Name: endogenous protein tagging in human induced pluripotent stem cells using crispr/cas9
Uploaded: 2018-08-25T14:30:00
Duration: 14 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9 at JoVE.com

Agradecemos a Daphne Dambournet para muitas discussões perspicazes e conselhos sobre gene edição, Thao fazer para ilustração, Angelique Nelson para leitura crítica do manuscrito e Andrew Tucker para gerar a linha de celular jesuina B1 mEGFP-tag. Queremos reconhecer as células-tronco e Gene Editing e equipes de desenvolvimento de ensaio do Instituto Allen para a ciência da célula por suas contribuições para o processo de controle de qualidade e edição de gene. A linha WTC que usamos para criar nossa linha celular gene-edição foi fornecida pelo Bruce R. Conklin Laboratory no Gladstone institutos e UCSF. Agradecemos o Instituto Allen para o fundador da ciência da célula, Paul G. Allen, para sua visão, encorajamento e apoio.

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Os autores não têm nada para divulgar.

O método apresentado aqui para gerar endogenamente regulada fusões de proteína fluorescente em hiPSCs é uma abordagem versátil e poderosa para gerar linhas de células de gene editado com aplicações que vão desde imagens de células vivas para vários estudos funcionais e " modelos de doenças em um prato"usando linhas de paciente-derivado hiPSC13,14,15. Enquanto este método tem sido usado para introduzir grandes etiquetas FP para N - ou C-terminal de proteínas endógenas, potencialmente poderia ser usado para apresentar outras marcas ou pequenas alterações genéticas modelo ou correto doença-causando mutações22,23 . Para inserções menores, o tamanho do braço homologia pode ser reduzido, mas a abordagem geral da edição apresentada neste método ainda pode aplicar24,25. Enquanto o uso de hiPSCs é fortemente incentivado por sua vasta utilidade, com otimização do cuidado, este protocolo pode ser adaptado para editar os genomas de outras linhas de células de mamíferos.
Ao identificar um gene de interesse para marcação de FP, estimativas de abundância de transcrição (a partir de dados de RNA-Seq ou microarray) é um bom ponto de partida para avaliar se um gene ou a isoforma de interesse é expresso, embora os níveis de transcrição não sempre se correlacionam com níveis de proteína. A estratégia de FACS-enriquecimento descrita aqui irá funcionar melhor para genes que são expressos pelo menos moderadamente bem no tipo de célula de interesse. Esta estratégia também foi bem sucedida na seleção para fusões que apresentam padrões de localização punctate e/ou discretos como centrin, desmoplakin e paxillin onde o sinal à relação de fundo é muito baixo12,19. Genes que não são altamente expressas ou só são expressos em tipos de células derivadas podem exigir estratégias de seleção adicionais.
O ponto de partida para crRNA e doador projetos de plasmídeo de modelo utilizado em linhas de células humanas deve ser o genoma humano de referência (GRCh38). Porque os genomas de linhagens celulares diferentes podem variar dentro da mesma espécie, e porque CRISPR/Cas9 é específico da sequência, é extremamente útil identificar variantes de linha específica de célula (polimorfismos de nucleotídeo único ou inserções/exclusões (puntuais)) que diferem do genoma de referência e incorporar estas no projeto. Isso garante que o crRNAs será compatível com o genoma do hospedeiro e que as armas de homologia doador modelo plasmídeo irão reter quaisquer variantes específicas de linha celular. Uma estratégia sugerida é incorporar homozigotos variantes crRNAs e doador de armas de homologia de plasmídeo modelo durante o processo de design. Incorporando as variantes heterozigotas é opcional. Os reagentes específicos utilizados para grandes batida-em experimentos e outras considerações-chave para este protocolo são discutidas abaixo.
Proteína Cas9
O principal benefício do uso de proteína Cas9 é que introduzindo o Cas9 e gRNA como um complexo de RNP foi mostrado para resultar em uma duração limitada de actividade nuclease em comparação com abordagens baseadas em plasmídeo onde a expressão do Cas9 e gRNA pode continuar por dias e levar a maior em-fora-alvo e atividade26,27. Um benefício adicional do uso de proteína Cas9 é que está prontamente disponível para clivar uma vez dentro das células. Isto contrasta com métodos mais convencionais de usando Cas9 mRNA ou Cas9/gRNA plasmídeo que necessitam de transcrição, tradução e processamento de26,28. Sua proteína de S. pyogenes Cas9 agora está disponível de várias fontes comerciais.
Guia do RNA
