Name: sa-&#946;-galactosidase-based screening assay for the identification of senotherapeutic drugs
Uploaded: 2019-06-28T14:30:00
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Ce travail a été soutenu par LES subventions des NIH AG043376 (Projet 2 et Core A, PDR; Projet 1 et Core B, LJN) et AG056278 (Projet 3 et Core A, PDR; et Projet 2, LJN) et une subvention de la Glenn Foundation (LJN).

L'utilisation des animaux a été approuvée par le Scripps Florida Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Génération de fibroblaste sénescent embryonnaire murine (MEF) - 12-15 jours
<ol><li>Isoler le type sauvage et Ercc1-/- MEFs des souris femelles enceintes au jour embryonnaire 13 (E13) comme décrit précédemment33. REMARQUE : Toutes les étapes suivantes sont effectuées dans une hotte de culture tissulaire dans des conditions ...

SA-MD-Gal est un biomarqueur bien défini pour la sénescence cellulaire découvert à l'origine par Dimri et al. (1995) montrant que les fibroblastes humains sénescents ont augmenté l'activité de SA-A-Gal lorsqu'ils sont évalués au pH 623 par rapport aux cellules proliférantes. Pendant ce temps, l'analyse in vitro et in vivo pour SA--Gal ont été établis pour différents types de cellules et de tissus25,39,<sup...

