Name: sa-&#946;-galactosidase-based screening assay for the identification of senotherapeutic drugs
Uploaded: 2019-06-28T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about SA-ÃŽÂ²-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי NIH מענקים AG043376 (פרויקט 2 ו-Core A, PDR; פרוייקט 1 ו-Core B, LJN) ו-AG056278 (פרוייקט 3 ו-Core A, PDR; ו-Project 2, LJN) ומענק מקרן גלן (LJN).

השימוש בבעלי חיים אושר על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים שסקריפס פלורידה והשימוש.
1. הדור של המחלמה עובריים מתחלקים (MEF) – 12-15 ימים
<ol><li>לבודד את סוג פראי ו Ercc1-/- mefs מתוך עכברים נשים בהריון ביום העובריים 13 (E13) כמתואר בעבר33. הערה: כל השלבים הבאים מ?...

SA-β-Gal הוא ביואריקר מוגדר היטב עבור הזדקנות הסלולר התגלתה במקור על ידי Dimri et al. (1995) מראה כי שהפיצוצים האנושיים הסחיים יש להגדיל את הפעילות של SA-β-Gal כאשר העלה ב-pH 623 לעומת תאים מתרבים. בינתיים, בתוך מבחנה ובvivo של SA-β-Gal הוקמו עבור סוגי תאים שונים ורקמות25,<sup clas...