Existem muitas ferramentas disponíveis publicamente para encontrar alvos de crRNA perto do local de inserção de FP desejado que têm zero ou alguns previstos fora-alvos no genoma do hospedeiro29,30,31,32. Eficiência em HDR e a precisão do resultado HDR varia amplamente entre alvos de crRNA usados em um determinado locus12. Por esta razão, testando vários crRNAs (2-4 e de preferência dentro de 50 bp do local de inserção desejada) por locus é recomendada, pois isto pode aumentar a probabilidade de uma experiência bem sucedida de edição. Possibilidades atuais para a entrega de gRNA incluem sintético 2-parte crRNA tracrRNA, gRNAs única sintética (sgRNAs), e em vitro transcrito sgRNAs, ou entregar um plasmídeo para células expressando o sgRNA de um promotor de U6. Este protocolo não foi otimizado para atividade de decote alto. Não modificado 2-parte crRNA e tracrRNA (ver Tabela de materiais) foram usados com o objetivo de gerar linhas de células mono-alélico FP-etiquetado enquanto causando a perturbação menos potencial para as células.
Dador modelo plasmídeo
Porque alguns da homologia braço sequência desde o dador plasmídeo modelo será incorporado o genoma do hospedeiro durante o evento HDR, mutações pontuais para os sites de reconhecimento de crRNA devem ser introduzidas para evitar a segmentação por Cas9 seguindo HDR. Muitas vezes a mais simples mudança disruptiva é transformar a sequência de PAM que. Porque algumas sequências não-canônicos do PAM ainda podem ser reconhecidas pelo tipo selvagem Cas9 S. pyogenes , é melhor evitar o uso NGG, nascimento ou NGA33. Quando o braço de homologia a sofrer uma mutação, evite mutações não-sinónimas e a introdução de códons raros. Se uma mudança de sinônimo para a sequência de PAM não for possível, considere fazer três mutações sinónimas de ponto na região da semente (10 bp proximal à PAM) do sítio de ligação do crRNA. Extremo cuidado deve ser tomado ao fazer essas alterações na região untranslated 5ʹ (UTR), desde que estas regiões podem conter sequências reguladoras importantes. Consultar um banco de dados de conservação genética tais como faixas de genómica comparativa do UCSC Genome Browser podem fornecer orientação, nestes casos, como alterações em bases não-conservada podem ser melhor toleradas do que muda para bases altamente conservadas17. Às vezes, a simples inserção da sequência FP é suficiente para perturbar o sítio de ligação do crRNA (como na Figura 1); no entanto, a sequência recém-anexado deve ser verificada para a persistência da ligação crRNA e sequências de PAM.
Aminoácido linkers entre o FP e a proteína nativa são recomendados para conservar a função da proteína de fusão34. Muitas vezes um vinculador de aminoácido pode ser escolhido para a sua carga em particular ou o tamanho. Se uma fusão de cDNA com um design semelhante do alvo endógena proteína de fusão tem sido bem estudada, que mesmo vinculador de sequência pode ser usada para o TOC-no experimento CRISPR/Cas912,19. Se essa informação não estiver disponível, um vinculador curto como GTSGGS também tem sido usado com sucesso12. Outros estudos têm demonstrado sucesso com uma sequência de genérico vinculador de ácido 3-amino pequeno para uma variedade de alvos35.
Transfection e enriquecimento de FACS
Muitos reagentes de transfecção disponíveis comercialmente são formulados para a entrega de certos tipos de moléculas de células, Considerando que um sistema de eletroporação pode ser usado para entregar os reagentes com uma ampla gama de tamanho, carga e composição. Além de ser um método comum de Transfeccao para células difícil-para-transfect, como hiPSCs, electroporation também traz o benefício de entregar todos os três componentes para bater-em FP CRISPR/Cas9-mediada conforme descrito neste método. Electroporation foi encontrado para produzir os melhores resultados quando comparado com outros reagentes comercialmente disponíveis ao desenvolver esse método (dados não mostrados) e também tem sido usado por outros para RNP entrega26,28,36 .
Quando usando esse protocolo para edição hiPSCs, especial deve ter cuidado para garantir suave manipulação das células antes e após o processo para a sobrevivência da célula ideal e mínima diferenciação espontânea de edição gene. Em particular, os métodos de enriquecimento de FACS devem ser adaptados para classificação de células-tronco, usando o bico maior possível (130 µm), uma baixa taxa de fluxo (≤24 µ l/min), fluido de bainha de conservantes (como soro fisiológico, consulte Tabela de materiais) e amostra de baixa pressão (10 psi). Em vez de célula única classificação, que resulta em qualidade inferior viabilidade em células-tronco, os hiPSCs FACS-enriquecido são classificados em massa e expandiu-se como uma população para otimizar a integridade de viabilidade e células-tronco de células. No entanto, a única célula classificação pode ser apropriado para menos tipos de células sensíveis. Para promover a sobrevivência celular, células retornou a cultura não é mais do que uma hora depois da colheita para o enriquecimento de FACS e mantidas à temperatura ambiente durante todo o processo de classificação. Para alguns tipos de células, a sobrevivência da pilha também pode ser melhorada por células de incubação no gelo (4° C) durante todo o processo de classificação.
