Name: sa-&#946;-galactosidase-based screening assay for the identification of senotherapeutic drugs
Uploaded: 2019-06-28T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about SA-ÃŽÂ²-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af NIH Grants AG043376 (projekt 2 og Core A, PDR; Projekt 1 og Core B, LJN) og AG056278 (projekt 3 og Core A, PDR; og projekt 2, LJN) og et tilskud fra Glenn Foundation (LJN).

Dyr brug blev godkendt af Scripps Florida institutionel Animal Care og brug udvalg.
1. generering af senescent murine embryonale fibroblast (MEF) – 12-15 dage
<ol><li>Isoler vildtype og Ercc1-/- mefs fra gravide hunmus ved embryo dag 13 (E13) som beskrevet tidligere33. Bemærk: alle følgende trin udføres i en vævskultur hætte under aseptiske forhold og ved hjælp af sterile instrumenter.</li>
	<li>Embryoets hoved over øjnene.</li>
	<li>Fj...

SA-β-gal er en veldefineret biomarkør for cellulær senescens, som oprindeligt blev opdaget af Dimri et al. (1995) viser, at senescent humane fibroblaster har øget aktivitet af SA-β-gal, når de er analyseret ved pH 623 sammenlignet med prolifererende celler. I mellemtiden er der foretaget in vitro-og in vivo-assay for SA-β-gal for forskellige celletyper og væv25,39,40. Den fluorescens base...