הזדקנות תאית תוארה בפעם הראשונה על ידי ליאונרד הייפליק ו פול מורהד, אשר הראה כי תאים נורמליים יש יכולת מוגבלת להתרבות בתרבות1. תאי הסנקו אינם מתרבים למרות הנוכחות של חומרים מזינים, גורמי גדילה וחוסר במגע מעכבות, אבל להישאר metabolically פעיל2. תופעה זו ידועה בתור הזדקנות מחודשת והיא יוחסה בעיקר לקיצור טלומר, לפחות בתאים אנושיים3. מחקרים נוספים הראו כי התאים יכולים גם להיות המושרה לעבור הזדקנות בתגובה גירויים אחרים, כגון הלחץ אונגניים (אוננציה המושרה, או), נזק לדנ א, תרופות ציטוטוקסיים, או הקרנה (הנגרמת באופן מלחיץ, SIS)4 , מיכל 5 , 6. בתגובה לנזק לדנ א, כולל הסחף טלומר, תאים מאוהים, להתחיל צמיחת תאים בלתי מבוקרת, או לעבור אפופטוזיס אם הנזק לא ניתן לתקן. במקרה זה, הזדקנות התא נראה מועיל כפי שהוא פועל בצורה מדכאים הגידול2. לעומת זאת, הזדקנות מוגברת עם ההזדקנות בשל הצטברות של נזק הסלולר כולל נזק לדנ א. מאז התאים הסננסלי יכול להפריש ציטוקינים, מטאלופרוטאינסים וגורמי גדילה, כינה את האג הסודי הקשור הפרשה (sasp), זו עלייה בגיל תלוי בתקופת הזדקנות הסלולר sasp תורמת הומאוסטזיס רקמות ירידה ו לאחר מכן הזדקנות. כמו כן, גידול זה תלוי גיל בנטל הזדקנות ידוע לגרום מחלות מטבולית, רגישות למתח, תסמונות פרוגריה, לקויי ריפוי7,8 והוא, בין השאר, אחראי על רבים הקשורים לגיל מחלות, כגון טרשת עורקים, אוסטיאוארתריטיס, ניוון שרירים, היווצרות כיב, ומחלת אלצהיימר9,10,11,12,13. ביטול תאים senescent יכול לעזור למנוע או לעכב את תפקוד הרקמה ולהאריך את בריבן14. זה הוצג במודלים העכבר הטרנסגניים14,15,16 , כמו גם באמצעות תרופות ושילובי סמים שנתגלו באמצעות מאמצי סינון סמים וניתוח ביולוגי של מסלולים המושרה במיוחד בתאי הס,17,18,19,20,21,22. זיהוי התרופות הטיפוליות האופטימליות יותר, היכולת לצמצם ביעילות רבה יותר את הנטל החיצוני של התא, הוא השלב הבא חשוב בפיתוח גישות טיפוליות להזדקנות בריאה.
התאים הסנאריים מציגים תכונות פנוטיטיות ומולקולריות אופייניות, הן בתרבות והן בvivo. אלה סמנים הזדקנות יכול להיות הגורם או תוצאה של אינדוקציה הזדקנות או תוצר לוואי של שינויים מולקולריים בתאים אלה. עם זאת, אף סמן יחיד לא נמצא באופן ספציפי בתאי הסנקו. כיום, זיהוי הβ-גלטוסידאז (SA-β-Gal) הוא אחד השיטות המבוססות על תאים בודדים ומבוססות-תא יחיד למדידת הזדקנות בתוך מבחנה ובvivo. SA-β-גל הוא הידרוקלז ליסוזומל עם פעילות אנזימטית אופטימלית ב-pH 4. מדידת פעילותה ב-pH 6 אפשרי מכיוון שתאי הסנסזים מראים פעילות ליזוזומלית מוגברת23,24. עבור תאים חיים, pH מוגברת ליזוזומל מושגת על ידי ליסוזומיום המלחה עם וולאואר H+-atpase מעכבי Bafilomycin A1 או אנדוזומחמצה מעכבי ככלורוקין25,26. 5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-גלפטוטוסייד (C12fdg) משמש מצע בתאי החיים כפי שהוא שומר על מוצר ביקע בתאים בשל 12 הפחמן ליפופילית moiety25. חשוב לעשות זאת, SA-β-Gal הפעילות עצמה אינה מחוברת ישירות עם כל מסלול מזוהה בתאי הסנקו והוא אינו נחוץ כדי לגרום הזדקנות. בעזרת שיטת הפעולה הזאת, ניתן לזהות את תאי הסנסאלים גם באוכלוסיות הטרוגניות וברקמות ההזדקנות, כגון ביופסיות עור מאנשים מבוגרים. זה גם שימש כדי להראות מתאם בין הזדקנות התא ההזדקנות23 כפי שהוא סמן אמין עבור זיהוי תא הסננסאס במספר אורגניזמים ותנאים27,28,29, . בסדר, 30 כאן, התפוקה הגבוהה SA-β-Gal הקרנת מבוסס על מצע פלורסנט C12fdg באמצעות העכבר הראשי מעובריים מתחלקים (mefs) עם לחץ חמצוני הנגרמת על ידי הזדקנות התא מתוארת היתרונות והחסרונות שלה נדונים. למרות שניתן לבצע את התיקון הזה עם סוגים שונים של תאים, השימוש Ercc1-לקוי, DNA תיקון לקוי mefs מאפשר אינדוקציה מהירה יותר של הזדקנות בתנאים של לחץ חמצוני. בעכברים, ביטוי מופחת של תיקון ה-dna endonuclease ERCC1-xpf גורם לקויי dna תיקון, הצטברות מואצת של נזק dna אנדוסוגני, מוגבה ROS, בתפקוד מיטוכונדריאלי, מוגברת נטל תא העין, אובדן תפקוד תא גזע ו הזדקנות מוקדמת, דומה להזדקנות טבעית31,32. באופן דומה, Ercc1-mefs לקוי לעבור הזדקנות במהירות רבה יותר בתרבות17. תכונה חשובה של שיטת ה-MEF של הארגון היא שבכל החדרים יש שילוב של תאים מיוחדים ובלתי-מוגדרים, ומאפשרים הדגמה ברורה של השפעות מיוחדות לתאים. עם זאת, למרות שאנו מאמינים כי השימוש בלחץ חמצוני בתאים הראשוניים כדי לגרום הזדקנות הוא פיזיולוגי יותר, שיטת זה גם ניתן להשתמש עם קווי התא שבו הזדקנות המושרה עם סוכני DNA נזק כמו etפאות או הקרנה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:928px;" width="928">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">DMEM&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Corning</td>
			<td style="width:344px;">10-013-CV</td>
			<td style="width:167px;">medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ham&#39;s F10</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12390-035</td>
			<td style="width:167px;">medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">fetal bovine serum</td>
			<td>Tissue Culture Biologics</td>
			<td>101</td>
			<td style="width:167px;">serum</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1x non-essential amino acids</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-025-Cl</td>
			<td style="width:167px;">amino-acids</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">bafilomycin A1&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B1793</td>
			<td style="width:167px;">lysosomal inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">C12FDG</td>
			<td>Setareh Biotech</td>
			<td>7188</td>
			<td style="width:167px;">b-Gal substrate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hoechst 33342&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H1399</td>
			<td style="width:167px;">DNA intercalation agent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">17DMAG</td>
			<td>Selleck Chemical LLC</td>
			<td>50843</td>
			<td style="width:167px;">HSP90 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">InCell6000 Cell Imaging System</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">High Content Imaging System</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sa-&#946;-galactosidase-based screening assay for the identification of senotherapeutic drugs