A expansão em massa de células FP-positivo fornece uma oportunidade para avaliar a população por análise de imagem para localização da proteína de fusão antes de gerar linhas clonais. Enquanto a população enriquecida resultante de células pode ser suficiente para alguns estudos, estas populações frequentemente exibem sinal FP de intensidade variável. As linhas clonais isoladas têm sinal uniforme (Figura 3), tornando-os mais adequados para experimentos funcionais12.
Geração de linha celular clonal
Durante o processo de geração clonal e edição linha, é importante controlar a morfologia celular. hiPSC colônias crescidas em condições de livre de alimentador devem exibir bordas lisas e um centro bem embalado, mesmo12,18,19. Células diferenciadas devem ser observadas em menos de 5% da cultura. Ao escolher colónias individuais, escolha aqueles que morfologia boa exposição. Durante a placa de 96 poços, passagem de eventos, verifique clones para morfologia e descontinuar os que têm crescido, pois isso pode levar a diferenciação ou ser uma indicação de instabilidade genética.
Permite a geração de linhas de células clonais para confirmação genética da edição precisa, que é importante porque induzida por Cas9 dupla vertente quebra no genoma são muitas vezes reparados imprecisa apesar de incorporação da marca para o local desejado. Ensaios de PCR-based descritos anteriormente mostraram que cumulativamente através de dez únicas genomic loci muitos (45%) dos clones FP-expressando sofria de integração de espinha dorsal de plasmídeo de doador para o locus alvo ou (raramente) aleatoriamente no genoma12. Além disso, 23% de GFP-positivo clones (n = 177) através de dez únicos loci foram encontrados para abrigar mutações no ou perto do local de corte antecipado crRNA no alelo não marcado, provavelmente devido a NHEJ12. Esta análise genética de muitas linhas clonais (~ 100 clones/editar) destacou a importância da validação genética que não é possível em uma população celular desde que FP-expressão e localização da proteína de fusão esperada sozinho não garante a edição precisa12 . Além disso, estes ensaios baseados em PCR não podem ser executados em uma população enriquecida de células com alguma certeza, justificando a necessidade de geração clonal linha antes análise significativa pode ser concluída. Confirmação genética da marca FP inserida e verificação da integridade genética do alelo inédito (em um clone de mono-alélico editado) são necessárias para uma edição precisa no locus alvo além da expressão marca.
Uma baixa taxa de edições bi-alélica e falta de mutações fora do alvo (como analisado por Sanger e sequenciamento exome) foram observados para data usando este método (dados não publicados)12. Isto é consistente com estudos anteriores descrevendo o uso da RNP de curta duração para CRISPR/Cas9 experimentos26,27. A falta de linhas de células clonais com edições bi-alélica também pode ser o locus específico ou devido à incapacidade da célula de tolerar dois marcados cópias de uma proteína essencial como sugerido de experimentos publicados anteriormente onde eram células editadas bi-alélico putativos observado para um locus (LMNB1), mas não outro (TUBA1B)12. Linha celular clonal totalmente validado bi-alélico foi gerada usando esse método para marca ST6 beta-galactoside alfa-2, 6-1 sialyltransferase (ST6GAL1) e membro RAB5A família de oncogene RAS (RAB5A) com mEGFP19.
Além de confirmar a precisão do Editar no genoma, há uma variedade de ensaios de controle de qualidade que pode ser usado para mais caracterizar a linha clonal e identificar clones que cumprir todas as células-tronco, genoma, e critérios biológicos de celular para usam em futuros estudos . Ensaios biológicos e funcionais de celular podem ser usados para confirmar a expressão adequada, localização e função das proteínas fusão12. A comparação com os controles parentais não editadas ajudará a avaliar a influência do processo de edição na localização, dinâmica e função. Outros ensaios tais como análise de crescimento e ensaios de estabilidade genômica podem também ajudar a determinam se a proteína etiquetada é perturbadora para a célula. Ao usar o hiPSC no presente protocolo, avaliação de marcadores de pluripotência e potencial de diferenciação pode ser crítica na determinação de um clone que é valioso para a jusante estuda12. Porque estendeu a cultura de hiPSC foi mostrado para provocar instabilidade genética, a taxa de crescimento de monitoramento e cariótipo de linha celular clonal é também importante12,,37. No entanto, a final se destina uso das células editados irá determinar o nível e a amplitude de análise de controle de qualidade e irá variar com base na aplicação.