La sénescence cellulaire a été décrite pour la première fois par Leonard Hayflick et Paul Moorhead, qui ont montré que les cellules normales avaient une capacité limitée à proliférer dans la culture1. Les cellules sénescentes ne prolifèrent pas malgré la présence de nutriments, les facteurs de croissance et le manque d'inhibition du contact, mais restent métaboliquement actives2. Ce phénomène est connu sous le nom de sénescence réplicative et a été principalement attribué au raccourcissement des télomères, au moins dans les cellules humaines3. D'autres études ont montré que les cellules peuvent également être induites à subir la sénescence en réponse à d'autres stimuli, tels que le stress oncogène (sénescence induite par l'oncogène, OIS), les dommages à l'ADN, les médicaments cytotoxiques, ou l'irradiation (sénescence induite par le stress, SIS)4 , 5 Annonces , 6. En réponse aux dommages à l'ADN, y compris l'érosion des télomères, les cellules séneesce, commencent la croissance cellulaire incontrôlée, ou subissent l'apoptose si les dommages ne peuvent pas être réparés. Dans ce cas, la sénescence cellulaire semble être bénéfique car elle agit d'une manière suppressive de tumeur2. En revanche, la sénescence est augmentée avec le vieillissement dû à l'accumulation des dommages cellulaires comprenant des dommages d'ADN. Puisque les cellules sénescentes peuvent sécrétiser des cytokines, des metalloproteinases et des facteurs de croissance, appelés phénotype sécréteur sénieux séniescence-associés (SASP), cette augmentation âge-dépendante de la sénescence cellulaire et sASP contribue à l'homéostasie diminuée de tissu et par la suite le vieillissement. En outre, cette augmentation dépendante de l'âge de la charge de sénescence est connue pour induire des maladies métaboliques, la sensibilité au stress, les syndromes de progeria, et la guérison altérée7,8 et est, en partie, responsable des nombreux âges liés maladies, telles que l'athérosclérose, l'arthrose, la dégénérescence musculaire, la formation d'ulcères, et la maladie d'Alzheimer9,10,11,12,13. L'élimination des cellules sénescentes peut aider à prévenir ou retarder le dysfonctionnement des tissus et à prolonger l'étendue de la santé14. Cela a été démontré dans les modèles de souris transgéniques14,15,16 ainsi qu'en utilisant des médicaments sénolytiques et des combinaisons de médicaments qui ont été découverts à la fois par les efforts de dépistage des médicaments et l'analyse bioinformatique de voies induites spécifiquement dans les cellules sénescentes17,18,19,20,21,22. L'identification de médicaments sénothérapeutiques plus optimaux, capables de réduire plus efficacement le fardeau cellulaire sénescent, est une prochaine étape importante dans le développement d'approches thérapeutiques pour le vieillissement en santé.
Les cellules sénescentes présentent des caractéristiques phénotypiques et moléculaires, tant en culture qu'in vivo. Ces marqueurs de sénescence pourraient être la cause ou le résultat de l'induction de sénescence ou un sous-produit des changements moléculaires dans ces cellules. Cependant, aucun marqueur unique n'est trouvé spécifiquement dans les cellules sénescentes. À l'heure actuelle, la détection de la sénescence associée à la sénescence est l'une des méthodes à base de cellules individuelles les mieux caractérisées et établies pour mesurer la sénescence in vitro et in vivo. SA-Gal est une hydrolase lysosomale avec une activité enzymatique optimale au pH 4. La mesure de son activité au pH 6 est possible parce que les cellules sénescentes montrent une activité lysosomale accrue23,24. Pour les cellules vivantes, l'augmentation du pH lysosomal est obtenue par alcalinisation lysosomale avec l'inhibiteur vacuolar H -ATPase Bafilomycin A1 ou l'inhibiteur de l'acidification endosomal chloroquine25,26. 5-Dodecanoylaminofluorescein Di-MD-D-galactopyranoside (C12FDG) est utilisé comme substrat dans les cellules vivantes car il conserve le produit clivé dans les cellules en raison de sa moiétologie lipophile de 12 carbone25. Fait important, l'activité de SA--Gal elle-même n'est pas directement liée à une voie identifiée dans les cellules sénescentes et n'est pas nécessaire pour induire la sénescence. Avec cet analyse, les cellules sénescentes peuvent être identifiées même dans les populations hétérogènes de cellules et les tissus vieillissants, tels que des biopsies de peau des individus plus âgés. Il a également été utilisé pour montrer une corrélation entre la sénescence cellulaire et le vieillissement23 car il est un marqueur fiable pour la détection des cellules sénescentes dans plusieurs organismes et les conditions27,28,29, 30. Ici, un test de dépistage à haut débit SA-M-Gal basé sur le substrat fluorescent C12FDG à l'aide de fibroblastes embryonnaires de souris primaires (MEFs) avec une sénescence cellulaire induite par le stress solidement oxydatif est décrit et ses avantages et inconvénients sont discutés. Bien que cet analyse puisse être effectué avec différents types de cellules, l'utilisation d'Ercc1-déficient, MEFs altérés de réparation d'ADN permet l'induction plus rapide de la sénescence dans des conditions de stress oxydatif. Chez la souris, l'expression réduite de l'endodocléère d'ENdonuclease d'ADN ERCC1-XPF cause la réparation altérée d'ADN, l'accumulation accélérée des dommages endogènes d'ADN, le ROS élevé, le dysfonctionnement mitochondrique, le fardeau sénescent accru de cellules, la perte de fonction de cellules souches et vieillissement prématuré, semblable au vieillissement naturel31,32. De même, Ercc1-déficients MEFs subissent une sénescence plus rapide dans la culture17. Une caractéristique importante de l'exemple sénescent MEF est que chaque puits a un mélange de cellules sénescentes et non-sénescentes, permettant la démonstration claire des effets sénescents de cellules spécifiques. Cependant, bien que nous croyons que l'utilisation du stress oxydatif dans les cellules primaires pour induire la sénescence est plus physiologique, cet essai peut également être employé avec des lignes cellulaires où la sénescence est induite avec des agents dommageables d'ADN comme l'étoposide ou l'irradiation.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:928px;" width="928">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">DMEM&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Corning</td>
			<td style="width:344px;">10-013-CV</td>
			<td style="width:167px;">medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ham&#39;s F10</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12390-035</td>
			<td style="width:167px;">medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">fetal bovine serum</td>
			<td>Tissue Culture Biologics</td>
			<td>101</td>
			<td style="width:167px;">serum</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1x non-essential amino acids</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-025-Cl</td>
			<td style="width:167px;">amino-acids</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">bafilomycin A1&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B1793</td>
			<td style="width:167px;">lysosomal inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">C12FDG</td>
			<td>Setareh Biotech</td>
			<td>7188</td>
			<td style="width:167px;">b-Gal substrate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hoechst 33342&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H1399</td>
			<td style="width:167px;">DNA intercalation agent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">17DMAG</td>
			<td>Selleck Chemical LLC</td>
			<td>50843</td>
			<td style="width:167px;">HSP90 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">InCell6000 Cell Imaging System</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">High Content Imaging System</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sa-&#946;-galactosidase-based screening assay for the identification of senotherapeutic drugs

