Name: sa-&#946;-galactosidase-based screening assay for the identification of senotherapeutic drugs
Uploaded: 2019-06-28T14:30:00
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这项工作得到了NIH赠款AG043376(项目2和核心A,PDR;PDR;以及PDR;项目2和核心A;项目2;项目A;项目2;项目A;项目2;项目A;项目2;项目A;项目2;项目A;项目2;项目A;项目2;项目项目1和核心B、LJN和AG056278(项目3和核心A、PDR;项目2,LJN)和格伦基金会(LJN)的赠款。

动物使用得到了斯克里普斯佛罗里达机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 生成衰老鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) = 12-15 天
<ol><li>在胚胎期13日(E13)从怀孕的雌性小鼠中分离野生型和Ercc1-/-MEFs,如前33所述。 注:以下所有步骤均在无菌条件下使用无菌仪器在组织培养罩中执行。</li>
	<li>切除眼睛上方的胚胎头。</li>
	<li>取出红色组织(心脏和肝脏),必要...

SA-β-Gal 是一种定义良好的细胞衰老生物标志物,最初由 Dimri等人发现。(1995) 表明,与增殖细胞相比,在pH 623测定时,衰老的人类成纤维细胞增加了SA-β-Gal的活性。同时,为不同细胞类型和组织建立了SA-β-Gal的体外和体内测定25、39、40。该协议中描述的基于荧光的单细胞方法测量活细胞中的SA-β-Gal,是影响细胞<...

伦纳德·海夫利克和保罗·摩尔黑德首次描述了细胞衰老,他们表明正常细胞在培养中增殖的能力有限。尽管存在营养物质、生长因子和缺乏接触抑制,衰老细胞仍不能增殖,但仍然具有代谢活性2。这种现象被称为复制性衰老,主要归因于端粒缩短,至少在人类细胞3。进一步的研究表明,细胞也可以诱导进行衰老,以回应其他刺激,如致癌应激(致癌基因诱导衰老,OIS),DNA损伤,细胞毒性药物,或辐照(应力诱发衰老,SIS)4,5,6.为了应对DNA损伤,包括端粒侵蚀,细胞要么衰老,开始不受控制的细胞生长,或者在损伤无法修复时发生凋亡。在这种情况下,细胞衰老似乎是有益的,因为它以肿瘤抑制方式2。相反,由于细胞损伤的积累(包括DNA损伤),衰老会随着衰老而增加。由于衰老细胞可以分泌细胞因子、金属蛋白酶和生长因子,称为衰老相关分泌表型(SASP),这种年龄依赖性增加的细胞衰老和SASP有助于减少组织平衡和随后老化。此外,这种年龄依赖增加的衰老负担已知诱发代谢性疾病,压力敏感性,前列腺综合征,和受损的愈合7,8,并在一定程度上,负责与年龄相关的众多疾病,如动脉粥样硬化,骨关节炎,肌肉退化,溃疡形成,和阿尔茨海默氏病9,10,11,12,13。消除衰老细胞可以帮助预防或延缓组织功能障碍,延长健康范围14。这已经在转基因小鼠模型14,15,16以及通过使用溶血药物和药物组合,发现通过药物筛选努力和生物信息分析在衰老细胞17、18、19、20、21、22中专门诱导的通路。确定更优的脱压治疗药物,能够更有效地减轻衰老细胞负担,是开发健康衰老治疗方法的重要下一步。
在培养和体内,衰老细胞都表现出特征的型板和分子特征。这些衰老标记可能是衰老诱导的原因或结果,或者是这些细胞中分子变化的副产品。然而,在衰老细胞中没有特别的标记。目前,衰老相关β-乳糖酶(SA-β-Gal)检测是测量体外和体内衰老的最佳特征和既定单细胞方法之一。SA-β-Gal是一种溶酶体水解酶,在pH4时具有最佳酶活性。测量其活性在pH6是可能的,因为衰老细胞显示增加的细胞体活性23,24。对于活细胞,通过脂质体碱化获得增加的液化pH与真空H+-ATPase抑制剂巴菲洛霉素A1或内生菌酸化抑制剂氯奎因25,26。5-多地诺霉素二β-D-角质拉诺赛德(C12FDG)用作活细胞中的基质,因为它由于其12种亲碳性小鼠25而保留了细胞中的切块产物。重要的是,SA-β-Gal活性本身与在衰老细胞中识别的任何通路没有直接关系,也没有必要诱导衰老。通过这种测定,即使在异质细胞群和老化组织中,如老年人的皮肤活检,也可以识别衰老细胞。它也被用来显示细胞衰老和老化23之间的相关性,因为它是一个可靠的标志,在若干生物体和条件27,28,29衰老细胞检测, 30.在这里,描述了基于荧光基质C12FDG的高通量SA-β-Gal筛选测定,使用具有强氧应激诱导细胞衰老的原小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)进行,其优缺点讨论。虽然这种测定可以在不同的细胞类型中进行,但使用Ercc1缺陷的DNA修复受损的MEF允许在氧化应激条件下更快速地诱导衰老。在小鼠中,脱氧核糖核酸修复内糖酶ERCC1-XPF的表达减少导致DNA修复受损,内源性DNA损伤加速积累,ROS升高,线粒体功能障碍,衰老细胞负担增加,干细胞功能丧失,过早衰老,类似于自然老化31,32。同样,Ercc1缺陷MEF在文化中发生衰老的速度更快17。衰老MEF测定的一个重要特征是,每口井都有衰老和非衰老细胞的混合物,可以清楚地显示衰老细胞特异性效应。然而,尽管我们认为在原发细胞中使用氧化应激诱导衰老更具有生理性,但是这种测定也可用于细胞系,其中衰老是用DNA破坏剂(如etoposide或辐照)诱导的。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:928px;" width="928">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">DMEM&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Corning</td>
			<td style="width:344px;">10-013-CV</td>
			<td style="width:167px;">medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ham&#39;s F10</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12390-035</td>
			<td style="width:167px;">medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">fetal bovine serum</td>
			<td>Tissue Culture Biologics</td>
			<td>101</td>
			<td style="width:167px;">serum</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1x non-essential amino acids</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-025-Cl</td>
			<td style="width:167px;">amino-acids</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">bafilomycin A1&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B1793</td>
			<td style="width:167px;">lysosomal inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">C12FDG</td>
			<td>Setareh Biotech</td>
			<td>7188</td>
			<td style="width:167px;">b-Gal substrate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hoechst 33342&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H1399</td>
			<td style="width:167px;">DNA intercalation agent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">17DMAG</td>
			<td>Selleck Chemical LLC</td>
			<td>50843</td>
			<td style="width:167px;">HSP90 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">InCell6000 Cell Imaging System</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">High Content Imaging System</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sa-&#946;-galactosidase-based screening assay for the identification of senotherapeutic drugs