O uso de estratégias de edição de genoma, especialmente CRISPR/Cas9, para estudar processos celulares está se tornando cada vez mais acessível e valioso1,2,3,4,5, 6 , 7. uma das muitas aplicações de CRISPR/Cas9 é a introdução (através de reparação de homologia dirigida (HDR)) de grandes sequências exógenas como GFP em específico loci genômicos que então serve como repórteres para a atividade de um gene ou a proteína produto8 . Esta técnica pode ser usada para associar uma sequência da proteína fluorescente a um frame de leitura aberto endógeno onde a proteína de fusão endogenamente regulada a resultante pode ser usada para visualizar a Localização subcellular e a dinâmica da proteína de interesse5 ,6,9,10,11. Enquanto proteínas endogenamente etiquetadas oferecem muitos benefícios em comparação com sistemas de superexpressão, inserindo grandes sequências do genoma humano é um processo ineficiente, normalmente exigindo uma seleção ou estratégia de enriquecimento para obter uma população de células que podem ser facilmente estudados5,12.
Este protocolo descreve a inserção de uma sequência de DNA, a codificação de uma proteína fluorescente (FP) em um locus genômico desejado. O protocolo inclui design e entrega de plasmídeo de modelo o doador e o ribonucleoprotein (RNP) complexo (proteína selvagem tipo S. pyogenes Cas9 combinada com sintético CRISPR RNA (crRNA) e ativando o trans crRNA (tracrRNA)). Também descrito é o enriquecimento das células presumidamente editados via celular de fluorescência ativada (FACS) de classificação e o processo de geração de linha celular clonal. Até à data, este método tem sido usado para gerar linhas de hiPSC com monoallelic ou etiquetas (raramente) bi-alélico proteína verde fluorescente (GFP) rotulagem 25 proteínas representando as principais estruturas celulares. As células editadas resultantes destes esforços foram confirmadas para ter a inserção genética esperada, expressar uma proteína de fusão localização corretamente e manter pluripotência e um cariótipo estável12 (e dados não publicados). Esse método também tem sido usado para gerar vários outros single e dual (duas proteínas diferentes, marcadas na mesma célula) edição de populações de hiPSCs (dados não publicados).
IPSCs humanas derivadas de um doador saudável foram escolhidos para estes esforços de genoma-edição porque, ao contrário de muitas linhas de celulares convencionais, são diploides, dos estável, não-transformadas e proliferativa. Essas propriedades fornecem um modelo atraente para estudar Biologia celular fundamentais e modelagem de doença. Além disso, o potencial de diferenciação de hiPSCs fornece a oportunidade de estudar vários estádios de desenvolvimento em paralelo em várias linhagens e tipos de célula usando células isogénicas, incluindo organoids, tecidos e modelos de "doença em um prato"13 de14, ,15. Enquanto este protocolo foi desenvolvido para hiPSCs (linha do WTC), pode ser informativo para o desenvolvimento de protocolos utilizando outras linhas de células de mamíferos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1169px;" width="1169">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Geneious R9</td>
			<td style="width:231px;">Biomatters, or similar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:515px;">bioinformatics software for in silico donor plasmid design</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">TE Buffer pH 8.0</td>
			<td style="width:231px;">IDT, or similar</td>
			<td style="width:119px;">11-01-02-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:305px;">HERAcell VIOS 160i CO2 incubator, or similar</td>
			<td style="width:231px;">ThermoFisher Scientific, or similar</td>
			<td style="width:119px;">51030408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">Pipettes (1000 &#181;L, 200 &#181;L, 20 &#181;L, 10 &#181;L, 2 &#181;L)</td>
			<td style="width:231px;">Rainin, or similar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Pipette tips (1000 &#181;L, 200 &#181;L, 20 &#181;L)</td>
			<td style="width:231px;">Rainin, or similar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Multi-channel Pipette (200 &#181;L)</td>
			<td style="width:231px;">Rainin, or similar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Serological pipetes (25 mL, 10 mL, 5 mL)</td>
			<td style="width:231px;">Costar, or similar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">BRAND 8-Channel Manifold for Quiksip, Autoclavable</td>
			<td style="width:231px;">Millipore Sigma, or similar</td>
			<td style="width:119px;">BR704526-1EA</td>
			<td style="width:515px;">use with non-filtered pipet tips, such as Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10, below</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10</td>
			<td style="width:231px;">Thermo Fisher, or similar</td>
			<td style="width:119px;">3501-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">XP2 Pipette Controller</td>
			<td style="width:231px;">Drummond, or similar</td>
			<td style="width:119px;">4-000-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Disposable Pasteur Pipets</td>
