Name: sa-&#946;-galactosidase-based screening assay for the identification of senotherapeutic drugs
Uploaded: 2019-06-28T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about SA-ÃŽÂ²-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة المنح AG043376 (المشروع 2 والأساسية A، PDR; المشروع 1 وCore B, LJN) and AG056278 (Project 3 and Core A, PDR; and Project 2, LJN) وa grant from the Glen Foundation (LJN).

تمت الموافقة على استخدام الحيوانات من قبل لجنة سكريبس فلوريدا المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها.
1. توليد الأورام الليفية الجنينية (MEF) - 12-15 يوما
<ol><li>عزل النوع البري وErcc1-/- MEFs من الفئران الإناث الحوامل في اليوم الجنيني 13 (E13) كما هو موضح سابقا33. مل...

SA-β-Gal هو علامة حيوية محددة جيدا للوسن الخلوي ة التي اكتشفها في الأصل ديميري وآخرون. (1995) تبين أن الخلايا الليفية البشرية المعطرة قد زادت من نشاط SA-β-Gal عند اختبارها في درجة الحموضة 623 مقارنة بالخلايا المتكاثرة. وفي الوقت نفسه، في المختبر وفي الجسم الحي اتسياسي لSA-β-غال وقد أ?...

وصفت الحساسية الخلوية للمرة الأولى من قبل ليونارد هايفليك وبول مورهيد، الذي أظهر أن الخلايا الطبيعية لديها قدرة محدودة على الانتشار في الثقافة1. الخلايا السينسنتة تفشل في الانتشار على الرغم من وجود المواد الغذائية, عوامل النمو وعدم وجود تثبيط الاتصال, ولكن لا تزال نشطة التمثيل الغذائي2. وتعرف هذه الظاهرة باسم الحساسية المستنسخة ويعزى أساسا إلى تقصير التيلومير، على الأقل في الخلايا البشرية3. وقد أظهرت دراسات أخرى أن الخلايا يمكن أيضا أن تدفع إلى الخضوع للتخفيف استجابة لمحفزات أخرى، مثل الإجهاد الأنيكونوجيني (الأنكوجينية الناجمة عن الحساسية، OIS)، تلف الحمض النووي، والأدوية السامة للخلايا، أو التشعيع (الإجهاد الناجم عن الحساسية، SIS)4 , 5 , 6.ردا على تلف الحمض النووي، بما في ذلك تآكل التيلومير، والخلايا إما senesce، بدء نمو الخلايا غير المنضبط، أو الخضوع لالمبرمج إذا كان الضرر لا يمكن إصلاحه. في هذه الحالة ، يبدو أن الحساسية الخلوية مفيدة لأنها تعمل بطريقة قمعية للورم2. في المقابل، يتم زيادة الحساسية مع الشيخوخة بسبب تراكم الضرر الخلوي بما في ذلك تلف الحمض النووي. منذ الخلايا senescent يمكن أن تفرز السيتوكينات، metalloproteinases وعوامل النمو، ودعا النمط الظاهري الذي يرتبط بالحساسية (SASP)، وهذه الزيادة المعتمدة على العمر في الحساسية الخلوية وSASP يساهم في انخفاض الأنسجة التوازن و الشيخوخة في وقت لاحق. أيضا، ومن المعروف أن هذه الزيادة التي تعتمد على العمر في عبء الحساسية للحث على الأمراض الأيضية، وحساسية الإجهاد، ومتلازمات البروجريا، وضعف الشفاء7،8، وهو، في جزء منه، المسؤول عن العديد من العمر ذات الصلة الأمراض، مثل تصلب الشرايين، هشاشة العظام، انحطاط العضلات، تشكيل قرحة، ومرض الزهايمر9،10،11،12،13. القضاء على الخلايا المعمرة يمكن أن تساعد على منع أو تأخير خلل في الأنسجة وتمديد healthspan14. وقد تبين ذلك في نماذج الماوس المعدلة وراثيا14،15،16 وكذلك باستخدام الأدوية وتركيبات المخدرات التي تم اكتشافها من خلال كل من جهود فحص المخدرات وتحليل المعلوماتية الحيوية مسارات المستحثة على وجه التحديد في الخلايا السينسنت17،18،19،20،21،22. تحديد الأدوية العلاجية السيزوية المثلى، قادرة على الحد بشكل أكثر فعالية من عبء الخلايا المعمرة، هو خطوة هامة تالية في تطوير النهج العلاجية للشيخوخة الصحية.
تظهر الخلايا السينسية السمات الفينوتية والجزيئية المميزة، سواء في الثقافة أو في الجسم الحي. يمكن أن تكون علامات الحساسية هذه إما السبب أو نتيجة للتحريض الحساسية أو منتج ثانوي للتغيرات الجزيئية في هذه الخلايا. ومع ذلك، لم يتم العثور على علامة واحدة على وجه التحديد في الخلايا المعمرة. حاليا، المرتبطة بالحساسية β-galactosidase (SA-β-Gal) الكشف هو واحد من أفضل الأساليب ذات طابع وأنشئت على أساس خلية واحدة لقياس الحساسية في المختبر وفي الجسم الحي. SA-β-Gal هو هيدرولاس ليسوسومال مع النشاط الأنزيمي الأمثل في درجة الحموضة 4. قياس نشاطها في درجة الحموضة 6 ممكن لأن الخلايا المعمرة تظهر زيادة النشاط الليسوسومال23،24. بالنسبة للخلايا الحية ، يتم الحصول على زيادة درجة الحموضة اللايسومال عن طريق القلوية الليسوسومال مع مثبطات الفراغات H+-ATPase مثبطات بافيلوميسين A1 أو مثبطات التحمض الاندوسيومال الكلوروكين25،26. 