Name: endogenous protein tagging in human induced pluripotent stem cells using crispr/cas9
Uploaded: 2018-08-25T14:30:00
Duration: 14 min 48 s
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Ringraziamo Dambournet Daphne per molte discussioni penetranti e consigli sul gene editing, Thao per l'illustrazione, Angelique Nelson per la lettura critica del manoscritto e Andrew Tucker per la generazione della linea cellulare di lillo B1 mEGFP-etichetta. Vogliamo riconoscere le cellule staminali e Gene Editing e team di sviluppo di analisi presso l'Istituto di Allen per la scienza delle cellule per il loro contributo al processo di controllo qualità e gene editing. La linea WTC che abbiamo usato per creare la nostra linea di cella gene-modificato è offerta dal Bruce R. Conklin Laboratory presso gli istituti di Gladstone e UCSF. Ringraziamo l'Istituto Allen per il fondatore di scienza di cella, Paul G. Allen, per la sua visione, incoraggiamento e supporto.

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il metodo presentato qui per generare in modo endogeno regolato fusioni di proteina fluorescente in hiPSCs è un approccio versatile e potente per la generazione di linee cellulari di gene modificato con applicazioni che vanno dall'imaging cellule vive a vari studi funzionali e " modelli di malattia in un piatto"usando paziente-derivati hiPSC linee13,14,15. Mentre questo metodo è stato utilizzato per introdurre grandi FP tag a N - o C-terminale delle proteine endogene, potenzialmente potrebbe essere utilizzato per introdurre altri tag o piccoli cambiamenti genetici a modello o malattia-causanti corretta mutazioni22,23 . Per gli inserti più piccoli, la dimensione del braccio omologia può essere ridotta, ma l'approccio generale all'editing presentati in questo metodo si può ancora applicare24,25. Mentre l'uso di hiPSCs è fortemente incoraggiato per la loro utilità vasta, con attenta ottimizzazione, questo protocollo può essere adattato per modificare i genomi di altre linee cellulari di mammifero.
Quando si identifica un gene di interesse per il tagging di FP, stime di abbondanza di trascrizione (da microarray o RNA-Seq dati) è un buon punto di partenza per valutare se un gene o una isoforma di interesse è espresso, anche se i livelli della trascrizione non correla sempre con livelli della proteina. La strategia di FACS-arricchimento descritta qui funziona meglio per geni che sono espressi almeno moderatamente bene il tipo di cella di interesse. Questa strategia ha anche avuto successo nella selezione per le fusioni che mostrano modelli di localizzazione punctate e/o discreti come centrin, desmoplakina e paxillin dove il fondo rapporto segnale è molto basso12,19. Geni che non sono altamente espressi o sono espressi solo in tipi cellulari derivati possono richiedere strategie di selezione supplementari.
Il punto di partenza per crRNA e donatore disegni del plasmide di modello utilizzato nelle linee cellulari umane dovrebbe essere il genoma umano di riferimento (GRCh38). Perché i genomi di diverse linee cellulari possono variare all'interno della stessa specie, e poiché CRISPR/Cas9 è sequenza-specifici, è estremamente utile identificare varianti di linea specifico delle cellule (polimorfismi a singolo nucleotide o inserzioni/delezioni (indels)) che differiscono dal genoma di riferimento e incorporare questi nel design. Questo assicura che crRNAs sarà compatibile con il genoma ospite e che le braccia di omologia di donatore modello plasmide manterrà tutte le varianti specifiche linee cellulari. Una strategia suggerita è di incorporare omozigotiche varianti nelle braccia modello plasmide omologia crRNAs e donatore durante il processo di progettazione. Incorporando varianti eterozigotiche è facoltativo. I reagenti specifici utilizzati per esperimenti di knock-in grande e altre considerazioni chiave per questo protocollo sono discussi di seguito.
Proteina Cas9
Il vantaggio principale dell'utilizzo della proteina Cas9 è che introducendo il Cas9 e gRNA come un complesso RNP ha dimostrato di provocare una durata limitata di attività della nucleasi rispetto ad approcci basati su plasmide dove espressione del Cas9 e gRNA può continuare per giorni e condurre 26,ad una maggiore attività di on e off-target27. Un ulteriore vantaggio dell'utilizzo di proteine Cas9 è che è prontamente disponibile per fendere una volta all'interno delle cellule. Questo contrasta con i metodi più convenzionali dell'utilizzo Cas9 mRNA o Cas9/gRNA plasmide che richiedono la trascrizione, la traduzione e la proteina elaborazione26,28. Proteina S. pyogenes Cas9 wildtype è ora disponibile da molte fonti commerciali.
Guida di RNA
