Name: sa-&#946;-galactosidase-based screening assay for the identification of senotherapeutic drugs
Uploaded: 2019-06-28T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about SA-ÃŽÂ²-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der NIH Grants AG043376 (Projekt 2 und Core A, PDR; Projekt 1 und Core B, LJN) und AG056278 (Projekt 3 und Kern A, PDR; und Projekt 2, LJN) und ein Stipendium der Glenn Foundation (LJN).

Die Verwendung von Tieren wurde vom Scripps Florida Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt.
1. Erzeugung von seneszierendem murinen embryonalen Fibroblasten (MEF) – 12-15 Tage
<ol><li>Isolieren Sie wilden Typ und Ercc1-/- MEFs von trächtigen weiblichen Mäusen am embryonalen Tag 13 (E13) wie zuvor beschrieben33. HINWEIS: Alle folgenden Schritte werden in einer Gewebekulturhaube unter aseptischen Bedingungen und mit sterilen Ins...

SA-A-Gal ist ein klar definierter Biomarker für zelluläre Seneszenz, der ursprünglich von Dimri et al. entdeckt wurde. (1995) zeigt, dass seneszente menschliche Fibroblasten eine erhöhte Aktivität von SA-A-Gal haben, wenn sie bei pH 623 im Vergleich zu sich ausbreitenden Zellen gemessen werden. Inzwischen wurden In-vitro- und In-vivo-Assay für SA-A-Gal für verschiedene Zelltypen und Gewebe25,39,...