הזדקנות התא הוא אחד הסימנים ההיכר של ההזדקנות ידוע להשפיע על תוחלת חיים בריאה. תרופות מסוגל להרוג תאים senescent במיוחד בתרבות התא, כינה senolytics, יכול להפחית את הנטל התא הסנאני בvivo ולהאריך את ברינספנה. מספר מחלקות של senolytics זוהו עד כה כולל HSP90 מעכבי, Bcl-2 מעכבי משפחה, piperlongumine, פפטיד FOXO4 מעכבות ושילוב של Dasatinib/Quercetin. זיהוי של SA-β-Gal ב-pH מוגברת למטה הוא אחד הסמנים המאופיינת הטוב ביותר לזיהוי של תאים הסנאים. מדידות התאים הβ-גלטוסידאז (SA-β-Gal) באמצעות מצע הפלורסנט C12fdg בשילוב עם קביעת מספר התאים הכולל באמצעות הצבע המשולב DNA שפותח את האפשרות ל מסך עבור תרופות senotherapeutic המקטינה את הפעילות הכוללת של SA-β-Gal על-ידי הריגת תאים סנסטיים (senotherapeutic) או על-ידי דיכוי SA-β-Gal ופנוטיפים אחרים של תאים סנסטיים (senomמורקס). שימוש בפלטפורמת הרכישה והניתוח של תמונת פלורסנט באיכות גבוהה מאפשר הקרנת תפוקה מהירה וגבוהה של ספריות תרופות לאפקטים ב-SA-β-Gal, מורפולוגיה של תאים ומספר תאים.

הפעילות SA-β-Gal ניתן לזהות בתאים המושרה על ידי דרכים שונות של תשישות replicative ומתח חמצון, כדי אונאוגן ההפעלה23,25,38. במודל הנוכחי באמצעות Ercc1-לקוי העכבר העובריים תאים, normoxic תנאי הצמיחה (20% O2) היו מספיקים כדי לגרום הזדק?...

Watch this Scientific Journal Video about SA-ÃŽÂ²-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs at JoVE.com

SA-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

הזדקנות תאית היא הגורם העיקרי בפיתוח של הפתווגיות הקשורות לגיל כרונית. זיהוי של הtherapeutics שתאי היעד מציגים הבטחה להרחבת הזדקנות בריאה. כאן, אנו מציגים את הבקשה הרומן על המסך לזיהוי של senotherapeutics מבוסס על מדידה של פעילות ביולוגית β-גלטוסידאז הקשורים בתאים בודדים.