Ci sono molti strumenti disponibili pubblicamente per l'individuazione di obiettivi di crRNA vicino al sito di inserimento desiderato di FP che hanno zero o pochi predetto off-target negli host genoma29,30,31,32. Efficienze in HDR e la precisione del risultato HDR variano ampiamente tra gli obiettivi di crRNA utilizzati in un dato locus12. Per questo motivo, test diversi crRNAs (2-4 e preferibilmente all'interno di 50 bp al sito d'inserzione desiderata) al locus è raccomandato in quanto ciò può aumentare la probabilità di un esperimento riuscito di editing. Possibilità attuali per la consegna di gRNA includono sintetico 2-parte crRNA tracrRNA, gRNAs singolo sintetico (sgRNAs), e in vitro trascritto sgRNAs, o la consegna di un plasmide alle cellule che esprimono il sgRNA da un promotore di U6. Questo protocollo non è stato ottimizzato per attività di fenditura alta. Non modificato in 2 parti crRNA e tracrRNA (Vedi Tabella materiali) sono stati utilizzati con l'obiettivo di generare linee cellulari mono-allelica FP-etichetta mentre provocando la perturbazione meno potenziale per le cellule.
Donatore modello plasmide
Perché alcune dell'omologia braccio sequenza condizione nel donatore plasmide modello verrà incorporati nel genoma ospite durante l'evento HDR, le mutazioni di punto per i siti di riconoscimento di crRNA dovrebbe presentare per impedire ulteriore scissione di Cas9 seguito HDR. Spesso il cambiamento dirompente più semplice è di mutare la sequenza di PAM. Perché alcune sequenze di PAM non canonico possono essere ancora riconosciuti da wild-type S. pyogenes Cas9, è meglio evitare di usare NGG, NAG o NGA33. Quando si cambia il braccio di omologia, evitare mutazioni non-sinonimo e l'introduzione di codoni rari. Se un cambiamento sinonimo per la sequenza di PAM non è possibile, è consigliabile rendere tre mutazioni puntiformi sinonima della regione semi (10 bp prossimale a PAM) del sito di legame di crRNA. Dovrebbe prestare attenzione estrema quando si apportano queste modifiche nella 5ʹ regione non tradotta (UTR) poiché queste regioni possono contenere sequenze regolatrici importanti. Consultare un database di conservazione genetica come tracce di genomica comparativa del Browser genoma UCSC possono fornire una guida in questi casi, come modifiche alle basi non conservato possono essere tollerate più meglio che cambia a basi altamente conservato17. A volte il semplice inserimento della sequenza FP è sufficiente per danneggiare il sito di associazione di crRNA (come in Figura 1); Tuttavia, la sequenza appena aggiunta dovrebbe essere verificata per la persistenza dell'associazione crRNA e sequenze di PAM.
Aminoacido linker tra la FP e la proteina nativa si consiglia di conservare la funzione della proteina di fusione34. Spesso un linker dell'aminoacido può essere scelto per la sua particolare carica o dimensione. Se una fusione di cDNA con un design simile alla mirata endogena proteina di fusione è stato ben studiato, stessa sequenza del linker può essere utilizzato per la CRISPR/Cas9 knock-in esperimento12,19. Se tali informazioni non sono disponibile, un linker breve come GTSGGS inoltre è stato usato con successo12. Altri studi hanno dimostrato il successo con una sequenza del linker acido 3-ammino piccolo generico per una serie di obiettivi35.
Transfezione e arricchimento di FACS
Molti reagenti di transfezione disponibili in commercio sono formulati per la consegna di alcuni tipi di molecole alle cellule, mentre un sistema di elettroporazione può essere utilizzato per fornire reagenti con una vasta gamma di dimensioni, carica e composizione. Oltre ad essere un comune metodo di transfezione per duro transfect cellule come hiPSCs, elettroporazione porta anche il vantaggio di fornire tutti i tre componenti per CRISPR/Cas9-mediata FP knock-in, come descritto in questo metodo. L'elettroporazione è stato trovato per produrre i migliori risultati rispetto ad altri reagenti commercialmente disponibili durante lo sviluppo di questo metodo (dati non mostrati) e inoltre è stato utilizzato da altri utenti per RNP consegna26,28,36 .
Quando si utilizza questo protocollo per l'editing hiPSCs, si dovrebbe prestare particolare attenzione a garantire una gestione delicata delle cellule prima e dopo il processo per la sopravvivenza cellulare ottimale e minima differenziazione spontanea di editing di gene. In particolare, i metodi di arricchimento di FACS dovrebbero essere adattati per l'ordinamento di cellule staminali utilizzando l'ugello più grande possibile (130 µm), un basso tasso di flusso (≤24 µ l/min), conservanti guaina fluido (ad esempio soluzione fisiologica, Vedi Tabella materiali) e basso del campione pressione (10 psi). Invece di singola cella ordinamento, che si traduce nell'attuabilità suboptimale in cellule staminali, il hiPSCs FACS-arricchito vengono ordinati alla rinfusa e ampliato come una popolazione per ottimizzare l'integrità di cellula staminale e attuabilità delle cellule. Tuttavia, la singola cella ordinamento può essere appropriato per meno tipi cellulari sensibili. Per promuovere la sopravvivenza delle cellule, le cellule vengono restituite alla cultura non più di un'ora dopo la raccolta per l'arricchimento di FACS e conservate a temperatura ambiente durante il processo di ordinamento. Per alcuni tipi di cellule, la sopravvivenza delle cellule può essere migliorata anche incubando le cellule su ghiaccio (4° C) durante tutto il processo di ordinamento.