5-Dodecanoylaminofluoressin Di-β-D-galactopyranoside (C12FDG) يستخدم كالركيزة في الخلايا الحية كما أنه يحتفظ المنتج المخطوف في الخلايا بسبب 12 الكربون lipophilic moiety25. الأهم من ذلك، لا يرتبط نشاط SA-β-Gal نفسه مباشرة مع أي مسار محدد في الخلايا المعمرة وليس من الضروري للحث على الحساسية. مع هذا الفحص، يمكن تحديد الخلايا المعمرة حتى في مجموعات الخلايا غير المتجانسة والأنسجة القديمة، مثل الخزعات الجلدية من الأفراد الأكبر سنا. كما تم استخدامه لإظهار وجود علاقة بين الحساسية الخلية والشيخوخة23 كما هو علامة موثوق بها للكشف عن الخلايا senescent في العديد من الكائنات والظروف27،28،29، 30. هنا، يتم وصف اختبار فحص SA-β-Gal عالي الإنتاجية استنادًا إلى الركيزة الفلورية C12FDG باستخدام الخلايا الليفية الجنينية الأولية للماوس (MEFs) مع شدة الأكسدة الناجمة عن الإجهاد والحساسية ومزاياه وعيوبه يتم مناقشتها. على الرغم من أن هذا الفحص يمكن أن يتم مع أنواع الخلايا المختلفة، واستخدام Ercc1نقص، وإصلاح الحمض النووي ضعف MEFs يسمح لتحريض أسرع من الحساسية في ظل ظروف الإجهاد التأكسدي. في الفئران، وانخفاض التعبير عن إصلاح الحمض النووي endonuclease ERCC1-XPF يسبب ضعف إصلاح الحمض النووي، والتراكم المتسارع لتلف الحمض النووي المحلي، وارتفاع ROS، الخلل الميتوكوندريا، وزيادة عبء الخلايا المعمرة، وفقدان وظيفة الخلايا الجذعية و الشيخوخة المبكرة، على غرار الشيخوخة الطبيعية31،32. وبالمثل، Ercc1-نقصMEFs الخضوع للسرعة أكبر في الثقافة17. ومن السمات الهامة لـ "الـ MEF" المناوئ ة أن كل بئر لديها خليط من الخلايا المعمرة وغير السينية، مما يسمح بإظهار واضح للآثار الخاصة بالخلايا. ومع ذلك، على الرغم من أننا نعتقد أن استخدام الإجهاد التأكسدي في الخلايا الأولية للحث على الحساسية هو أكثر فيزيولوجيا، وهذا الفحص يمكن أيضا أن تستخدم مع خطوط الخلايا حيث يتم حث الحساسية مع العوامل الضارة الحمض النووي مثل etoposide أو التشعيع.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:928px;" width="928">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">DMEM&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Corning</td>
			<td style="width:344px;">10-013-CV</td>
			<td style="width:167px;">medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ham&#39;s F10</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12390-035</td>
			<td style="width:167px;">medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">fetal bovine serum</td>
			<td>Tissue Culture Biologics</td>
			<td>101</td>
			<td style="width:167px;">serum</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1x non-essential amino acids</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-025-Cl</td>
			<td style="width:167px;">amino-acids</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">bafilomycin A1&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B1793</td>
			<td style="width:167px;">lysosomal inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">C12FDG</td>
			<td>Setareh Biotech</td>
			<td>7188</td>
			<td style="width:167px;">b-Gal substrate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hoechst 33342&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H1399</td>
			<td style="width:167px;">DNA intercalation agent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">17DMAG</td>
			<td>Selleck Chemical LLC</td>
			<td>50843</td>
			<td style="width:167px;">HSP90 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">InCell6000 Cell Imaging System</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">High Content Imaging System</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sa-&#946;-galactosidase-based screening assay for the identification of senotherapeutic drugs