La sénescence cellulaire est l'une des caractéristiques du vieillissement connu pour influencer négativement une durée de vie saine. Les médicaments capables de tuer les cellules sénescentes spécifiquement dans la culture cellulaire, appelées sénolytiques, peuvent réduire le fardeau cellulaire sénescent in vivo et prolonger la durée de vie. Plusieurs classes de sénolytiques ont été identifiées à ce jour, y compris les inhibiteurs du HSP90, les inhibiteurs de la famille Bcl-2, la piperlongumine, un peptide inhibiteur FOXO4 et la combinaison de Dasatinib/Quercetin. La détection de SA-A-Gal à un pH lysosomal accru est l'un des marqueurs les mieux caractérisés pour la détection des cellules sénescentes. Mesures cellulaires vivantes de l'activité de la sénescence associée à la sénescence (SA-MD-Gal) à l'aide du substrat fluorescent C12FDG en combinaison avec la détermination du nombre total de cellules à l'aide d'un colorant Hoechst intercalant l'ADN ouvre la possibilité de dépistage des médicaments sénothérapeutiques qui réduisent l'activité globale de SA-A-Gal en tuant les cellules sénescentes (sénolytiques) ou en supprimant le SA-Gal et d'autres phénotypes des cellules sénescentes (sénomorphiques). L'utilisation d'une plate-forme d'acquisition et d'analyse d'images fluorescentes à haute teneur permet le dépistage rapide et à haut débit des bibliothèques de médicaments pour les effets sur sA-MD-Gal, la morphologie cellulaire et le numéro de cellulaire.

L'activité de SA--Gal peut être détectée dans les cellules qui sont induites à séneesce par diverses manières de l'épuisement réplicif, le stress génotoxique et oxydatif, à l'activation d'oncogène23,25,38. Dans le modèle actuel utilisant les cellules embryonnaires de fibroblaste d'Ercc1-déficientes de souris, les conditions normoxic de croissance (20% O2) étaient suffisa...

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SA-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

La sénescence cellulaire est le facteur clé dans le développement de pathologies chroniques liées à l'âge. L'identification des thérapies qui ciblent les cellules sénescentes s'avère prometteuse pour prolonger le vieillissement sain. Ici, nous présentons un essai nouveau pour l'identification des sénotherapeutics basés sur la mesure de l'activité associée de sénescence de 'Galactosidase dans les cellules simples.

Essai de dépistage basé sur sA-MD-Galactosidase pour l'identification des médicaments sérothérapeutiques