L'espansione della massa delle cellule positive-FP fornisce un'opportunità per valutare la popolazione dall'analisi di imaging per localizzazione della proteina di fusione prima di generare linee clonali. Mentre la popolazione arricchita risultante delle cellule può essere sufficiente per alcuni studi, queste popolazioni visualizzare frequentemente FP segnale di varia intensità. Le linee clonali isolate hanno segnale uniforme (Figura 3), che li rende più appropriato per gli esperimenti funzionali12.
Generazione di linea clonale delle cellule
Durante tutto il processo di generazione linea editing e clonale, è importante monitorare la morfologia delle cellule. hiPSC colonie coltivate in condizioni prive di alimentatore dovrebbero esibire i bordi regolari e un centro ben confezionato, anche12,18,19. Cellule differenziate dovrebbero essere osservate in meno del 5% della cultura. Quando la raccolta di diverse colonie, scegliere quelli che mostra la buona morfologia. Durante la piastra a 96 pozzetti passaggio eventi, controllare cloni per morfologia e sospendere quelli che hanno invaso come questo può condurre alla differenziazione o essere un'indicazione di instabilità genetica.
Generazione delle varietà di cellula clonale permette per conferma genetica di editing preciso, che è importante perché indotta da Cas9 doppio filo si rompe nel genoma sono spesso riparato impreciso nonostante incorporazione del tag al luogo desiderato. Analisi PCR-basata precedentemente descritte ha mostrato che cumulativamente attraverso dieci loci genomici unici molti (45%) dei cloni che esprimono FP sofferta dall'integrazione di spina dorsale di plasmide di donatore al luogo di destinazione o (raramente) in modo casuale nel genoma12. Inoltre, il 23% di GFP-positive cloni (n = 177) attraverso dieci loci unici sono stati trovati per harbor mutazioni presso o vicino al sito di taglio crRNA attesi nell'allele senza tag, probabilmente a causa di NHEJ12. Questa analisi genetica di molte linee clonali (~ 100 cloni/edit) sottolinea l'importanza della validazione genetica che non è possibile in una popolazione delle cellule poiché FP-espressione e localizzazione della proteina di fusione previsto da solo non garanzia di editing preciso12 . Inoltre, non è possibile eseguire queste analisi PCR-basata su una popolazione arricchita delle cellule con alcuna certezza, che giustificano la necessità per la generazione linea clonale prima analisi significativa possono essere completata. Conferma genetica del inserito tag FP e verifica dell'integrità genetica dell'allele inedito (in un clone modificato mono-allelica) sono entrambi necessari per assicurare il preciso editing presso il locus mirato oltre espressione contrassegno.
Un basso tasso di modifiche bi-allelica e mancanza di mutazioni fuori bersaglio (come dosati di Sanger e il sequenziamento dell'esoma) sono stati osservati per data utilizzando questo metodo (dati non pubblicati)12. Ciò è coerente con gli studi precedenti che descrivono l'uso di breve durata RNP per CRISPR/Cas9 esperimenti26,27. La mancanza di linee di cellule clonali con bi-allelica modifiche può anche essere locus specifico o a causa dell'incapacità della cellula di tollerare due etichettate copie di una proteina essenziale come suggerito da esperimenti precedentemente pubblicati dove sono stati presunte bi-allelica celle modificate osservate per un locus (LMNB1), ma non un altro (TUBA1B)12. Linee di Bi-allelic completamente convalidato clonale delle cellule sono state generate utilizzando questo metodo per tag ST6 beta-galactoside alfa-2, 6-sialiltrasferasi 1 (ST6GAL1) e RAB5A membro RAS oncogene (RAB5A) con mEGFP19.
Di là di confermare la precisione della modifica nel genoma, ci sono una varietà di test di controllo qualità che può essere utilizzato per ulteriori caratterizzano la linea clonale e identificare cloni che soddisfano tutte le cellule staminali, genomica, e criteri biologici delle cellule per utilizzano in futuro studi . Analisi biologiche e funzionale delle cellule possono essere utilizzate per confermare l'espressione appropriata, la localizzazione e funzione della proteina fusion12. Confronto all'inedito controllo genitori vi aiuterà a valutare l'influenza del processo di editing su localizzazione, la dinamica e la funzione. Altri saggi come crescita analisi e test per la stabilità genomica può anche aiutare a determinare se la proteina taggata è perturbante alla cella. Quando si utilizza hiPSC in questo protocollo, valutazione di marcatori di pluripotenza e potenziale di differenziazione può essere critico nel determinare un clone che è prezioso per a valle studia12. Perché estesa cultura della hiPSC ha dimostrato di portare a instabilità genetica, monitoraggio del tasso di crescita e cariotipo delle varietà di cellula clonale è anche importante12,37. Tuttavia, la finale destinato uso di celle modificate determinerà il livello e l'ampiezza di analisi di controllo di qualità e varia a seconda dell'applicazione.