			<td style="width:231px;">VWR, or similar</td>
			<td style="width:119px;">53300-567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet</td>
			<td style="width:231px;">CELLGARD, or similar</td>
			<td style="width:119px;">NU-481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced</td>
			<td style="width:231px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">354230</td>
			<td style="width:515px;">lot tested before use with hiPSC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">DMEM/F12 (-phenol red)</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11039-021</td>
			<td>cold, for diluting Matrigel 1:30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">mTeSR1 Complete Media</td>
			<td style="width:231px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">85850</td>
			<td>recommended growth media for WTC hiPSC line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">WTC hiPSC line</td>
			<td style="width:231px;">Coriell</td>
			<td style="width:119px;">GM25256</td>
			<td>the hiPSC line used in this protocol is available through Coriell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Tissue culture dish 100 mm</td>
			<td style="width:231px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">6-well Cell Culture Plate</td>
			<td style="width:231px;">CELLSTAR</td>
			<td style="width:119px;">657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">StemPro Accutase</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">A11105-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">15 mL polystyrene conical</td>
			<td style="width:231px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">62.554.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Y-27632 (ROCK Inhibitor)</td>
			<td style="width:231px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">72308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic crRNA, unmodified (custom sequence)</td>
			<td style="width:231px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">Custom0247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA</td>
			<td style="width:231px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">U-002005-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">Recombinant wild-type Streptococcus pyogenes Cas9-NLS purified protein, 40 &#181;M</td>
			<td style="width:231px;">University of California-Berkeley QB3 Macrolab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">Custom donor plasmid (PriorityGENE)</td>
			<td style="width:231px;">Genewiz</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:515px;">donor insert design was synthesized and cloned into pUC57 backbone by Genewiz</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">DNA LoBind Tube 1.5 mL</td>
			<td style="width:231px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">NucleoBond Xtra Maxi EF</td>
			<td style="width:231px;">Clontech</td>
			<td style="width:119px;">740424.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Neon Transfetion System</td>
			<td style="width:231px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Neon Transfection System, 100 &#181;L kit</td>
			<td style="width:231px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MPK10096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">5 mL Polystyrene Round-bottom Tube with Cell Strainer Cap</td>
			<td style="width:231px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">15 mL High Clarity Polyproylene Conical Tube</td>
			<td style="width:231px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">FACSAriaIII Fusion</td>
			<td style="width:231px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">656700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">FACSDiva software</td>
			<td style="width:231px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">FlowJo version 10.2</td>
			<td style="width:231px;">TreeStar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">NERL Blood Bank Saline</td>
			<td style="width:231px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">8504</td>
			<td>used as preservative-free FACS Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Olympus SZX7 Stereo Microscope, or similar</td>
			<td style="width:231px;">Olympus, or similar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Tissue culture plate, 96-well</td>
			<td style="width:231px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">96 well Cell Culture Plate, V-Bottom</td>
			<td style="width:231px;">CELLSTAR</td>
			<td style="width:119px;">351180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">CryoStor CS10</td>
			<td style="width:231px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C2874-100ML</td>
			<td>used as cryopreservation buffer for cells in 96-well plate format</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Parafilm</td>
			<td style="width:231px;">Bemis</td>
			<td style="width:119px;">PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">24 well Cell Culture Plate</td>
			<td style="width:231px;">CELLSTAR</td>
			<td style="width:119px;">662160</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