Die Zellseneszenz wurde zum ersten Mal von Leonard Hayflick und Paul Moorhead beschrieben, die zeigten, dass normale Zellen eine begrenzte Fähigkeit hatten, sich in Kultur1zu vermehren. Seneszenzzellen vermehren sich trotz des Vorhandenseins von Nährstoffen, Wachstumsfaktoren und mangelnder Kontakthemmung nicht, bleiben aber metabolisch aktiv2. Dieses Phänomen ist als replizierende Seneszenz bekannt und wurde hauptsächlich auf die Telomerverkürzung zurückgeführt, zumindest in menschlichen Zellen3. Weitere Studien haben gezeigt, dass Zellen auch als Reaktion auf andere Reize, wie onkogenen Stress (Onkogeninduzierte Seneszenz, OIS), DNA-Schäden, zytotoxische Medikamente oder Bestrahlung (stressinduzierte Seneszenz, SIS) induziert werden können. , 5 , 6. Als Reaktion auf DNA-Schäden, einschließlich Telomererosion, seneszen die Zellen entweder, beginnen unkontrolliertes Zellwachstum oder erleiden Apoptose, wenn der Schaden nicht repariert werden kann. In diesem Fall scheint die Zellseneszenz vorteilhaft zu sein, da sie tumorsuppressiv wirkt2. Im Gegensatz dazu wird die Seneszenz mit dem Altern aufgrund der Anhäufung von Zellschäden einschließlich DNA-Schäden erhöht. Da seneszente Zellen Zytokine, Metalloproteinasen und Wachstumsfaktoren, die als seneszenzassoziierter sekretomlischer Phänotyp (SASP) bezeichnet werden, sezernieren können, trägt diese altersabhängige Zunahme der zellulären Seneszenz und SASP zu einer verminderten Gewebehomöostase und später altern. Auch ist diese altersabhängige Erhöhung der Seneszenzbelastung bekannt, um Stoffwechselerkrankungen, Stressempfindlichkeit, Progerie-Syndrome und beeinträchtigte Heilung7,8 zu induzieren und ist zum Teil verantwortlich für die zahlreichen altersbedingten Krankheiten wie Arteriosklerose, Arthrose, Muskeldegeneration, Geschwürbildung und Alzheimer-Krankheit9,10,11,12,13. Die Beseitigung seneszierender Zellen kann helfen, Gewebefunktionsstörungen zu verhindern oder zu verzögern und die Gesundheitsspanne14zu verlängern. Dies wurde in transgenen Mausmodellen14,15,16 sowie durch die Verwendung von senolytischen Medikamenten und Arzneimittelkombinationen gezeigt, die sowohl durch Arzneimittelscreenings als auch durch bioinformatische Analyse von Wege, die speziell in seneszierenden Zellen induziert werden17,18,19,20,21,22. Die Identifizierung optimaler senotherapeutischer Medikamente, die in der Lage sind, die seneszente Zellbelastung effektiver zu reduzieren, ist ein wichtiger nächster Schritt bei der Entwicklung von therapeutischen Ansätzen für ein gesundes Altern.
Seneszenzzellen weisen charakteristische phänotypische und molekulare Merkmale auf, sowohl in der Kultur als auch in vivo. Diese Seneszenzmarker können entweder die Ursache oder das Ergebnis der Seneszenzinduktion oder ein Nebenprodukt molekularer Veränderungen in diesen Zellen sein. Es wird jedoch kein einzelner Marker speziell in seneszierenden Zellen gefunden. Derzeit ist der Seneszenz-assoziierte Nachweis von Seneszenz-assoziierten '-Galactosidase (SA---Gal) eine der am besten charakterisierten und etablierten einzelzellbasierten Methoden zur Messung der Seneszenz in vitro und in vivo. SA-A-Gal ist eine lysosomale Hydrolase mit einer optimalen enzymatischen Aktivität bei pH 4. Die Messung der Aktivität am pH 6 ist möglich, da seneszentiver Zellen eine erhöhte lysosomale Aktivität zeigen23,24. Bei lebenden Zellen wird eine erhöhte lysosomale pH-Wert-Taste durch lysosomale Alkalinisierung mit dem Vacuolar H+-ATPase-Inhibitor Bafilomycin A1 oder dem endosomalen Versauerungsinhibitor Chloroquin25,26. 