Cellulære gulne året blev beskrevet for første gang af Leonard Hayflick og Paul Moorhead, som viste, at normale celler havde en begrænset evne til at formere sig i kultur1. Senescent celler undlader at formere sig på trods af tilstedeværelsen af næringsstoffer, vækstfaktorer og manglende kontakt hæmning, men forbliver metabolisk aktive2. Dette fænomen er kendt som replikerende senescens og blev primært tilskrives telomere, forkortelse, i det mindste i humane celler3. Yderligere undersøgelser har vist, at celler også kan induceres til at gennemgå senescens som reaktion på andre stimuli, såsom onkogen stress (oncogene induceret senescens, OIS), DNA-skade, cytotoksiske lægemidler eller bestråling (stress induceret senescens, SIS)4 , 5 , 6. som reaktion på DNA-skader, herunder telomere, erosion, celler enten senesce, starte ukontrolleret cellevækst, eller gennemgå apoptose, hvis skaden ikke kan repareres. I dette tilfælde, celle senescens synes at være gavnlig, da det virker i en tumor suppressiv måde2. I modsætning hertil øges senescens med aldring på grund af ophobning af cellulære skader, herunder DNA-skader. Da senescent celler kan udskiller cytokiner, metalloproteinaser og vækstfaktorer, betegnet som den senescens-associerede sekretoriske fænotype (SASP), bidrager denne aldersafhængige stigning i cellulær senescens og SASP til nedsat vævs homøostase og efterfølgende ældning. Også denne aldersbetingede stigning i senescens byrden er kendt for at inducere metaboliske sygdomme, stress følsomhed, Progeria syndromer, og forringet helbredelse7,8 og er til dels ansvarlig for de talrige aldersrelaterede sygdomme, såsom åreforkalkning, slidgigt, muskel degeneration, mavesår dannelse, og Alzheimers sygdom9,10,11,12,13. Eliminering af senescent celler kan medvirke til at forebygge eller forsinke vævs dysfunktion og forlænge sociale14. Dette er blevet vist i transgene musemodeller14,15,16 samt ved hjælp af senolytiske lægemidler og narkotika kombinationer, der blev opdaget gennem både Drug screening indsats og bioinformatik analyse af veje induceret specifikt i senescent celler17,18,19,20,21,22. Identificere mere optimale senotherapeutiske lægemidler, i stand til mere effektivt at reducere den senescent celle byrde, er et vigtigt næste skridt i udviklingen af terapeutiske tilgange til sund aldring.
Senescent celler viser karakteristiske fænotypiske og molekylære egenskaber, både i kultur og in vivo. Disse senescens markører kan være enten årsag eller resultat af senescens induktion eller et biprodukt af molekylære ændringer i disse celler. Men, ingen enkelt markør er fundet specifikt i senescent celler. I øjeblikket er gulne året-associeret β-galactosidase (SA-β-gal) detektion en af de bedst karakteriserede og etablerede enkelt cellebaserede metoder til måling af senescens in vitro og in vivo. SA-β-gal er en lysosomale hydrolase med en optimal enzymatisk aktivitet ved pH 4. Måling af dets aktivitet ved pH 6 er muligt, fordi senescent celler viser øget lysosomale aktivitet23,24. For levende celler opnås øget lysosomale pH ved lysosomale alkalinisering med vakuolær H+-ATPase-hæmmeren bafilomycin a1 eller den endosomale forsurings hæmmer chloroquin25,26. 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranosid (C12FDG) anvendes som substrat i levende celler, da det bevarer det spaltet produkt i cellerne på grund af dets 12 Carbon lipofile-delen25. Vigtigere er det, at SA-β-gal-aktiviteten ikke er direkte forbundet med nogen vej, der er identificeret i senescent celler, og at den ikke er nødvendig for at fremkalde en Med denne analyse kan senescent celler identificeres selv i de heterogene cellepopulationer og aldrende væv, såsom hudbiopsier fra ældre individer. Det er også blevet brugt til at vise en sammenhæng mellem celle senescens og aldring23 , da det er en pålidelig markør for senescent celle detektion i flere organismer og betingelser27,28,29, 30. Her beskrives en høj gennemløbs-SA-β-gal-Screenings analyse baseret på det fluorescerende substrat C12FDG ved hjælp af primære mus embryonale fibroblaster (mefs) med robust oxidativ stress induceret celle stabilitet og dens fordele og ulemper drøftes. Selv om denne analyse kan udføres med forskellige celletyper, brugen af Ercc1-mangelfuld, DNA reparation svækket mefs giver mulighed for hurtigere induktion af senescens under forhold af oxidativ stress. I mus medfører reduceret ekspression af DNA-reparationen endonuklease ERCC1-XPF nedsat DNA-reparation, accelereret akkumulering af endogene DNA-skader, forhøjede ROS, mitokondriel dysfunktion, øget senescent celle byrde, tab af stamcelle funktion og for tidlig aldring, svarende til naturlig aldring31,32. På samme måde undergår Ercc1-mangelfulde mef'er en hurtigere senescens i kultur17. Et vigtigt element i den senescent MEF assay er, at hver brønd har en blanding af senescent og ikke-senescent celler, giver mulighed for en klar demonstration af senescent celle-specifikke effekter. Men selv om vi mener, at brugen af oxidativt stress i primære celler til at fremkalde senescens er mere fysiologisk, kan denne analyse også bruges med cellelinjer, hvor senescens induceres med DNA-skadelige stoffer som etoposid eller bestråling.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:928px;" width="928">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">DMEM&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Corning</td>
			<td style="width:344px;">10-013-CV</td>
			<td style="width:167px;">medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ham&#39;s F10</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12390-035</td>
			<td style="width:167px;">medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">fetal bovine serum</td>
			<td>Tissue Culture Biologics</td>
			<td>101</td>
			<td style="width:167px;">serum</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1x non-essential amino acids</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-025-Cl</td>
			<td style="width:167px;">amino-acids</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">bafilomycin A1&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B1793</td>
			<td style="width:167px;">lysosomal inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">C12FDG</td>
			<td>Setareh Biotech</td>
			<td>7188</td>
			<td style="width:167px;">b-Gal substrate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hoechst 33342&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H1399</td>
			<td style="width:167px;">DNA intercalation agent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">17DMAG</td>
			<td>Selleck Chemical LLC</td>
			<td>50843</td>
			<td style="width:167px;">HSP90 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">InCell6000 Cell Imaging System</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">High Content Imaging System</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sa-&#946;-galactosidase-based screening assay for the identification of senotherapeutic drugs