L'uso di strategie di modifica del genoma, soprattutto CRISPR/Cas9, per studiare i processi cellulari sta diventando sempre più accessibile e preziosa1,2,3,4,5, 6 , 7. una delle tante applicazioni di CRISPR/Cas9 è l'introduzione (tramite riparazione omologia diretto (HDR)) di grandi sequenze esogeni come GFP in loci genomici specifici che poi servono come reporter per l'attività di un gene o una proteina prodotto8 . Questa tecnica può essere utilizzata per unire una sequenza della proteina fluorescente a un telaio di lettura aperto endogeno dove la proteina di fusione in modo endogeno regolamentato risultante può essere utilizzata per visualizzare la localizzazione subcellulare e la dinamica della proteina di interesse5 ,6,9,10,11. Mentre le proteine etichettate in modo endogeno offrono molti vantaggi rispetto ai sistemi di sovraespressione, inserimento di grandi sequenze nel genoma umano è un processo inefficiente in genere richiedono una selezione o una strategia di arricchimento per ottenere una popolazione di cellule che possono essere facilmente studiati5,12.
Questo protocollo descrive l'inserimento di una sequenza di DNA codifica per una proteina fluorescente (FP) in un locus genomico desiderato. Il protocollo comprende progettazione e consegna del plasmide di modello del donatore e il complesso ribonucleoproteico (RNP) (proteina wild-type S. pyogenes Cas9 combinata con sintetico CRISPR RNA (crRNA) e trans-attivazione crRNA (tracrRNA)). È anche descritto l'arricchimento delle celle putativamente modificate tramite celle attivate la fluorescenza che ordinano (FACS) e il processo di generazione di linea clonale delle cellule. Ad oggi, questo metodo è stato utilizzato per generare linee hiPSC con monoallelica o tag (raramente) bi-allelica proteina fluorescente verde (GFP) etichettatura venticinque proteine che rappresentano importanti strutture cellulari. Le celle modificate risultante da questi sforzi sono state confermate per avere l'inserimento genetico previsto, esprimono una proteina di fusione corretta localizzazione e mantenere la pluripotenza e un12 cariotipo stabile (e dati non pubblicati). Questo metodo è stato utilizzato anche per generare più altri single e dual (due differenti proteine contrassegnati nella stessa cella) modificato popolazioni di hiPSCs (dati non pubblicati).
IPSCs umane derivate da un donatore sano sono stati scelti per questi sforzi editing genomico perché, a differenza di molte linee cellulari convenzionali, sono diploidi, karyotypically stabile, non trasformate e proliferativa. Queste proprietà forniscono un modello interessante per lo studio della biologia delle cellule fondamentali e modellazione di malattia. Inoltre, il potenziale di differenziazione di hiPSCs offre l'opportunità di studiare di più stadi di sviluppo in parallelo attraverso le varie stirpi e tipi cellulari, utilizzando cellule isogeniche tra cui organoids, tessuti e modelli "malattia in un piatto"13 ,14,15. Mentre questo protocollo è stato sviluppato per hiPSCs (linea WTC), può essere informativa per lo sviluppo di protocolli usando altre linee cellulari di mammifero.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1169px;" width="1169">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Geneious R9</td>
			<td style="width:231px;">Biomatters, or similar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:515px;">bioinformatics software for in silico donor plasmid design</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">TE Buffer pH 8.0</td>
			<td style="width:231px;">IDT, or similar</td>
			<td style="width:119px;">11-01-02-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:305px;">HERAcell VIOS 160i CO2 incubator, or similar</td>
			<td style="width:231px;">ThermoFisher Scientific, or similar</td>
			<td style="width:119px;">51030408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">Pipettes (1000 &#181;L, 200 &#181;L, 20 &#181;L, 10 &#181;L, 2 &#181;L)</td>
			<td style="width:231px;">Rainin, or similar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Pipette tips (1000 &#181;L, 200 &#181;L, 20 &#181;L)</td>
			<td style="width:231px;">Rainin, or similar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Multi-channel Pipette (200 &#181;L)</td>
			<td style="width:231px;">Rainin, or similar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Serological pipetes (25 mL, 10 mL, 5 mL)</td>
			<td style="width:231px;">Costar, or similar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">BRAND 8-Channel Manifold for Quiksip, Autoclavable</td>
			<td style="width:231px;">Millipore Sigma, or similar</td>
			<td style="width:119px;">BR704526-1EA</td>
			<td style="width:515px;">use with non-filtered pipet tips, such as Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10, below</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10</td>
			<td style="width:231px;">Thermo Fisher, or similar</td>
			<td style="width:119px;">3501-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">XP2 Pipette Controller</td>
			<td style="width:231px;">Drummond, or similar</td>
			<td style="width:119px;">4-000-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Disposable Pasteur Pipets</td>