الحساسية الخلية هي واحدة من السمات المميزة للشيخوخة المعروفة للتأثير سلبا على عمر صحي. الأدوية القادرة على قتل الخلايا المعمرة على وجه التحديد في ثقافة الخلايا، وتسمى senolytics، يمكن أن تقلل من عبء الخلايا المعمرة في الجسم الحي وتوسيع healthspan. وقد تم تحديد فئات متعددة من senolytics حتى الآن بما في ذلك مثبطات HSP90، مثبطات الأسرة BCL-2، piperlongumine، الببتيد مثبطة FOXO4 ومزيج من Dasatinib / Quercetin. الكشف عن SA-β-Gal في زيادة درجة الحموضة الليسوسومال هي واحدة من أفضل علامات تتميز للكشف عن الخلايا المعمرة. قياسات الخلايا الحية من senescence المرتبطة β-galactosidase (SA-β-Gal) النشاط باستخدام الركيزة الفلورسنت C12FDG في تركيبة مع تحديد رقم الخلية الإجمالي باستخدام الحمض النووي intercalating صبغ Hoechst يفتح إمكانية فحص الأدوية السيكوائية التي إما تقلل من النشاط الكلي SA-β-Gal عن طريق قتل الخلايا السينسنية (senolytics) أو عن طريق قمع SA-β-Gal وغيرها من الأنماط الظاهرية للخلايا السينسية (senomorphics). استخدام منصة عالية المحتوى الفلورسنت الحصول على الصور وتحليل يسمح لفحص سريع وعالية الإنتاجية من مكتبات المخدرات للآثار على SA-β-غال، مورفولوجيا الخلية ورقم الخلية.

يمكن الكشف عن نشاط SA-β-Gal في الخلايا التي يتم حثها على senesce بطرق مختلفة من الإرهاق التكراري، والإجهاد السمية الجينية والأكسدة، لتنشيط oncogene23،25،38. في النموذج الحالي باستخدام Ercc1-نقصالخلايا الليفية الجنينية الماوس، وظ...

Watch this Scientific Journal Video about SA-ÃŽÂ²-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs at JoVE.com

SA-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

الحساسية الخلوية هي العامل الرئيسي في تطوير الأمراض المزمنة المرتبطة بالعمر. تحديد العلاجات التي تستهدف الخلايا المعمرة تظهر الوعد لتمديد الشيخوخة الصحية. هنا، نقدم اختبار جديد لفحص لتحديد senotherapeutics على أساس قياس الحساسية المرتبطة بيتا-Galactosidase النشاط في خلايا واحدة.