endogenous protein tagging in human induced pluripotent stem cells using crispr/cas9

Um protocolo é apresentado para a geração de células-tronco pluripotentes induzidas humana (hiPSCs) que expressam endógenas proteínas fundidas para etiquetas fluorescentes N - ou C-terminal em-frame. O sistema CRISPR/Cas9 procariótico (regularmente intercalado curto clusterizado palíndromo 9 repetições/CRISPR-associado) pode ser usado para introduzir grandes sequências exógenas em Genômica loci através de reparação homologia dirigida (HDR). Para alcançar o desejado bater-em, este protocolo emprega o ribonucleoprotein (RNP)-onde selvagem tipo Streptococcus pyogenes Cas9 proteína, sintético-parte 2 guia RNA (gRNA) e um plasmídeo de modelo do doador são entregues para as células através de abordagem baseada na eletroporação. Presumidamente editadas celulas que expressam as proteínas fluorescente etiquetadas são enriquecidas pela célula de fluorescência ativada classificação (FACS). Clonais linhas então são geradas e podem ser analisadas para resultados precisos de edição. Introduzindo a tag fluorescente no locus genômico do gene de interesse, a Localização subcellular resultante e a dinâmica da proteína de fusão pode ser estudada sob controlo regulamentar endógeno, uma melhoria fundamental sobre superexpressão convencional sistemas. O uso de hiPSCs como um sistema modelo para gene tagging oferece a oportunidade de estudar as proteínas etiquetadas em células diploides, nontransformed. Desde que o hiPSCs pode ser diferenciada em vários tipos de células, essa abordagem oferece a oportunidade de criar e estudar proteínas etiquetadas em uma variedade de contextos isogénicas de celulares.