			<td style="width:231px;">VWR, or similar</td>
			<td style="width:119px;">53300-567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet</td>
			<td style="width:231px;">CELLGARD, or similar</td>
			<td style="width:119px;">NU-481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced</td>
			<td style="width:231px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">354230</td>
			<td style="width:515px;">lot tested before use with hiPSC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">DMEM/F12 (-phenol red)</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11039-021</td>
			<td>cold, for diluting Matrigel 1:30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">mTeSR1 Complete Media</td>
			<td style="width:231px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">85850</td>
			<td>recommended growth media for WTC hiPSC line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">WTC hiPSC line</td>
			<td style="width:231px;">Coriell</td>
			<td style="width:119px;">GM25256</td>
			<td>the hiPSC line used in this protocol is available through Coriell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Tissue culture dish 100 mm</td>
			<td style="width:231px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">6-well Cell Culture Plate</td>
			<td style="width:231px;">CELLSTAR</td>
			<td style="width:119px;">657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">StemPro Accutase</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">A11105-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">15 mL polystyrene conical</td>
			<td style="width:231px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">62.554.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Y-27632 (ROCK Inhibitor)</td>
			<td style="width:231px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">72308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic crRNA, unmodified (custom sequence)</td>
			<td style="width:231px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">Custom0247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA</td>
			<td style="width:231px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">U-002005-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">Recombinant wild-type Streptococcus pyogenes Cas9-NLS purified protein, 40 &#181;M</td>
			<td style="width:231px;">University of California-Berkeley QB3 Macrolab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">Custom donor plasmid (PriorityGENE)</td>
			<td style="width:231px;">Genewiz</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:515px;">donor insert design was synthesized and cloned into pUC57 backbone by Genewiz</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">DNA LoBind Tube 1.5 mL</td>
			<td style="width:231px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">NucleoBond Xtra Maxi EF</td>
			<td style="width:231px;">Clontech</td>
			<td style="width:119px;">740424.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Neon Transfetion System</td>
			<td style="width:231px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Neon Transfection System, 100 &#181;L kit</td>
			<td style="width:231px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MPK10096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">5 mL Polystyrene Round-bottom Tube with Cell Strainer Cap</td>
			<td style="width:231px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">15 mL High Clarity Polyproylene Conical Tube</td>
			<td style="width:231px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">FACSAriaIII Fusion</td>
			<td style="width:231px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">656700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">FACSDiva software</td>
			<td style="width:231px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">FlowJo version 10.2</td>
			<td style="width:231px;">TreeStar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">NERL Blood Bank Saline</td>
			<td style="width:231px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">8504</td>
			<td>used as preservative-free FACS Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Olympus SZX7 Stereo Microscope, or similar</td>
			<td style="width:231px;">Olympus, or similar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Tissue culture plate, 96-well</td>
			<td style="width:231px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">96 well Cell Culture Plate, V-Bottom</td>
			<td style="width:231px;">CELLSTAR</td>
			<td style="width:119px;">351180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">CryoStor CS10</td>
			<td style="width:231px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C2874-100ML</td>
			<td>used as cryopreservation buffer for cells in 96-well plate format</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Parafilm</td>
			<td style="width:231px;">Bemis</td>
			<td style="width:119px;">PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">24 well Cell Culture Plate</td>
			<td style="width:231px;">CELLSTAR</td>
			<td style="width:119px;">662160</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