5-Dodecanoylaminofluorescein Di--D-Galactopyranosid (C12FDG) wird als Substrat in lebenden Zellen verwendet, da es das geballte Produkt in den Zellen aufgrund seiner 12 Kohlenstoff lipophilen Moiety25behält. Wichtig ist, dass die SA---Gal-Aktivität selbst nicht direkt mit einem in seneszenten Zellen identifizierten Pfad verbunden ist und nicht notwendig ist, um Seneszenz zu induzieren. Mit diesem Test können seneszente Zellen auch in den heterogenen Zellpopulationen und alternden Geweben identifiziert werden, wie Hautbiopsien von älteren Menschen. Es wurde auch verwendet, um eine Korrelation zwischen Zellseneszenz und Alterung23 zu zeigen, da es ein zuverlässiger Marker für seneszente Zelldetektion in mehreren Organismen und Bedingungenist 27,28,29, 30. Hier wird ein sA--Gal-Screening-Assay mit hohem Durchsatz auf Basis des fluoreszierenden Substrats C12FDG mit primären embryonalen Fibroblasten (MEFs) mit robust oxidativer Stressinduzierter Zellseneszenz beschrieben und seine Vor- und Nachteile werden diskutiert. Obwohl dieser Test mit verschiedenen Zelltypen durchgeführt werden kann, ermöglicht die Verwendung von Ercc1-mangelhaften, DNA-Reparatur beeinträchtigten MEFs eine schnellere Induktion der Seneszenz unter Bedingungen von oxidativem Stress. Bei Mäusen verursacht eine reduzierte Expression der DNA-Reparatur-Endonuklease ERCC1-XPF eine beeinträchtigte DNA-Reparatur, beschleunigte Anhäufung von endogenen DNA-Schäden, erhöhte ROS, mitochondriale Dysfunktion, erhöhte seneszente Zellbelastung, Verlust der Stammzellfunktion und vorzeitige Alterung, ähnlich wie natürliche Alterung31,32. In ähnlicher Weise werden Ercc1-mangelhafte MEFs in Kultur17schneller sensithenz. Ein wichtiges Merkmal des seneszenten MEF-Assays ist, dass jeder Brunnen eine Mischung aus seneszenten und nicht-seneszenten Zellen hat, was eine klare Demonstration von seneszenten zellspezifischen Wirkungen ermöglicht. Obwohl wir glauben, dass die Verwendung von oxidativem Stress in Primärzellen, um Seneszenz zu induzieren, eher physiologisch ist, kann dieser Assay auch mit Zelllinien verwendet werden, bei denen Seneszenz mit DNA-schädlichen Mitteln wie Etoposid oder Bestrahlung induziert wird.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:928px;" width="928">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">DMEM&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Corning</td>
			<td style="width:344px;">10-013-CV</td>
			<td style="width:167px;">medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ham&#39;s F10</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12390-035</td>
			<td style="width:167px;">medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">fetal bovine serum</td>
			<td>Tissue Culture Biologics</td>
			<td>101</td>
			<td style="width:167px;">serum</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1x non-essential amino acids</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-025-Cl</td>
			<td style="width:167px;">amino-acids</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">bafilomycin A1&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B1793</td>
			<td style="width:167px;">lysosomal inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">C12FDG</td>
			<td>Setareh Biotech</td>
			<td>7188</td>
			<td style="width:167px;">b-Gal substrate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hoechst 33342&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H1399</td>
			<td style="width:167px;">DNA intercalation agent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">17DMAG</td>
			<td>Selleck Chemical LLC</td>
			<td>50843</td>
			<td style="width:167px;">HSP90 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">InCell6000 Cell Imaging System</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">High Content Imaging System</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sa-&#946;-galactosidase-based screening assay for the identification of senotherapeutic drugs