O objetivo deste experimento foi fundir mEGFP (GFP reforçada monomérico) à proteína nuclear de B1 lamina introduzindo a sequência de mEGFP para o fim de 5ʹ do gene LMNB1 (N-terminal da proteína). Um vinculador (sequência de aminoácidos SGLRSRAQAS) foi escolhido com base no anterior construções de cDNA da coleção de proteína fluorescente Michael Davidson21. Porque a região de ligação crRNA em plasmídeo de modelo o doador para crRNA cada candidato foi interrompida após a inserção no silico de mEGFP e a sequência de vinculador, sem mutações de ponto foi necessária para interromper o potencial crRNA de reconhecimento e clivagem pela Cas9 da sequência de doador (Figura 1). A sequência de doador continha armas de homologia de 1KB flanqueando a ambas as extremidades da sequência mEGFP-linker. O resultante 2.734 bp de DNA foi clonado em um backbone de pUC57, sequência verificada, e o plasmídeo de modelo doador resultante foi purificado usando um livre de endotoxinas maxi prep. O plasmídeo de modelo do doador e o complexo RNP foram transfectadas, presumidamente editadas células foram enriquecidas e a localização da proteína de fusão nuclear-mEGFP lamina B1 foi confirmada por microscopia de fluorescência (Figura 2). Apenas os resultados do transfection crRNA1 são descritos aqui, embora ambas as sequências de crRNA produziram populações presumidamente editado12.
Quando comparado com o controle negativo, que continha sem gRNA, proteína Cas9 ou plasmídeo de modelo doador na reação de eletroporação (reserva apenas), o crRNA1 LMNB1 transfectadas células continham células de mEGFP-positivo de 0,95% representando o presumidamente editado população de B1 lamina mEGFP-nuclear (Figura 3a). Este resultado foi dentro do intervalo de batida-em eficiência observada através de muitos loci genômicos usando este método, como relatado anteriormente,12.
As células mEGFP-positivo foram isoladas por FACS e fotografadas por microscopia ao vivo para confirmar a localização esperada da proteína de fusão de B1 lamina mEGFP nucleares para o envelope nuclear. Após o enriquecimento de FACS, aproximadamente 90% das células classificadas da população crRNA1 LMNB1 foram mEGFP-positivo (conforme determinado pela microscopia), sugerindo que algumas células de mEGFP-negativo co purificadas com as células GFP-positivo durante o procedimento de classificação. Isto foi um nível aceitável de enriquecimento que permitiu para a colheita de 96 clones que poderia então ser geneticamente selecionados para edição de sucesso. Geralmente, um recorte para o enriquecimento de sucesso é de 50% positivo GFP.
A maioria da população classificada celular exibida fluorescência para o envelope nuclear (nuclear periferia) nas células nondividing e para uma lâmina nuclear estendida no citoplasma durante a confiança fornecendo mitose na correcta genômica editar ao LMNB1 Locus. A população enriquecida continha células com sinal luminosa ou fraca. Esta diferença de intensidade de sinal pode refletir uma combinação de correto e incorreto, resultados e destaques a utilidade de gerar uma linha clonal geneticamente validada para mais estudos (ver discussão) de edição (Figura 3b)12. Após a geração de linha clonal, validado geneticamente células mostrou intensidade uniforme de GFP em experimentos de microscopia (Figura 3C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig1.jpg"> Figura 1 . Desenha estratégia para marcação de GFP N-terminal do gene LMNB1. A tag GFP foi projetada para 5ʹ de inserção do N-terminal do primeiro exon de LMNB1 localizado no cromossoma 5. Homologia tanto 5ʹ e 3ʹ de armas são 1 kb cada encontro entre o códon de início (ATG) e o segundo codão (braços de homologia apenas parcialmente representados na figura). Dois candidatos crRNAs foram projetados para guiar Cas9 para trilhar o mais próximo do local de inserção pretendido quanto possível, enquanto ainda está sendo exclusivo no genoma. Sequência de mEGFP e um aminoácido vinculador foram inseridas apenas 3ʹ do códon de início (sequência de mEGFP e o vinculador não está à escala). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58130/58130fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig2.jpg"> Figura 2 . Fluxo de trabalho para produzir endogenamente marcou linhas clonal hiPSC. Componentes de transfeccao, incluindo o complexo RNP Cas9/crRNA/tracrRNA (mostrado em vermelho Cas9 proteína com crRNA de ouro e púrpura tracrRNA), o plasmídeo de modelo de doadores contendo os braços de homologia (HAs, mostrados em ouro) e FP + sequência de vinculador (mostrado em verde), foram electroporated. Após 4 dias, as células de FP-positivo presumidamente editada foram enriquecidas pela FACS e expandiu-se como uma população semeando todas as células classificadas em um único poço de uma placa de 96 poços (~ 1.000 células) e depois expandidas em cultura até uma população activa de vários milhões células podem ser analisadas como "população enriquecida" (ver protocolo passo 3.8). O rendimento das células FP-positivo difere pelo experimento devido a taxas variáveis de HDR12; um enriquecimento sucesso tipicamente pode incluir ~ 300-5.000 células após a transfeccao de aproximadamente 1,6 x 106 quadris. Estudos de imagiologia preliminares confirmaram o sinal e a localização da proteína de fusão na população enriquecida. Colônias foram escolhidas manualmente em uma placa de 96 poços para expansão e criopreservação. Mais seleção genômica de controle de qualidade usando gotículas digital PCR (ddPCR) e outros ensaios baseados em PCR foram utilizadas para identificar corretamente editados clones, como descrito anteriormente,12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58130/58130fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig3.jpg"> Figura 3 . Enriquecimento de populações de células presumidamente editado. (A) parcelas de citometria de fluxo da LMNB1 edição do transfection pós de quatro dias de células. O eixo y mostra a intensidade GFP e eixo x apresenta dispersão para a frente. Classificação portões foram definidas com baseadas no controle somente reserva. Desde que hiPSCs são sensíveis à perturbação, vivo/morto mancha foi omitida e um portão muito conservadora do FSC/SSC foi usado em vez disso. (B) após o enriquecimento, a população de Cr1 LMNB1 edição células mostrou ~ 90% de células com GFP localizando no envelope nuclear (esperado LMNB1 localização). A população continha células de intensidade variável de GFP, bem como algumas células GFP-negativo. Barras de escala são 10 mícrons. (C) após a geração de linha clonal, células mostraram uma intensidade uniforme de GFP, com algumas diferenças dependentes do ciclo celular. Barra de escala é 20 mícrons.