SA-β-Galactosidase القائم على فحص الفحص لتحديد الأدوية Senotherapeutic

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

نحن نصف هنا لأول مرة طريقة تسمح عالية الإنتاجية فحص المخدرات للمركبات senotherapeutic التي ثبت أن تكون مفيدة في الأمراض المرتبطة بالشيخوخة. في الواقع، العديد من التجارب السريرية مع الأدوية اختبار في هذا الجوهر جارية حاليا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي التمييز بين نوعين من العقاقير senotherapeutic ، senolytics وsenomorphics ، باستخدام الكشف الراسخ من SA - بيتا غالاكتوسيداسي في الخلايا السنسنت.هذه التقنية هي أداة فحص هامة للمركبات الرواية senotherapeutic. في الواقع، يتم عرض العديد من المركبات التي تم تحديدها بمساعدة هذه الشاشة في منشورات مختلفة رفيعة المستوى، وهي حاليا في التجارب السريرية. هذه التقنية متعددة للغاية ، ويمكن تكييفها مع العديد من الشاشات عالية الإنتاجية.في الواقع ، من الممكن أن شاشات متعددة ، وشاشة للمركبات التي تقمع الشيخوخة عن طريق تنشيط أو تثبيط واحد من عدة مسارات. اِنقط كل جنين إلى قطعة ملليمتر واحد وأنبوبه صعودا وهبوطا عدة مرات. بعد ذلك، أضف 10 ملليلترات من متوسط النمو إلى أنسجة كل جنين.لوحة لهم في طبق ثقافة 10 سنتيمترا، واحتضان في 37 درجة مئوية في 3٪ الأكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة يومين إلى ثلاثة أيام. واحتضان بقية كل جنين مع 0.25٪ تريبسين EDTA خليط لمدة 10 دقائق. لتجبيب الخلايا، أولاً، إزالة بعناية متوسط النمو وغسل الخلايا مع 10 ملليلتر من 1X PBS مرتين.ثم، إضافة ملليلترين من 025 تريبسين EDTA حل للخلايا، واحتضان لهم في 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق. بعد ذلك، قم بفحص الخلايا تحت المجهر للتأكد من فصل الخلايا عن السطح. إضافة نفس المبلغ من متوسطة النمو لإنهاء عملية الهضم التربسين، ونقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي.ثم، الطرد المركزي الخلايا في 200 مرة G لمدة ثلاث دقائق. تجاهل المناط، وإضافة متوسطة نمو جديدة لإعادة تعليق الخلايا. بعد ذلك، عد الخلايا وبذرتها في لوحات جديدة في كثافة الخلايا المتوقعة.بالنسبة إلى التفاضل الفرعي غير الشيخوخة، أولاً، تقسيم الخلايا المتقاربة بنسبة واحد إلى أربعة. ثم احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في 3٪ الأكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لتمديد لممر آخر. بعد ذلك ، للحث على خنائن الخلايا ، انقسمت البذور الخلايا الالتقاء من مرور واحد بنسبة واحد إلى أربعة وتحتضنها عند 37 درجة مئوية في 20 ٪ من الأكسجين و 5 ٪ بيئة ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاثة أيام.لمراقبة senescence الخلوية ، مع نظام متقدم Coulter خلية العداد ، وقياس الزيادة التدريجية في قطر الخلية وحجم الخلية خلال كل خطوة تريبسينية. لبدء اختبار فحص بيتا غال، بذور 5، 000 الخلايا السنسنت أو 3،000 الخلايا غير senescent في بئر في 96 لوحات جيدا. ثم، إضافة 100 ميكرولتردات من متوسطة النمو لكل بئر واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 20٪ من الأكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ست ساعات.بعد ذلك، إضافة تخفيف المخدرات إلى خلايا MEF واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في 20٪ من الأكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 إلى 48 ساعة. بعد الحضانة، وإزالة محلول الدواء وغسل الخلايا مع 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني 1X. للحث على القلويات، قبل علاج الخلايا مع 90 ميكرولترات من محلول bafilomycin A1، المخفف في المتوسطة ثقافة الخلايا الطازجة بتركيز نهائي من 100 نانوموللار.