细胞衰老是已知对健康寿命产生负面影响的衰老特征之一。能够专门杀死细胞培养中的衰老细胞的药物,称为溶酶,可以减轻体内的衰老细胞负担,延长健康范围。迄今为止,已经确定了多种溶血剂,包括HSP90抑制剂、Bcl-2系列抑制剂、管龙胺、FOXO4抑制肽和达萨替尼/克雷塞汀的组合。在增加的溶血球pH值下检测SA-β-Gal是检测衰老细胞的最佳特征标记之一。使用荧光基质C12FDG结合确定总细胞数,结合DNA间质化Hoechst染料对衰老相关β-乳糖酶(SA-β-Gal)活性的活细胞测量,为通过杀死衰老细胞(溶血)或通过抑制SA-β-Gal和其他衰老细胞表型(异形性)来降低整体SA-β-Gal活性的脱氧治疗药物的屏幕。使用高含量荧光图像采集和分析平台,可快速、高通量地筛选药物库,从而对SA-β-Gal、细胞形态和细胞数量产生影响。

SA-β-Gal活性可以在从复制性衰竭、基因毒性和氧化应激到基因活化23、25、38等多种途径诱导衰老的细胞中检测到。在目前使用Ercc1-缺陷小鼠胚胎成纤维细胞的模型中,规范的细胞生长条件(20%O2)足以诱导细胞衰老后,培养他们几个通道。野生型MEF也经历衰老,但需要额外的通道在20%O2。</sub...

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SA-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

细胞衰老是慢性年龄相关疾病发展的关键因素。针对衰老细胞的治疗药物的鉴定为延长健康衰老提供了希望。在这里,我们提出了一个新的测定,以筛选基于测量与衰老相关的β-加拉托西沙酶在单细胞中的异质疗法的识别。

