתה עוצמת GFP אחיד בניסויים מיקרוסקופ (איור 3 c).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig1.jpg"> איור 1 . עיצוב אסטרטגיה עבור אמיני GFP תיוג של ג'ין LMNB1. תג ה-GFP תוכנן עבור N-מסוף 5ʹ ההכנסה של אקסון הראשון של LMNB1 הממוקם על כרומוזום 5. הומולוגיה הן 5ʹ והן 3ʹ זרועות הינם 1 kb כל הפגישה בין codon את ההתחלה (ATG) את codon השני (הומולוגיה נשק באופן חלקי בלבד מיוצג באיור). שני המועמדים crRNAs תוכננו כדי להנחות Cas9 כדי לדבוק קרוב האתר ההכנסה המיועדת ככל האפשר, תוך שהם עדיין ייחודי הגנום. רצף mEGFP, מקשר של חומצת אמינו היו שנוסף רק 3ʹ של codon ההתחלה (רצף mEGFP, מקשר רציני). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58130/58130fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig2.jpg"> איור 2 . זרימת עבודה להפקת endogenously מתויג קווים המשובטים hiPSC. רכיבים תרביות תאים, כולל המתחם RNP Cas9/crRNA/tracrRNA (מוצג חלבון Cas9 אדום עם crRNA זהב, סגול tracrRNA), התורם תבנית פלסמיד המכיל את הזרועות הומולוגיה (משמשת, המוצגים באותיות זהב), ו- FP + מקשר רצף (ראה ירוק), היו electroporated. אחרי ארבעה ימים, התאים FP-חיוביות putatively נערך היו מועשרים FACS מורחבת כאוכלוסייה על ידי זריעה כל התאים ממוינים לבאר בודדת של צלחת 96-ובכן (~ 1,000 תאים) ואת מכן התרחבה בתרבות עד אוכלוסיה עבודה של כמה מיליונים יכול להיות לבדיקה תאים כמו "האוכלוסייה מועשר" (ראה פרוטוקול שלב 3.8). התשואה של תאים FP-חיוביות בהפרש של הניסוי עקב תעריפים משתנים של HDR12; העשרה מוצלחת בדרך כלל עשוי לכלול ~ 300-5,000 תאים לאחר תקנים של 1.6 x 106 תאים הירכיים. מחקרי הדמיה ראשוני אישר את האות ולוקליזציה של החלבון פיוז'ן באוכלוסייה מועשר. המושבות היו לבחור באופן ידני לתוך צלחת 96-ובכן הרחבה, הקפאה קריוגנית. עוד גנומית בקרת איכות ההקרנה באמצעות droplet דיגיטלי PCR (ddPCR), מבחני אחרים מבוססי ה-PCR שימש אז כדי לזהות כראוי הערוך שיבוטים, כמו שתואר לעיל12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58130/58130fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig3.jpg"> איור 3 . העשרה של אוכלוסיות הערוך putatively תא. (A) cytometry זרימה חלקות LMNB1 לערוך תאים ארבעה ימים שלאחר תרביות תאים. ציר ה-y מציגה GFP בעוצמה ומציגה ציר x פיזור קדימה. מיון השערים נקבעו בהתבסס על הפקד מאגר בלבד. מאז hiPSCs רגישים ההפרעות, חי/מת הכתם הושמט, שער FSC/האס מאוד שמרן שימש במקום. (B) לאחר העשרה, אוכלוסיית LMNB1 Cr1 לערוך תאים הראה ~ 90% של תאים עם GFP לוקליזציה על המעטפה גרעיני (לוקליזציה LMNB1 הצפוי). האוכלוסייה המוכלים בתאים שונים GFP, בעוצמות שונות, כמו גם כמה תאים GFP-שלילי. גודל ברים הם 10 מיקרון. (ג) אחרי קו המשובטים דור, תאים הראתה עוצמת GFP אחיד, עם כמה הבדלים התלויים של מחזור התא. סולם בר הוא 20 מיקרון.

Watch this Scientific Journal Video about Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9 at JoVE.com

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9 (Video) | JoVE

חלבון אנדוגני תיוג-אנוש המושרה בתאי גזע Pluripotent באמצעות CRISPR/Cas9

המתוארים כאן הוא פרוטוקול עבור תיוג endogenously לידי ביטוי חלבונים עם תגי פלורסנט בתאי גזע pluripotent המושרה האנושי באמצעות CRISPR/Cas9. תאים putatively הערוך מועשרים ידי קרינה פלואורסצנטית מופעל מיון תא, שורות תאים המשובטים נוצרים.

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format (Video) | JoVE

באמצעות טכניקה ג&#39;ל אלקטרופורזה פלורסנט PCR-נימי הגנוטיפ קריספר / Cas9 בתיווך נוק מוטאנטים בתוך פורמט תפוקה גבוהה

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells (Video) | JoVE

הבחירה תלויה עצמאית הדור של CRISPR / Cas9 בתיווך גין Knockouts בתאי יונקים

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus (Video) | JoVE

השתלת תא נבט הקדמוני עבור מבוססת על CRISPR/Cas9 וקפיצת המדרגה של צפרדע רפואית

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells (Video) | JoVE

מתודולוגיה סטנדרטי כדי לבדוק באתר המוטגניות כפונקציה של תיקון נקודת מוטציה על ידי CRISPR/Cas9 ו- SsODN בתאי אדם

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing (Video) | JoVE

Microinjection CRISPR/Cas9 החלבון לתוך ערוץ שפמנון, Ictalurus punctatus, העוברים עבור ג'ין עריכה

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy (Video) | JoVE

CRISPR/Cas9-מתווכת אינטגרציה יישוב In Vivo באמצעות אסטרטגיה מבוסס על הצטרפות סוף בתיווך הומולוגיה

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9 (Video) | JoVE

שיבוש גנטי יעילים ביותר מאתר ואנושי Hematopoietic ובתאים מאת CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins (Video) | JoVE

מהירה עם צינור נתיישב עבור יצירת מוטציות נקודה גנומית ב- C. elegans באמצעות CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum (Video) | JoVE

CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה כדי להפוך מותנה מוטציות של בני אדם טפיל המלריה falciparum פ

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells (Video) | JoVE

הדור של שינויים גנומית מוגדרים באמצעות CRISPR-CAS9 בתאי גזע האדם Pluripotent

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...