endogenous protein tagging in human induced pluripotent stem cells using crispr/cas9

Un protocollo è presentato per la generazione di cellule staminali umane pluripotenti indotte (hiPSCs) che proteine endogene express fuse per tag fluorescente N - o C-terminale in-struttura. Il sistema CRISPR/Cas9 procariotico (cluster regolarmente interspaziato corto palindromo 9 ripetizioni/CRISPR-associati) può essere utilizzato per introdurre grandi sequenze esogeni in loci genomici tramite riparazione omologia diretto (HDR). Per ottenere il desiderato knock-in, questo protocollo impiega la ribonucleoproteina (RNP)-dove la proteina wild type Streptococcus pyogenes Cas9, guida sintetica 2 RNA (gRNA) e un plasmide di modello del donatore vengono consegnati alle cellule tramite l'approccio basato sul elettroporazione. Putativamente modificate cellule che esprimono le proteine fluorescente contrassegnate sono arricchite da celle attivate la fluorescenza che ordinano (FACS). Linee clonali sono poi generati e possono essere analizzati per i risultati di editing precisi. Introducendo il tag fluorescente del locus genomico del gene di interesse, la localizzazione subcellulare risultante e la dinamica della proteina di fusione può essere studiato sotto controllo regolamentare endogena, un miglioramento fondamentale rispetto convenzionale sovraespressione sistemi. L'uso di hiPSCs come sistema modello per il gene tagging offre l'opportunità di studiare le proteine etichettate in cellule diploidi, non trasformate. Dal momento che hiPSCs può essere differenziato in più tipi di cellule, questo approccio offre l'opportunità di creare e studiare le proteine etichettate in una varietà di contesti cellulari isogeniche.