Zellseneszenz ist eines der Kennzeichen des Alterns bekannt, um eine gesunde Lebensdauer negativ beeinflussen. Medikamente, die in der Lage sind, seneszente Zellen speziell in der Zellkultur zu töten, als Sennolytika bezeichnet, können die seneszente Zellbelastung in vivo reduzieren und die Gesundheitsspanne verlängern. Mehrere Klassen von Senolytika wurden bisher identifiziert, einschließlich HSP90-Inhibitoren, Bcl-2-Familieninhibitoren, Piperlongumin, einem FOXO4-hemmenden Peptid und der Kombination von Dasatinib/Quercetin. Der Nachweis von SA-A-Gal bei einem erhöhten lysosomalen pH-Wert ist einer der am besten charakterisierten Marker für den Nachweis von seneszenten Zellen. Live-Zellmessungen der seneszenzassoziierten Aktivität von Seneszenz-assoziierten B-Galactosidase (SA---Gal) mit dem fluoreszierenden Substrat C12FDG in Kombination mit der Bestimmung der Gesamtzellzahl mittels eines DNA-interkalierenden Hoechst-Farbstoffs eröffnet Bildschirm auf senotherapeutische Medikamente, die entweder die gesamte SA-A-Gal-Aktivität durch Tötung von seneszenten Zellen (Senestik) reduzieren oder sA--Gal und andere Phänotypen von seneszenten Zellen (Senosozien) unterdrücken. Die Verwendung einer fluoreszierenden Bildaufnahme- und Analyseplattform mit hohem Gehalt ermöglicht das schnelle Screening von Medikamentenbibliotheken mit hohem Durchsatz auf Effekte auf SA--Gal, Zellmorphologie und Zellzahl.

Die SA---Gal-Aktivität kann in Zellen nachgewiesen werden, die durch verschiedene Arten von replizierter Erschöpfung, genotoxischem und oxidativem Stress bis hin zur Onkogenaktivierung23,25,38zur Senesz induziert werden. Im aktuellen Modell mit Ercc1-mangelhaften mausembryonalen Fibroblastenzellen reichtennormoxische Wachstumsbedingungen (20% O2 ) aus, um die Zellseneszenz n...

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SA-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Zelluläre Seneszenz ist der Schlüsselfaktor bei der Entwicklung chronischer altersbedingter Pathologien. Die Identifizierung von Therapeutika, die auf seneszente Zellen abzielen, verspricht, eine gesunde Alterung zu verlängern. Hier präsentieren wir einen neuartigen Test zur Identifizierung von Senotherapeutika auf der Grundlage der Messung der seneszenzassoziierten Galactosidase-Aktivität in Einzelzellen.

