Name: sa-&#946;-galactosidase-based screening assay for the identification of senotherapeutic drugs
Uploaded: 2019-06-28T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about SA-ÃŽÂ²-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door NIH grants AG043376 (project 2 en Core A, PDR; Project 1 en Core B, LJN) en AG056278 (project 3 en Core A, PDR; en project 2, LJN) en een subsidie van de Glenn Foundation (LJN).

Het gebruik van dieren werd goedgekeurd door de Commissie voor institutionele dierenverzorging en-gebruik in de Scripps Florida.
1. generatie van senescentie-embryonale fibroblast (MEF) – 12-15 dagen
<ol><li>Isoleer wild type en Ercc1-/- mefs van zwangere vrouwelijke muizen op embryonale dag 13 (E13) zoals eerder beschreven33. Opmerking: alle volgende stappen worden uitgevoerd in een weefselkweek kap onder aseptische omstandigheden en met behu...

SA-β-Gal is een goed gedefinieerde biomarker voor cellulaire senescentie die oorspronkelijk werd ontdekt door Dimri et al. (1995) waaruit blijkt dat senescentie menselijke fibroblasten de activiteit van SA-β-gal hebben verhoogd bij een aanval op pH 623 in vergelijking met prolifererende cellen. Ondertussen zijn in vitro en in vivo analyse voor sa-β-gal vastgesteld voor verschillende celtypen en weefsels25,39,<sup cla...