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

Nous décrivons ici pour la première fois une méthode qui permet le criblage de drogue à haut débit pour des composés senotherapeutic qui se sont avérés salutaires dans les maladies aging-connexes. En fait, plusieurs essais cliniques avec des médicaments testés dans cette essence sont actuellement en cours. Le principal avantage de cette technique est de distinguer deux types de médicaments sénothérapeutiques, sénolytiques et sénomorphes, en utilisant la détection bien établie de SA-beta-Galactosidase dans les cellules sénescentes.Cette technique est un outil de dépistage important pour les nouveaux composés sénothérapeutiques. En fait, plusieurs composés qui ont été identifiés à l’aide de cet écran sont présentés dans diverses publications de haut niveau, et sont actuellement en essai clinique. Cette technique est extrêmement polyvalente et peut être adaptée à plusieurs écrans à haut débit.En fait, il est possible de multiplexer les écrans, et l’écran pour les composés qui suppriment la sénescence par l’activation ou l’inhibition de l’une des plusieurs voies. Hacher chaque embryon en morceaux d’un millimètre et le faire monter et descendre plusieurs fois. Ensuite, ajoutez 10 millilitres de milieu de croissance aux tissus de chaque embryon.Assiettez-les dans un plat de culture de 10 centimètres, et incubez à 37 degrés Celsius en oxygène de 3% et 5% de dioxyde de carbone pendant deux à trois jours. Et incuber le reste de chaque embryon avec 0,25% trypsine EDTA mélange pendant 10 minutes. Pour trypsiniser les cellules, d’abord, retirez soigneusement le milieu de croissance et lavez les cellules avec 10 millilitres de 1X PBS deux fois.Ensuite, ajoutez deux millilitres d’une solution EDTA de trypsine 025 aux cellules, et incubez-les à 37 degrés Celsius pendant deux à trois minutes. Ensuite, inspectez les cellules au microscope pour vous assurer que les cellules sont détachées de la surface. Ajouter la même quantité de milieu de croissance pour mettre fin à la digestion de la trypsine, et transférer les cellules dans un tube conique.Ensuite, centrifuger les cellules à 200 fois G pendant trois minutes. Jetez le supernatant et ajoutez un milieu de croissance frais pour suspendre à nouveau les cellules. Ensuite, comptez les cellules et ensemencez-les dans de nouvelles plaques à la densité cellulaire projetée.Pour la subcultivation non sénescente, d’abord, diviser les cellules confluentes à un rapport d’un à quatre. Puis incuber les cellules à 37 degrés Celsius en 3% d’oxygène et 5% de dioxyde de carbone à prolonger pour un autre passage. Ensuite, pour induire la sénescence cellulaire, les graines séparent les cellules confluentes du passage un à un rapport de un à quatre et les incuber à 37 degrés Celsius dans 20% d’oxygène et 5% de dioxyde de carbone environnement pendant trois jours.Pour surveiller la sénescence cellulaire, avec un système avancé de compteur cellulaire Coulter, mesurez l’augmentation progressive du diamètre cellulaire et du volume cellulaire à chaque étape de trypsinisation. Pour commencer l’analyse de dépistage bêta-gal, graine 5000 cellules sénescentes ou 3000 cellules non sénescentes par puits dans 96 plaques de puits. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de milieu de croissance à chaque puits et incubez les cellules à 37 degrés Celsius et 20% d’oxygène et 5% de dioxyde de carbone pendant six heures.Ensuite, ajoutez des dilutions médicamenteuses aux cellules MEF et incubez les cellules à 37 degrés Celsius en oxygène à 20 % et 5 % en dioxyde de carbone pendant 24 à 48 heures. Après l’incubation, retirer la solution médicamenteuses et laver les cellules avec 100 microlitres de 1X PBS. Pour induire l’alcalinisation lysosomale, pré-traiter les cellules avec 90 microlitres de solution bafilomycine A1, diluées dans le milieu de culture cellulaire fraîche à une concentration finale de 100 nanomolaires.Ensuite, incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans 20% d’oxygène et 5% de dioxyde de carbone environnement pendant une heure. Pour l’analyse de fluorescence de l’activité SA-beta-Gal, faire une nouvelle solution de travail de C12FDG dilué dans le milieu de croissance, à une concentration finale de 100 micromolaires. Ensuite, ajouter 10 microlitres de la solution de travail au milieu de culture à une concentration finale de 10 micromolaires, et incuber les cellules à 37 degrés Celsius en 20% d’oxygène et 5% de dioxyde de carbone pendant deux heures.Laver les cellules avec 100 microlitres de 1X PBS. Ensuite, ajoutez deux microlitres d’un colorant Hoechst 33342 de 100 microgrammes par millilitre à une concentration finale de deux microgrammes par millilitre. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius, 20% d’oxygène et 5% de dioxyde de carbone pendant 20 minutes.Après l’incubation, retirer le milieu, ajouter 100 microlitres de milieu de croissance frais et passer à l’imagerie. Dans cette étude, une plate-forme d’acquisition et d’analyse d’images fluorescentes à haute teneur a permis d’identifier des médicaments sénolytiques, tels que 17-DMAG, qui ont réduit les activités globales de SA-beta-Gal dans les cultures cellulaires embryonnaires murines contenant des cellules sénescentes au passage cinq. Les analyses quantitatives générées par logiciel des mélanges de cellules sénescentes et non sénescentes permettent la démonstration claire des effets spécifiques aux cellules sénescentes, et l’élimination de l’activité bêta-galactosidase de fond par bafilomycine A.Assurez-vous que tous les contrôles cellulaires nécessaires sont inclus, en particulier les cellules sénescentes non traitées et les cellules sénescentes traitées avec un contrôle positif.Cet essai inclut le travail avec les cellules primaires sous le stress oxydant, qui peut mener à la variation qui doivent être surveillées. Cette procédure est la première étape dans la détection des médicaments sénothérapeutiques. D’autres essais de viabilité cellulaire et de sénescence cellulaire doivent être exécutés pour confirmer les résultats du dépistage.Plusieurs nouveaux médicaments sénolytiques ont été détectés à l’aide de cet essai, y compris la première combinaison de médicaments sénolytiques dasatinib quercetin, inhibiteurs de la protéine de choc thermique 90, inhibiteurs de la famille Bcl-2, et la fisetin polyphénol.

Research

JoVE Journal

Biology

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

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