Celle senescens er en af kendetegnene ved aldring, der er kendt for at have en negativ indflydelse på en sund levetid. Stoffer i stand til at dræbe senescent celler specifikt i cellekultur, kaldet senolytika, kan reducere den senescent celle byrde in vivo og forlænge healthspan. Flere klasser af senolytika er blevet identificeret til dato, herunder HSP90-hæmmere, BCL-2-familie-hæmmere, piperlongumin, et FOXO4 hæmmende peptid og kombinationen af Dasatinib/quercetin. Påvisning af SA-β-gal ved øget lysosomale pH er en af de bedst karakteriserede markører til påvisning af senescent celler. Levende celle målinger af senescens-associeret β-galactosidase (SA-β-gal) aktivitet ved hjælp af det fluorescerende substrat C12FDG i kombination med bestemmelsen af det samlede celle nummer ved hjælp af et DNA-interkalerende Hoechst-farvestof åbner mulighed for at skærm for senotherapeutiske lægemidler, der enten reducerer den samlede SA-β-gal-aktivitet ved at dræbe senescerende celler (senolytika) eller ved at undertrykke SA-β-gal og andre fænotyper af senescent celler (senomorffer). Brug af et højt indhold fluorescerende billede erhvervelse og analyseplatform giver mulighed for en hurtig, høj gennemstrømning screening af narkotika biblioteker for effekter på SA-β-gal, celle morfologi og celle nummer.

SA-β-gal aktivitet kan påvises i celler, der er induceret til at senesce af forskellige måder fra replikerende udmattelse, genotoksisk og oxidativ stress, til oncogen aktivering23,25,38. I den nuværende model ved hjælp af Ercc1-mangelfuld mus embryonale fibroblast celler, normoxic vækstbetingelser (20% O2) var tilstrækkelige til at inducere celle senescens efter dyrknin...

Watch this Scientific Journal Video about SA-ÃŽÂ²-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs at JoVE.com

SA-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cellulær senescens er den vigtigste faktor i udviklingen af kroniske aldersrelaterede patologier. Identifikation af Therapeutics at målrette senescent celler viser løfte om at forlænge sund aldring. Her præsenterer vi en ny analyse til at screene for identifikation af senotherapeutika baseret på måling af senescens associeret β-galactosidase aktivitet i enkeltceller.

SA-β-galactosidase-baseret Screenings analyse til identifikation af Senotherapeutiske lægemidler