Cellulaire senescentie werd voor het eerst beschreven door Leonard Hayflick en Paul Moorhead, die liet zien dat normale cellen een beperkt vermogen hadden om te vermenigvuldigen in cultuur1. Senescentie cellen niet te vermenigvuldigen ondanks de aanwezigheid van voedingsstoffen, groeifactoren en gebrek aan contact remming, maar blijven metabosch actief2. Dit fenomeen staat bekend als replicatief senescentie en werd voornamelijk toegeschreven aan de telomeer verkorting, althans in menselijke cellen3. Verdere studies hebben aangetoond dat cellen ook kunnen worden geïnduceerd om senescentie te ondergaan in reactie op andere stimuli, zoals oncogene stress (oncogene geïnduceerde senescentie, OIS), DNA-beschadiging, cytotoxische geneesmiddelen of bestraling (stress geïnduceerde senescentie, SIS)4 , 5 , 6. als reactie op DNA schade, met inbegrip van telomeer erosie, cellen ofwel senesce, start ongecontroleerde celgroei, of ondergaan apoptosis als de schade niet kan worden hersteld. In dit geval, cel senescentie lijkt te zijn gunstig als het werkt in een tumor suppressieve manier2. In tegenstelling, senescentie wordt verhoogd met veroudering als gevolg van de accumulatie van cellulaire schade met inbegrip van DNA-schade. Aangezien senescentie cellen cytokines kunnen afscheiden, matrixmetalloproteïnases en groeifactoren, aangeduid als de senescentie-geassocieerde secretoire fenotype (sasp), deze leeftijd afhankelijke toename van cellulaire senescentie en sasp draagt bij aan verminderde weefselhomeostase en vervolgens veroudert. Ook is deze leeftijdsafhankelijke toename van de senescentie last bekend voor het opwekken van metabole ziekten, stress gevoeligheid, Progeria syndromen en verstoorde genezing7,8 en is, deels, verantwoordelijk voor de talrijke leeftijdsgebonden ziekten, zoals atherosclerose, artrose, gespierde degeneratie, zweervorming, en de ziekte van Alzheimer9, 10,11,12,13. Het elimineren van senescentie cellen kan helpen om weefsel disfunctie te voorkomen of vertragen en healthspan14uit te breiden. Dit is aangetoond in transgene muismodellen14,15,16 en door gebruik te maken van senolytische geneesmiddelen en combinaties van geneesmiddelen die werden ontdekt door zowel de screening van de drug en bioinformatische analyse van trajecten specifiek geïnduceerd in de senescentie cellen17,18,19,20,21,22. Het identificeren van meer optimale senotherapeutische geneesmiddelen, in staat om de senescentie-celbelasting effectiever te verminderen, is een belangrijke volgende stap in de ontwikkeling van therapeutische benaderingen voor gezonde veroudering.
De senescentie cellen vertonen karakteristieke fenotypische en moleculaire kenmerken, zowel in de cultuur als in vivo. Deze senescentie markers kunnen ofwel de oorzaak of het resultaat zijn van senescentie inductie of een bijproduct van moleculaire veranderingen in deze cellen. Er wordt echter geen enkele marker specifiek gevonden in de senescentie cellen. Op dit moment, senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-Gal) detectie is een van de meest gekarakteriseerde en gevestigde eencellige methoden voor het meten van senescentie in vitro en in vivo. SA-β-Gal is een lysosomale hydrolase met een optimale enzymatische activiteit bij pH 4. Het meten van zijn activiteit bij pH 6 is mogelijk, omdat de senescentie cellen een verhoogde lysosomale activiteit vertonen23,24. Voor levende cellen wordt een verhoogde lysosomale pH verkregen door lysosomale alkalisatie met de vacuole H+-ATPase-remmer bafilomycine a1 of de endosomale verzuring remmer chloroquine25,26. 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside (C12FDG) wordt gebruikt als substraat in levende cellen als het behoudt het gecleaved product in de cellen als gevolg van de 12 Carbon lipofiele stof25. Belangrijk is dat de SA-β-gal-activiteit zelf niet rechtstreeks verbonden is met een in de senescentie cellen geïdentificeerd traject en niet noodzakelijk is voor het induceren van senescence. Met deze test kunnen senescentie cellen worden geïdentificeerd, zelfs in heterogene celpopulaties en verouderings weefsels, zoals huid biopsieën van oudere individuen. Het is ook gebruikt om een correlatie tussen cel senescentie en veroudering van23 te laten zien, omdat het een betrouwbare marker is voor het detecteren van sencentie cellen in verschillende organismen en voorwaarden27,28,29, 30. Hier wordt een hoge doorvoer van de SA-β-gal-screeningtest op basis van het fluorescerende substraat C12FDG met behulp van primaire muis embryonale fibroblasten (mef's) met robuuste oxidatieve stress geïnduceerde celsenescentie beschreven en de voor-en nadelen ervan worden besproken. Hoewel deze test kan worden uitgevoerd met verschillende celtypen, het gebruik van Ercc1-deficiënte, DNA-herstel verminderde mefs zorgt voor een snellere inductie van senescentie onder omstandigheden van oxidatieve stress. Bij muizen, verminderde expressie van de DNA-reparatie endonuclease ERCC1-XPF veroorzaakt verminderde DNA-herstel, versnelde accumulatie van endogene DNA-schade, verhoogde ROS, mitochondriale disfunctie, verhoogde senescentie celbelasting, verlies van stamcel functie en vroegtijdige veroudering, vergelijkbaar met natuurlijke veroudering31,32. Evenzo ondergaan Ercc1-deficiënte mef's sneller senescentie in cultuur17. Een belangrijk kenmerk van de senescentie-MEF-test is dat elk goed een mengsel van senescentie-en niet-senescentie cellen heeft, waardoor een duidelijke demonstratie van senescentie-celspecifieke effecten mogelijk is. Hoewel we geloven dat het gebruik van oxidatieve stress in primaire cellen voor het opwekken van senescentie meer fysiologisch is, kan deze test ook worden gebruikt met cellijnen waar senescentie wordt geïnduceerd met DNA-schadelijke agentia zoals Etoposide of bestraling.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:928px;" width="928">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">DMEM&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Corning</td>
			<td style="width:344px;">10-013-CV</td>
			<td style="width:167px;">medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ham&#39;s F10</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12390-035</td>
			<td style="width:167px;">medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">fetal bovine serum</td>
			<td>Tissue Culture Biologics</td>
			<td>101</td>
			<td style="width:167px;">serum</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1x non-essential amino acids</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-025-Cl</td>
			<td style="width:167px;">amino-acids</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">bafilomycin A1&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B1793</td>
			<td style="width:167px;">lysosomal inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">C12FDG</td>
			<td>Setareh Biotech</td>
			<td>7188</td>
			<td style="width:167px;">b-Gal substrate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hoechst 33342&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H1399</td>
			<td style="width:167px;">DNA intercalation agent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">17DMAG</td>
			<td>Selleck Chemical LLC</td>
			<td>50843</td>
			<td style="width:167px;">HSP90 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">InCell6000 Cell Imaging System</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">High Content Imaging System</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sa-&#946;-galactosidase-based screening assay for the identification of senotherapeutic drugs