SA-β-加拉基沙酶筛查检测,用于识别治疗药物

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

我们在这里首次描述了一种方法，它允许高通量药物筛查的敏感性化合物，已被证明有利于老化相关的疾病。事实上，一些临床试验的药物测试在这个本质目前正在进行中。该技术的主要优点是，利用在衰老细胞中对SA-beta-Galactosidase的成熟检测，区分两种衰老药物，即神经学和脑体体。该技术是新型衰老化合物的重要筛选工具。事实上，一些在屏幕的帮助下被鉴定的化合物出现在各种高调的出版物中，目前正在临床试验中。此技术用途极其广泛，可适用于多个高吞吐量屏幕。事实上，它是可能的多路复用屏幕，并筛选化合物，通过激活或抑制几种途径之一抑制衰老。将每个胚胎分解成一毫米碎片，并上下管数次。接下来，在每个胚胎的组织中加入10毫升的生长介质。在10厘米的培养皿中加热它们，在37摄氏度的氧气和5%的二氧化碳中孵育两到三天。用0.25%的尝试性EDTA混合物孵育每个胚胎的其余部分10分钟。要尝试细胞，首先，小心地去除生长介质，用10毫升1X PBS洗涤细胞两次。然后，向细胞中加入两毫升025 trypsin EDTA溶液，并在37摄氏度下孵育两到三分钟。接下来，在显微镜下检查细胞，确保细胞与表面分离。添加相同数量的生长介质以终止三辛消化，并将细胞转移到锥形管中。然后，将细胞在200倍G下离心三分钟。丢弃上一液，并添加新的生长介质以重新悬浮细胞。接下来，计算细胞，并在投影的细胞密度下将它们播种到新板中。对于非衰老子培养，首先，以一比四的比例分裂汇合细胞。然后在37摄氏度的氧气和5%的二氧化碳中孵育细胞，以延伸为另一个通道。接下来，为了诱导细胞衰老，种子分裂汇合细胞从一通道以一比四的比例，并在37摄氏度的20%氧气和5%的二氧化碳环境中孵育三天。为了监测细胞衰老，使用先进的库尔特细胞计数器系统，测量每个尝试单一分步过程中细胞直径和细胞体积的逐渐增加。为了开始β-Gal的筛选检测，在96个孔板中，每孔中播种5000个衰老细胞或3000个非衰老细胞。然后，在每井中加入100微升的生长介质，在37摄氏度和20%的氧气和5%的二氧化碳下孵育细胞6小时。接下来，在 MEF 细胞中加入药物稀释，在 20%氧气和 5% 二氧化碳中孵育 37 摄氏度的细胞，24 至 48 小时。孵育后，取出药物溶液，用100微升1X PBS清洗细胞。为了诱导裂索马碱化，用90微升的巴非霉素A1溶液进行预处理，在新鲜细胞培养基中以100纳米摩尔的最终浓度稀释。然后，在37摄氏度的20%氧气和5%的二氧化碳环境中孵育细胞一小时。对于SA-beta-Gal活性的荧光分析，在生长介质中，以100微摩尔的最终浓度进行新的工作溶液。然后，在最终浓度为10微摩尔的培养基中加入10微升的工作溶液，并在37摄氏度的20%氧气和5%的二氧化碳中孵育细胞，两小时。用 100 微升 1X PBS 清洗电池。接下来，添加两微升，每毫升100微克，Hoechst 33342染料的最终浓度为每毫升2微克。在37摄氏度、20%的氧气和5%的二氧化碳下孵育细胞20分钟。孵育后，取出介质，加入100微升的新鲜生长介质，然后进行成像。在这项研究中，一个高含量的荧光图像采集和分析平台允许识别性水解药物，如17-DMAG，减少了在含有衰老细胞的小鼠胚胎成纤维细胞培养物中的总体SA-beta-Gal活动， 在第五段含有衰老细胞.软件生成的对衰老细胞和非衰老细胞混合物的定量分析，可以清楚地显示衰老细胞特异性效应，并消除巴菲洛霉素A.的后台β-半乳糖酶活性。本文包括处理氧化应激下的原发细胞，这可能导致需要监测的变异。这个程序是检测精神病药物的第一步。需要额外的细胞生存能力和细胞衰老散文来确认筛选结果。使用本文检测出几种新的丝不解药，包括第一种三聚酮组合达萨蒂尼奎塞汀、热休克蛋白90抑制剂、Bcl-2系列抑制剂和多酚菲西汀。

Research

JoVE Journal

Biology

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

使用CD71/TER119流流式细胞仪检测小鼠红系祖细胞的识别和分析

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

科研

生物学

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

荧光显微镜筛选和新一代测序：参与细胞器完整性的基因鉴定的有用工具

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

一个荧光识别GIRK通道调制器的筛选试验

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

植物蛋白复合体的翻译后修饰的鉴定

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

RNA催化剂作为记者为筛选药物对RNA编辑在锥虫

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

高通量筛选转录后调控基因的化学调节剂

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

激酶底物对鉴定使用高通量筛选


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

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西普库鲁斯核素体液的原位杂交

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. ...