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

Vi beskriver her for første gang en metode, der tillader høj-throughput drug screening for senoterapeutiske forbindelser, der har vist sig at være gavnlige i aldring-relaterede sygdomme. Faktisk, flere kliniske forsøg med lægemidler testet i denne essens er i øjeblikket i gang. Den største fordel ved denne teknik er at skelne mellem to typer af senoterapeutiske lægemidler, senolytika og senomorphics, ved hjælp af den veletablerede påvisning af SA-beta-Galactosidase i senescent celler.Denne teknik er et vigtigt screeningsværktøj for nye senoterapeutiske forbindelser. Faktisk, flere forbindelser, der er blevet identificeret ved hjælp af denne skærm er featured i forskellige højt profilerede publikationer, og er i øjeblikket i kliniske forsøg. Denne teknik er ekstremt alsidig og kan tilpasses flere skærme med høj gennemløb.Faktisk er det muligt at multiplex skærme, og skærm for forbindelser, der undertrykke senescens via aktivering eller hæmning af en af flere veje. Hakke hvert foster i en millimeter stykker og rør det op og ned flere gange. Dernæst tilsættes 10 milliliter vækstmedium til væv i hvert foster.Plade dem i en 10 centimeter kultur parabol, og inkubere ved 37 grader Celsius i 3% ilt og 5% kuldioxid i to til tre dage. Og inkuber resten af hvert foster med 0,25% trypsin EDTA blanding i 10 minutter. For at trypsinisere celler, først, forsigtigt fjerne vækstmediet og vaske cellerne med 10 milliliter 1X PBS to gange.Derefter tilsættes to milliliter af en 025 trypsin EDTA opløsning til cellerne, og inkubere dem ved 37 grader Celsius i to til tre minutter. Derefter inspicere cellerne under et mikroskop for at sikre, at cellerne er løsrevet fra overfladen. Tilføj den samme mængde vækstmedium for at afslutte trypsin fordøjelsen, og overføre cellerne til et konisk rør.Derefter centrifuge cellerne ved 200 gange G i tre minutter. Kassér supernatanten, og tilsæt frisk vækstmedium for at re-suspendere cellerne. Dernæst tælle cellerne og frø dem i nye plader på den forventede celletæthed.For ikke-senescent subskultivation skal der først opdeles sammenløbsceller i et forhold mellem en og fire. Derefter inkubere celler ved 37 grader Celsius i 3% ilt og 5% kuldioxid til at udvide til en anden passage. Dernæst for at fremkalde celle senescence, frø split sammenløb celler fra passage en i et forhold på en til fire og inkubere dem ved 37 grader Celsius i 20% ilt og 5% kuldioxid miljø i tre dage.For at overvåge cellulære senescens, med en avanceret Coulter Cell Counter system, måle den gradvise stigning i cellediameter og celle volumen under hver trypsinization trin. At begynde beta-Gal screening assay, frø 5, 000 senescent celler eller 3, 000 ikke-senescent celler per brønd i 96 brøndplader. Derefter tilsættes 100 mikroliter af vækstmedium til hver brønd og inkubere celler ved 37 grader Celsius og 20% ilt og 5% kuldioxid i seks timer.Dernæst tilsættes lægemiddelfortyndinger til MEF-celler og inkubere cellerne ved 37 grader Celsius i 20% ilt og 5% kuldioxid i 24 til 48 timer. Efter inkubation, fjerne lægemidlet løsning og vaske celler med 100 mikroliter af 1X PBS. For at fremkalde lysosomal alkalinisering skal celler med 90 mikroliter bafilomycin A1-opløsning fortyndes i frisk cellekulturmedium ved en endelig koncentration på 100 nanomolar.Derefter inkuberes celler ved 37 grader Celsius i 20% ilt og 5% kuldioxid miljø i en time. Til fluorescensanalyse af SA-beta-Gal-aktivitet skal der foretages en frisk arbejdsopløsning af C12FDG fortyndet i vækstmedium ved en endelig koncentration på 100 mikromolar. Derefter tilsættes 10 mikroliter af arbejdsopløsningen til kulturmediet ved en endelig koncentration på 10 mikromolar, og inkuber celler ved 37 grader Celsius i 20% ilt og 5% kuldioxid i to timer.Vask celler med 100 mikroliter 1X PBS. Dernæst tilsættes to mikroliter af et 100 mikrogram pr. milliliter Hoechst 33342 farvestof ved en endelig koncentration på to mikrogram pr. milliliter. Inkuber cellerne ved 37 grader Celsius, 20% ilt, og 5% kuldioxid i 20 minutter.Efter inkubation, fjerne medierne, tilføje 100 mikroliter af frisk vækst medium, og gå videre til billeddannelse. I denne undersøgelse, et højt indhold fluorescerende billede erhvervelse og analyse platform tilladt for identifikation af senolytiske lægemidler, såsom 17-DMAG, der reducerede den samlede SA-beta-Gal aktiviteter i murine embryonale fibroblast cellekulturer, der indeholder senescent celler i passage fem. De softwaregenererede kvantitative analyser af blandinger af senescent og ikke-senescent celler giver mulighed for klar demonstration af senescent cellespecifikke effekter og eliminering af baggrunds beta-galactosidase-aktivitet ved bafilomycin A.Sørg for, at alle nødvendige cellekontroller er inkluderet, især ubehandlede senescentceller og senescentceller behandlet med en positiv kontrol.Dette essay omfatter arbejde med primære celler under oxidativstress, hvilket kan føre til variation, der skal overvåges. Denne procedure er det første skridt i påvisning af senoterapeutiske lægemidler. Yderligere celle levedygtighed og celle senescent essays skal udføres for at bekræfte screening resultater.Flere nye senolytiske lægemidler er blevet opdaget ved hjælp af dette essay, herunder den første senolytiske lægemiddelkombination dasatinib quercetin, varmechok protein 90 hæmmere, Bcl-2 familie hæmmere, og polyfenol fisetin.

Research

JoVE Journal

Biology

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Fluorescens-mikroskopi Screening og næste generation sekventering: Nyttige værktøjer til identifikation af gener involveret i organel Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

En fluorescerende screeningsassay til identifikation af modulatorer af GIRK kanaler

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identifikation af post-translationelle modifikationer til planteprotein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

RNA Catalyst som en reporter for screening af lægemidler mod RNA redigering i trypanosomer

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

High-throughput screening for kemiske modulatorer af post-transkriptionelt regulerede gener

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Identifikation af kinase-substrat Pairs Brug højkapacitetsscreening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunpræcipitation Assay til identifikation af Arabidopsis Protein-DNA interaktioner<em&gt; In vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Identifikation af nye regulatorer af plantetranspiration ved storstilet termisk billeddannelse screening i Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. ...