SA--Galactosidase-basierter Screening-Test zur Identifizierung von Senotherapeutischen Arzneimitteln

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

Wir beschreiben hier zum ersten Mal eine Methode, die ein hochdurchsatzreiches Arzneimittelscreening auf senotherapeutische Verbindungen ermöglicht, die sich bei alterungsbedingten Erkrankungen als vorteilhaft erwiesen haben. Tatsächlich sind derzeit mehrere klinische Studien mit Medikamenten, die in dieser Essenz getestet wurden, im Gange. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, zwischen zwei Arten von senotherapeutischen Medikamenten, Senolytika und Senomorphika, zu unterscheiden, indem der etablierte Nachweis von SA-beta-Galactosidase in seneszierenden Zellen verwendet wird.Diese Technik ist ein wichtiges Screening-Tool für neuartige senotherapeutische Verbindungen. In der Tat, mehrere Verbindungen, die mit Hilfe dieses Bildschirms identifiziert wurden, sind in verschiedenen hochkarätigen Publikationen vorgestellt, und sind derzeit in klinischen Studien. Diese Technik ist extrem vielseitig und kann an mehrere Bildschirme mit hohem Durchsatz angepasst werden.In der Tat, Es ist möglich, Multiplex-Bildschirme, und Bildschirm für Verbindungen, die Seneszenz über die Aktivierung oder Hemmung eines von mehreren Wegen unterdrücken. Schneiden Sie jeden Embryo in einen Millimeter Stücke und Pfeifen Sie es auf und ab mehrmals. Als nächstes fügen Sie 10 Milliliter Wachstumsmedium zu den Geweben jedes Embryos hinzu.Sie in einem 10-Zentimeter-Kulturgericht verzieren und bei 37 Grad Celsius in 3% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid für zwei bis drei Tage brüten. Und den Rest jedes Embryos mit 0,25%Trypsin-EDTA-Mischung für 10 Minuten inkubieren. Um Zellen zu versuchen, entfernen Sie zuerst vorsichtig das Wachstumsmedium und waschen Sie die Zellen zweimal mit 10 Millilitern 1X PBS.Fügen Sie dann zwei Milliliter einer 025 Trypsin EDTA-Lösung zu den Zellen hinzu und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius für zwei bis drei Minuten. Überprüfen Sie anschließend die Zellen unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellen von der Oberfläche getrennt sind. Fügen Sie die gleiche Menge an Wachstumsmedium hinzu, um die Trypsin-Verdauung zu beenden, und übertragen Sie die Zellen in eine konische Röhre.Zentrifugieren Sie dann die Zellen bei 200 mal G für drei Minuten. Entsorgen Sie den Überstand, und fügen Sie frisches Wachstumsmedium hinzu, um die Zellen wieder auszusetzen. Als Nächstes zählen Sie die Zellen und säen sie in neuen Platten bei der projizierten Zelldichte aus.Bei nicht-senesenter Subkultivierung zunächst die konfluenten Zellen im Verhältnis eins zu vier. Dann brüten Zellen bei 37 Grad Celsius in 3%Sauerstoff und 5% Kohlendioxid für einen anderen Durchgang zu verlängern. Um die Zellseneszenz zu induzieren, spaltet der Samen die konfluenten Zellen von Durchgang eins im Verhältnis eins zu vier und inkubiert sie drei Tage lang bei 37 Grad Celsius in 20% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid- und 5%Kohlendioxid-Umgebung.Um die zelluläre Seneszenz mit einem fortschrittlichen Coulter Cell Counter-System zu überwachen, messen Sie die allmähliche Zunahme des Zelldurchmessers und des Zellvolumens während jedes Trypsinisierungsschritts. Um mit dem Beta-Gal-Screening-Assay zu beginnen, samen 5 000 seneszente Zellen oder 3.000 nicht-seneszierende Zellen pro Brunnen in 96 Brunnenplatten. Dann fügen Sie 100 Mikroliter Wachstumsmedium zu jedem Brunnen und inkubieren Zellen bei 37 Grad Celsius und 20% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid für sechs Stunden.Als nächstes fügen Sie den MEF-Zellen Arzneimittelverdünnungen hinzu und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in 20 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid für 24 bis 48 Stunden. Nach der Inkubation entfernen Sie die Arzneimittellösung und waschen Sie Zellen mit 100 Mikroliter1X PBS. Um eine lysosomale Alkalinisierung zu induzieren, behandeln Sie Zellen mit 90 Mikroliter bafilomycin A1-Lösung, verdünnt in frischzelligen Kulturmedium in einer Endkonzentration von 100 Nanomolar.Dann inkubieren Zellen bei 37 Grad Celsius in 20% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid-Umgebung für eine Stunde. Für die Fluoreszenzanalyse der SA-beta-Gal-Aktivität, machen Sie eine frische Arbeitslösung von C12FDG in Wachstumsmedium verdünnt, bei einer Endkonzentration von 100 Mikromolar. Dann fügen Sie 10 Mikroliter der Arbeitslösung in das Kulturmedium bei einer Endkonzentration von 10 Mikromolaren hinzu und inkubieren Sie Zellen bei 37 Grad Celsius in 20% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid für zwei Stunden.Waschen Sie Zellen mit 100 Mikroliter 1X PBS. Als nächstes fügen Sie zwei Mikroliter eines 100 Mikrogramm pro Milliliter Hoechst 33342 Farbstoffs bei einer Endkonzentration von zwei Mikrogramm pro Milliliter hinzu. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius, 20% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid für 20 Minuten.Nach der Inkubation entfernen Sie die Medien, fügen Sie 100 Mikroliter frisches Wachstumsmedium hinzu und gehen Sie zur Bildgebung über. In dieser Studie ermöglichte eine hochgehaltige fluoreszierende Bildaufnahme- und Analyseplattform die Identifizierung von senolytischen Medikamenten, wie z. B. 17-DMAG, die die gesamten SA-Beta-Gal-Aktivitäten in murinen embryonalen Fibroblastenzellkulturen reduzierten, die seneszierende Zellen in Durchgang fünf enthielten. Die softwaregenerierten quantitativen Analysen von Mischungen von seneszenten und nicht-seneszenten Zellen ermöglichen eine klare Demonstration seneszenenter zellspezifischer Effekte und die Eliminierung der Beta-Galactosidase-Aktivität im Hintergrund durch Bafilomycin A. Stellen Sie sicher, dass alle notwendigen Zellsteuerungen enthalten sind, insbesondere unbehandelte seneszente Zellen und seneszente Zellen, die mit einer positiven Kontrolle behandelt werden.Dieser Aufsatz beinhaltet die Arbeit mit Primärzellen unter oxidativem Stress, was zu Variationen führen kann, die überwacht werden müssen. Dieses Verfahren ist der erste Schritt beim Nachweis von senotherapeutischen Medikamenten. Zur Bestätigung der Screening-Ergebnisse müssen zusätzliche Zelllebensfähigkeit und zellseneszierende Essays durchgeführt werden.Mehrere neue senolytische Medikamente wurden mit diesem Aufsatz nachgewiesen, einschließlich der ersten senolytischen Arzneimittelkombination Dasatinib Quercetin, Hitzeschockprotein 90-Inhibitoren, Bcl-2-Familieninhibitoren und dem Polyphenol-Fisetin.

Research

JoVE Journal

Biology

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

Identifikation und Analyse von Maus Erythroid Vorläufern mit dem CD71/TER119 Durchflusszytometrische Assay

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

Forschung

Biologie

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Fluoreszenz-Mikroskopie Screening und Next-Generation-Sequencing: Nützliche Tools für die Identifizierung von Genen in den Organellen Integrität beteiligt

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