Cell senescentie is een van de kenmerken van veroudering bekend om een negatieve invloed op een gezonde levensduur. Geneesmiddelen die in staat zijn om de senescentie cellen te doden, specifiek in de celcultuur, de zogenaamde senolytica, kunnen de senescentie-celbelasting in vivo verminderen en de healthspan verlengen. Er zijn tot nu toe meerdere klassen van senolytica geïdentificeerd, waaronder HSP90 remmers, bcl-2 familie remmers, piperlongumine, een FOXO4 remmende peptide en de combinatie van Dasatinib/quercetine. Detectie van SA-β-gal bij een verhoogde lysosomale pH is een van de best gekenmerkte markers voor de detectie van senescentie cellen. Levende celmetingen van senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-Gal) activiteit met behulp van het fluorescerende substraat C12FDG in combinatie met de bepaling van het totale aantal cellen met behulp van een DNA intercalating Hoechst Dye opent de mogelijkheid om scherm voor senotherapeutische geneesmiddelen die ofwel de algehele SA-β-gal-activiteit verminderen door het doden van senescentie cellen (senolytica) of door het onderdrukken van SA-β-gal en andere fenotypes van senescentie cellen (senomorfen). Het gebruik van een high-content fluorescerende beeld acquisitie-en analyseplatform zorgt voor de snelle screening van medicijn bibliotheken met een hoge doorvoer voor effecten op SA-β-gal, celmorfologie en celnummer.

SA-β-gal activiteit kan worden gedetecteerd in cellen die worden geïnduceerd aan senesce door verschillende manieren van replicatieve uitputting, genotoxische en oxidatieve stress, naar oncogen activering23,25,38. In het huidige model met behulp van Ercc1-deficiënte muis embryonale fibroblast cellen, normoxic groei voorwaarden (20% O2) waren voldoende om te induceren cel se...

Watch this Scientific Journal Video about SA-ÃŽÂ²-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs at JoVE.com

SA-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cellulaire senescentie is de belangrijkste factor in de ontwikkeling van chronische leeftijdsgebonden pathologieën. Identificatie van therapeutische middelen die gericht zijn op senescentie cellen tonen belofte voor het verlengen van gezonde veroudering. Hier presenteren we een nieuwe assay voor de identificatie van senotherapeutica op basis van meting van senescentie geassocieerde β-galactosidase activiteit in enkelvoudige cellen.

Op SA-β-galactosidase gebaseerde screeningstest voor de identificatie van Senotherapeutische geneesmiddelen