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Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9 (Video) | JoVE

Proteína endógena de marcação em humanos induzida por células-tronco pluripotentes usando CRISPR/Cas9

Aqui descrito é um protocolo para marcação endogenamente expressas proteínas com etiquetas fluorescentes em células-tronco pluripotentes induzidas humana usando CRISPR/Cas9. Células presumidamente editadas são enriquecidas por fluorescência ativada celular classificação e linhas celulares clonal são geradas.

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format (Video) | JoVE

Usando uma técnica de PCR fluorescente-capilar Electroforese em Gel de genótipo CRISPR / cas9 mediada KO mutantes em um formato de elevado rendimento

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Genética

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells (Video) | JoVE

Geração independente dependente da seleção e de genes independentes de CRISPR / Cas9 em células de mamíferos

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus (Video) | JoVE

Transplante de células de germes primordial para baseado em CRISPR/Cas9 saltos em Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells (Video) | JoVE

Uma metodologia padrão para examinar a mutagenicidade no local como uma função de ponto de mutação reparação catalisada por CRISPR/Cas9 e SsODN em células humanas

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing (Video) | JoVE

Microinjeção de proteína CRISPR/Cas9 em bagre do canal, Ictalurus punctatus, embriões para Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy (Video) | JoVE

Integração de alvo CRISPR/Cas9-mediada na Vivo usando uma estratégia de baseada em juntar-se mediada por homologia final

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9 (Video) | JoVE

Disrupção do Gene altamente eficiente de células progenitoras hematopoiéticas murino e humano por CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins (Video) | JoVE

Uma rápida e superficial Pipeline para gerar Genomic ponto mutantes em c. elegans usando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum (Video) | JoVE

CRISPR/Cas9 Gene edição para fazer condicional mutantes de humano parasita da malária por p. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells (Video) | JoVE

Geração de modificações genómicas definidas usando CRISPR-CAS9 em células-tronco pluripotentes humanas

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...