L'obiettivo di questo esperimento era di fondere mEGFP (monomerico avanzata GFP) alla proteina nucleare Lilo B1 introducendo la sequenza di mEGFP fino alla fine di 5ʹ del gene LMNB1 (N-terminale della proteina). Un linker (sequenza dell'amminoacido SGLRSRAQAS) è stato scelto basata su precedenti costrutti di cDNA dal Michael Davidson proteina fluorescente collezione21. Perché la regione di associazione crRNA nel plasmide modello donatore per ogni candidato crRNA è stato interrotto dopo l'inserimento in silico di mEGFP e la sequenza del linker, nessuna mutazione di punto doveva essere fatto interferire con potenziali crRNA riconoscimento e scissione di Cas9 della sequenza dei donatori (Figura 1). La sequenza di donatore conteneva armi di omologia di 1 kb che fiancheggiano entrambe le estremità della sequenza mEGFP-linker. La risultante 2.734 bp di DNA è stato clonato in una spina dorsale pUC57, sequenza verificato, e il plasmide di modello donatore risultante è stato purificato mediante un'endotossina-libero maxi prep. Il donatore modello plasmide e RNP complesso transfected, putativamente modificato le cellule sono state arricchite e la localizzazione della proteina di fusione B1 Lilo mEGFP-nucleare è stata confermata da microscopia di fluorescenza (Figura 2). Solo risultati dalla transfezione di crRNA1 sono descritti qui, anche se entrambe le sequenze di crRNA prodotto popolazioni putativamente modificato12.
Rispetto al controllo negativo, che non conteneva nessun gRNA, Cas9 proteina o plasmide di modello donatore nella reazione elettroporazione (solo buffer), il crRNA1 LMNB1 transfettate le cellule contenute 0,95% cellule di mEGFP-positive che rappresentano il putativamente modificato mEGFP-nucleare Liuzzi B1 popolazione (Figura 3a). Questo risultato è stato all'interno della gamma di knock-in efficienza osservata attraverso molti loci genomici utilizzando questo metodo, come precedentemente segnalato12.
Le cellule mEGFP-positive sono sono isolate da FACS e ripreso da microscopia diretta per confermare la localizzazione prevista della proteina di fusione B1 mEGFP-nucleare LILO alla busta nucleare. Dopo FACS-arricchimento, circa il 90% delle cellule ordinate dalla popolazione crRNA1 LMNB1 erano mEGFP-positivi (come determinato da microscopia), suggerendo che alcune cellule mEGFP-negativi co-purificati con le cellule GFP-positive durante la procedura di ordinamento. Questo era un livello accettabile di arricchimento che ha permesso per la raccolta di 96 cloni che potrebbe allora essere geneticamente selezionati per l'editing di successo. Generalmente, un cut-off per l'arricchimento di successo è del 50% positivo GFP.
La maggior parte della popolazione cellulare ordinato visualizzato fluorescenza la busta nucleare (periferia nucleare) in cellule nondividing e a un'estesa lamina nucleare all'interno del citoplasma durante fiducia fornendo mitosi nella corretta genomico modifica presso il LMNB1 locus. La popolazione arricchita ha contenuto le cellule con segnale luminoso o dim. Questa differenza nell'intensità del segnale può riflettere una combinazione di corrette ed errate modifica i risultati e mette in evidenza l'utilità di generare una linea clonale geneticamente convalidata per ulteriori studi (vedi discussione) (Figura 3b)12. Dopo la generazione di linea clonale, geneticamente convalidato cellule hanno mostrato intensità uniforme di GFP in esperimenti di microscopia (Figura 3C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig1.jpg"> Figura 1 . Progettare una strategia per il tagging di GFP N-terminale del gene LMNB1. Il tag GFP è stato progettato per 5ʹ di inserimento N-terminale del primo esone di LMNB1 localizzato sul cromosoma 5. Omologia sia 5ʹ che 3ʹ le braccia sono 1 kb ciascuno e si incontrano tra il codone di inizio (ATG) e il secondo codone (armi di omologia solo parzialmente rappresentati in figura). Due candidati crRNAs sono stati progettati per guidare Cas9 fendere come vicino al sito di inserimento previsto come possibile, pur essendo unico nel genoma. Sequenza per mEGFP e un linker dell'amminoacido sono stati inseriti solo 3ʹ del codone di inizio (sequenza mEGFP e il linker non in scala). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58130/58130fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig2.jpg"> Figura 2 . Flusso di lavoro per la produzione in modo endogeno con tag linee clonali hiPSC. Componenti di transfezione, tra cui il complesso RNP Cas9/crRNA/tracrRNA (mostrato in rosso Cas9 proteina con crRNA oro e viola tracrRNA), contenente le braccia di omologia (HAs, mostrato in oro), il plasmide del modello donatore e FP + sequenza del linker (mostrato in verde), sono stati individulamente. Dopo 4 giorni, le cellule FP-positive putativamente modificata erano arricchite da FACS e ampliate come una popolazione di tutte le celle ordinate semina in un singolo pozzetto di una piastra a 96 pozzetti (~ 1.000 cellule) e quindi espanse in coltura fino a una popolazione lavorativa di diversi milioni di euro cellule potrebbero essere analizzate come la popolazione"arricchita" (Vedi protocollo punto 3.8). Il rendimento delle cellule positive-FP differisce da esperimento a causa di tassi variabili di HDR12; un arricchimento di successo in genere può includere ~ 300-5.000 cells fianchi dopo trasfezione di circa 1.6 x 106 . Studi preliminari di formazione immagine ha confermato il segnale e la localizzazione della proteina di fusione nella popolazione arricchita. Colonie sono state vendemmiate manualmente in una piastra a 96 pozzetti per espansione e crioconservazione. Ulteriormente lo screening genomico di controllo di qualità usando gocciolina digitali altri dosaggi basati sulla PCR e PCR (ddPCR) fu usato per identificare correttamente modificati cloni, come descritto in precedenza12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58130/58130fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig3.jpg"> Figura 3 . Arricchimento delle popolazioni delle cellule putativamente modificato. (A) flusso cytometry trame del LMNB1 modificato post-transfezione quattro giorni di cellule. L'asse y Visualizza intensità GFP e l'asse x Visualizza forward scatter. Ordinamento cancelli erano impostate in base il controllo solo buffer. Dal momento che hiPSCs sono sensibili alla perturbazione, live/dead macchia è stato omesso e un cancello molto conservatrice di FSC/SSC è stato usato invece. (B) dopo arricchimento, la popolazione di LMNB1 Cr1 modificato cellule hanno mostrato ~ 90% delle cellule con GFP localizzazione alla busta nucleare (previsto LMNB1 localizzazione). La popolazione conteneva cellule di diversa intensità GFP, nonché alcune cellule GFP-negative. Barre della scala sono 10 micron. (C) dopo la generazione di linea clonale, le cellule hanno mostrato un intensità GFP uniforme, con alcune differenze dipendente dal ciclo cellulare. Barra della scala è di 20 micron.

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Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Proteina endogena Tagging in umani hanno indotto le cellule staminali pluripotenti utilizzando CRISPR/Cas9

Descritto qui è un protocollo per l'etichettatura in modo endogeno espresse proteine con tag fluorescente in cellule staminali pluripotenti indotte umane utilizzando CRISPR/Cas9. Celle putativamente modificate sono arricchite da ordinamento di attivate la fluorescenza delle cellule e linee clonali della cellula vengono generate.

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Usando una tecnica fluorescente PCR-capillare elettroforesi su gel al genotipo CRISPR / Cas9 mediata Knockout Mutants in un formato high-throughput

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Ricerca

Genetica

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Selezione-dipendente e generazione indipendente di CRISPR / Cas9-mediata Gene Knockouts nelle cellule di mammiferi

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

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Trapianto di cellule germinali primordiali per basati su CRISPR/Cas9 rincorsa in Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

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The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

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Integrazione mirata CRISPR/Cas9-mediata In Vivo usando una strategia basata su unendo fine omologia-mediata

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Rottura del Gene altamente efficiente di cellule progenitrici ematopoietiche Murine ed umane di CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

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Un veloce e Facile Pipeline per generazione di mutanti di punto Genomic in c. elegans utilizzando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteine

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CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

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