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

We beschrijven hier voor het eerst een methode die het mogelijk maakt high-throughput drug screening voor senotherapeutische verbindingen die gunstig zijn gebleken bij veroudering-gerelateerde ziekten. In feite zijn verschillende klinische studies met geneesmiddelen getest in deze essentie momenteel aan de gang. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is om onderscheid te maken tussen twee soorten senotherapeutische geneesmiddelen, senolytica en senomorphics, met behulp van de gevestigde detectie van SA-beta-Galactosidase in senescente cellen.Deze techniek is een belangrijk screeningsinstrument voor nieuwe senotherapeutische verbindingen. In feite, verschillende verbindingen die zijn geïdentificeerd met behulp van dit scherm zijn opgenomen in verschillende high-profile publicaties, en zijn momenteel in klinische proef. Deze techniek is zeer veelzijdig en kan worden aangepast aan verschillende hoge doorvoerschermen.In feite is het mogelijk om multiplex schermen, en het scherm voor verbindingen die senescentie onderdrukken via de activering of remming van een van de verschillende trajecten. Hak elk embryo in stukken van één millimeter en pijp het meerdere keren op en neer. Voeg vervolgens 10 milliliter groeimedium toe aan de weefsels van elk embryo.Plaat ze in een 10 centimeter cultuur schotel, en uitbroeden bij 37 graden Celsius in 3%zuurstof en 5% kooldioxide voor twee tot drie dagen. En de rest van elk embryo inbroeden met 0,25% trypsine EDTA mengsel gedurende 10 minuten. Om cellen te trypsinize, eerst, verwijder voorzichtig het groeimedium en was de cellen met 10 milliliter 1X PBS tweemaal.Voeg vervolgens twee milliliter van een 025 trypsine EDTA-oplossing toe aan de cellen en broed ze twee tot drie minuten uit bij 37 graden Celsius. Inspecteer vervolgens de cellen onder een microscoop om ervoor te zorgen dat de cellen van het oppervlak worden losgemaakt. Voeg dezelfde hoeveelheid groeimedium toe om de trypsinevertering te beëindigen en breng de cellen over naar een conische buis.Dan, centrifugeren de cellen op 200 keer G gedurende drie minuten. Gooi de supernatant weg en voeg een vers groeimedium toe om de cellen opnieuw op te schorten. Tel vervolgens de cellen en zaad ze in nieuwe platen op de geprojecteerde celdichtheid.Voor niet-senescente subteelt, ten eerste, splitconfluent cellen op een een-op-vier verhouding. Dan incubeercellen op 37 graden Celsius in 3%zuurstof en 5% kooldioxide uit te breiden voor een andere passage. Vervolgens, om cel senescentie induceren, zaad split samenvloeiing cellen uit passage een op een verhouding van een tot vier en broeden ze op 37 graden Celsius in 20% zuurstof en 5% kooldioxide milieu voor drie dagen.Om cellulaire senescentie te monitoren, met een geavanceerd Coulter Cell Counter-systeem, meet u de geleidelijke toename van de celdiameter en het celvolume tijdens elke trypsinisatiestap. Om te beginnen bèta-Gal screening test, zaad 5,000 senescente cellen of 3, 000 niet-senescente cellen per goed in 96 goed platen. Voeg vervolgens 100 microliter groeimedium toe aan elke put en incubbate cellen bij 37 graden Celsius en 20% zuurstof en 5% kooldioxide gedurende zes uur.Voeg vervolgens verdunningen toe aan MEF-cellen en broed de cellen in op 37 graden Celsius in 20% zuurstof en 5% kooldioxide gedurende 24 tot 48 uur. Na incubatie, verwijder de medicijnoplossing en was cellen met 100 microliters van 1X PBS. Om lysosomale alkalinisatie te induceren, pre-treat cellen met 90 microliters van bafilomycine A1 oplossing, verdund in verse celkweek medium met een uiteindelijke concentratie van 100 nanomolar.Dan, incubeercellen op 37 graden Celsius in 20% zuurstof en 5% kooldioxide milieu voor een uur. Voor fluorescentieanalyse van SA-beta-Gal activiteit, maak een verse werkoplossing van C12FDG verdund in groeimedium, bij een uiteindelijke concentratie van 100 micromolar. Voeg vervolgens 10 microliter van de werkoplossing toe aan het kweekmedium bij een uiteindelijke concentratie van 10 micromolar en incubeercellen bij 37 graden Celsius in 20% zuurstof en 5% kooldioxide gedurende twee uur.Was cellen met 100 microliter van 1X PBS. Voeg vervolgens twee microliters van een 100 microgram-per-milliliter Hoechst 33342 kleurstof toe bij een uiteindelijke concentratie van twee microgram per milliliter. Incubeer de cellen op 37 graden Celsius, 20%zuurstof, en 5% kooldioxide gedurende 20 minuten.Na incubatie, verwijder de media, voeg 100 microliters van vers groeimedium, en ga naar beeldvorming. In deze studie, een hoog-gehalte fluorescerende beeld verwerving en analyse platform toegestaan voor de identificatie van senolytische geneesmiddelen, zoals 17-DMAG, dat verminderde de totale SA-beta-Gal activiteiten in murine embryonale fibroblast celculturen met senescent cellen in passage vijf. De door software gegenereerde kwantitatieve analyses van mengsels van senescente en niet-senescente cellen zorgen voor een duidelijke demonstratie van senescente celspecifieke effecten, en de eliminatie van bèta-galactosidaseactiviteit op de achtergrond door bafilomycine A.Zorg ervoor dat alle noodzakelijke celcontroles zijn opgenomen, met name onbehandelde senscente cellen en senescente cellen die met een positieve controle worden behandeld.Dit essay omvat het werken met primaire cellen onder oxidatieve stress, wat kan leiden tot variatie die moet worden gecontroleerd. Deze procedure is de eerste stap in de detectie van senotherapeutische geneesmiddelen. Extra cel levensvatbaarheid en cel senescent essays moeten worden uitgevoerd om de screening resultaten te bevestigen.Verschillende nieuwe senolytische geneesmiddelen zijn gedetecteerd met behulp van dit essay, met inbegrip van de eerste senolytische drug combinatie dasatinib quercetine, hitteshock eiwit 90 remmers, Bcl-2 familie remmers, en de polyfenol fisetin.

Research

JoVE Journal

Biology

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

Identificatie en analyse van de muis erytroïde voorouders met behulp van de CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Fluorescentie-microscopie Screening en next-generation sequencing: Handige hulpmiddelen voor de identificatie van genen betrokken bij organel Integriteit

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

Een TL-screeningstest voor het vaststellen van Modulators van GIRK kanalen

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identificatie van post-translationele modificaties van Plant eiwitcomplexen

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

RNA Catalyst als verslaggever voor het screenen van geneesmiddelen tegen RNA Bewerken in Trypanosomen

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

High-throughput screening voor Chemische Modulators van Post-transcriptioneel gereguleerde genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Identificatie van de kinase-substraat Paren Met behulp van high throughput screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatine immunoprecipitatie assay voor de identificatie van Arabidopsis eiwit-DNA interacties<em&gt; In Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Identificatie van nieuwe regulatoren van plantaardige transpiratie door grootschalige thermische beeldvorming screening in Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

In situ Hybridisatie voor Sipunculus nudus Coelomic Fluid

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. ...