ثم، احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في 20٪ من الأكسجين و 5٪ بيئة ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة. لتحليل الفلوريسنس من النشاط SA-بيتا غال، وجعل حل عمل جديد من C12FDG المخفف في متوسط النمو، في تركيز نهائي من 100 micromolar. ثم، إضافة 10 ميكرولترات من حل العمل إلى المتوسطة الثقافة في تركيز نهائي من 10 ميكرومولار، واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في 20٪ الأكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعتين.غسل الخلايا مع 100 ميكرولترات من 1X PBS. بعد ذلك، أضف اثنين من ميكرولتر من 100 ميكروغرام لكل ملليلتر هويشست 33342 صبغة في تركيز نهائي من اثنين من ميكروغرام لكل ملليلتر. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية، 20٪ الأكسجين، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 20 دقيقة.بعد الحضانة، وإزالة وسائل الإعلام، إضافة 100 ميكرولترات من متوسطة النمو الطازجة، والمضي قدما في التصوير. في هذه الدراسة، سمحت منصة اقتناء وتحليل الصور الفلورية عالية المحتوى لتحديد الأدوية senolytic، مثل 17-DMAG، التي خفضت الأنشطة العامة SA-beta-Gal في ثقافات الخلايا الليفية الجنينية المورينية التي تحتوي على خلايا شيخوخة في مرور خمسة. التحليلات الكمية التي تولدها البرمجيات من خليط من الخلايا السنسنت وغير senescent تسمح لتدليل واضح من الآثار الخلية senescent محددة، والقضاء على خلفية بيتا galactosidase النشاط من قبل bafilomycin A.تأكد من تضمين جميع الضوابط اللازمة للخلايا، وخاصة الخلايا الحساسة غير المعالجة والخلايا senescent تعامل مع سيطرة إيجابية.يتضمن هذا المقال العمل مع الخلايا الأولية تحت الأكسدة، والتي يمكن أن تؤدي إلى الاختلاف التي تحتاج إلى مراقبة. هذا الإجراء هو الخطوة الأولى في الكشف عن العقاقير senotherapeutic. تحتاج إلى تنفيذ قابلية الخلية للحياة الإضافية والمقالات الحساسة لتأكيد نتائج الفحص.وقد تم الكشف عن العديد من الأدوية senolytic جديدة باستخدام هذا المقال، بما في ذلك أول مزيج المخدرات senolytic dasatinib quercetin، الحرارة صدمة البروتين 90 مثبطات، مثبطات الأسرة Bcl-2، وفيسيتين البوليفينول.

Research

JoVE Journal

Biology

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

تحديد وتحليل الأسلاف محمر ماوس باستخدام CD71/TER119 التدفق cytometric الفحص

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

مضان-المجهري الفحص والجيل القادم التسلسل الجيني: أدوات مفيدة لتحديد الجينات المسؤولة عن النزاهة العضيم

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

والفحص الفحص نيون لتحديد المغيرون من القنوات GIRK

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

تحديد التعديلات بعد متعدية من النباتات بروتين المجمعات

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

RNA محفز كمراسلة لفحص الحمض النووي الريبي أدوية ضد التحرير في المثقبيات

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

الإنتاجية العالية للكشف عن المغيرون الكيميائية من الجينات المشاركة ما بعد transcriptionally الخاضعة للرقابة

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

تحديد أزواج كيناز الركيزة عن طريق فحص إنتاجية عالية


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

مناعي لونين الفحص لتحديد نبات الأرابيدوبسيس التفاعلات-DNA البروتين<em&gt; في فيفو</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

تحديد المنظمين رواية نتح النبات من خلال فحص التصوير الحراري على نطاق واسع في Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

في الموقع التهجين لسيبونكولوس nudus Coelomic السائل

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. ...