א-β-גלטוסידאז-מבוסס על הקרנת ההקרנה לזיהוי תרופות הסאותרפיה

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

אנו מתארים כאן לראשונה שיטה המאפשרת הקרנת תרופות בתפוקה גבוהה עבור תרכובות senotherapeutic אשר הוכחו להיות מועיל במחלות הקשורות להזדקנות. למעשה, מספר ניסויים קליניים עם תרופות שנבדקו במהות זו נמשכים כעת. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא להבחין בין שני סוגים של תרופות senotherapeutic, סנוליטיקה וסנומורפיה, באמצעות גילוי מבוסס היטב של SA-בטא-Galactosidase בתאים senescent.טכניקה זו היא כלי הקרנה חשוב עבור תרכובות senotherapeutic הרומן. למעשה, מספר תרכובות שזוהו בעזרת מסך זה מוצגות בפרסומים שונים בעלי פרופיל גבוה, וכיום נמצאות בניסוי קליני. טכניקה זו היא רב-תכליתית ביותר, וייתכן שתותאם למספר מסכי תפוקה גבוהה.למעשה, זה אפשרי מסכי מולטיפלקס, ומסך עבור תרכובות לדכא senescence באמצעות הפעלה או עיכוב של אחד מכמה מסלולים. טחון כל עובר לחתיכות מילימטר אחד צינור אותו למעלה ולמטה מספר פעמים. לאחר מכן, להוסיף 10 מיליליטר של צמיחה בינוני לרקמות של כל עובר.צלחת אותם בצלחת תרבות 10 ס"מ, ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס ב 3% חמצן ו 5% פחמן דו חמצני במשך יומיים עד שלושה ימים. ו דגירה שאר העובר עם 0.25% טריפסין EDTA תערובת במשך 10 דקות. כדי לנסות את התאים, הראשון, להסיר בזהירות את מדיום הצמיחה ולשטוף את התאים עם 10 מיליליטר של 1X PBS פעמיים.לאחר מכן, מוסיפים שני מיליליטר של פתרון EDTA טריפסין 025 לתאים, ו דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס במשך שתיים עד שלוש דקות. לאחר מכן, בדוק את התאים מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים מנותקים מפני השטח. הוסף את אותה כמות של מדיום צמיחה כדי לסיים את העיכול טריפסין, ולהעביר את התאים צינור חרוט.לאחר מכן, צנטריפוגה התאים ב 200 פעמים G במשך שלוש דקות. השלך את העל-טבעי והוסף מדיום צמיחה טרי כדי להשעות מחדש את התאים. לאחר מכן, ספור את התאים וזרע אותם בצלחות חדשות בצפיפות התאים המוקרנת.עבור תת-תרבות לא חושית, ראשית, פצל תאים נוחים ביחס של 1 עד 4. ואז דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 3%חמצן ו 5% פחמן דו חמצני כדי להרחיב למעבר אחר. לאחר מכן, כדי לגרום לחוש בתאים, זרע לפצל תאים confluent ממעבר אחד ביחס של אחד עד ארבעה דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס ב 20%חמצן ו 5% פחמן דו חמצני הסביבה במשך שלושה ימים.כדי לנטר את הרגישות התאית, באמצעות מערכת מתקדמת של מונה תאי קולטר, למדוד את הגידול ההדרגתי בקוטר התא ובנפח התאים במהלך כל שלב של טריפסיוניזציה. כדי להתחיל בדיקות סינון בטא-גל, זרע 5, 000 תאים senescent או 3, 000 תאים שאינם senescent לגם ב 96 צלחות היטב. לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של צמיחה בינוני לכל באר תאים דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 20% חמצן ו 5% פחמן דו חמצני במשך שש שעות.לאחר מכן, להוסיף דילול תרופות לתאי MEF ולהידגר את התאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 20%חמצן ו 5%פחמן דו חמצני במשך 24 עד 48 שעות. לאחר הדגירה, להסיר את פתרון התרופה ולשטוף תאים עם 100 microliters של 1X PBS. כדי לגרום אלקליניזציה lysosomal, מראש לטפל בתאים עם 90 microliters של פתרון Bafilomycin A1, מדולל בינוני תרבות תאים טריים בריכוז סופי של 100 ננומולרים.לאחר מכן, דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 20% חמצן ו 5% פחמן דו חמצני הסביבה במשך שעה. לניתוח פלואורסצנטי של פעילות SA-beta-Gal, יש ליי לעשות פתרון עבודה טרי של C12FDG מדולל במדיום הצמיחה, בריכוז סופי של 100 מיקרומולרים. לאחר מכן, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של פתרון העבודה למדיום התרבות בריכוז סופי של 10 מיקרומולרים, ודגירה של תאים ב-37 מעלות צלזיוס ב-20% חמצן ו-5% פחמן דו-חמצני למשך שעתיים.לשטוף תאים עם 100 microliters של 1X PBS. לאחר מכן, להוסיף שני microliters של 100 מיקרוגרם למיליליטר Hoechst 33342 צבע בריכוז סופי של שני מיקרוגרם למיליליטר. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 20% חמצן, ו 5% פחמן דו חמצני במשך 20 דקות.לאחר הדגירה, הסר את המדיה, הוסף 100 מיקרוליטרים של מדיום צמיחה טרי, והמשך להדמיה. במחקר זה, פלטפורמת רכישה וניתוח של תמונות פלואורסצנטיות בתכנים גבוהים אפשרה זיהוי של תרופות סנוליטיות, כגון 17-DMAG, שהפחיתו את הפעילות הכוללת של SA-beta-Gal בתרבויות תאים פיברובלסט עובריות מורין המכילות תאים senescent במעבר חמש. ניתוחים כמותיים שנוצרו על ידי תוכנה של תערובות של תאים senescent ולא senescent לאפשר הדגמה ברורה של אפקטים ספציפיים לתא senescent, וחיסול של פעילות בטא גלקטוזידאז ברקע על ידי bafilomycin A.לוודא את כל פקדי התא הדרושים כלולים, במיוחד תאים senescent מטופלים ותאים senescent מטופלים עם שליטה חיובית.מאמר זה כולל עבודה עם תאים ראשוניים תחת סטרס חמצוני, אשר יכול להוביל וריאציה כי צריך להיות במעקב. הליך זה הוא הצעד הראשון בזיהוי תרופות senotherapeutic. כדאי לבצע חיבורי כדאיות תאים וחושים נוספים כדי לאשר את תוצאות ההקרנה.מספר תרופות סנוליטיות חדשות זוהו באמצעות מאמר זה, כולל שילוב התרופות הסנוליטיות הראשון dasatinib quercetin, חלבון הלם חום 90 מעכבי, מעכבי משפחת Bcl-2, ואת fisetin פוליפנול.

Research

JoVE Journal

Biology

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

זיהוי וניתוח של אבות עכבר Erythroid באמצעות CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

פלואורסצנטי, מיקרוסקופ הקרנת ואת הדור הבא הרצף: כלים שימושיים לזיהוי גנים המעורבים אברון Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

Assay הקרנת פלורסנט לזיהוי מאפננים של ערוצים GIRK

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

זיהוי לאחר translational השינויים של קומפלקסי חלבוני צמח

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

RNA Catalyst ככתב להקרנת סמים נגד RNA עריכה בtrypanosomes

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

זיהוי של זוגות קינאז-מצע שימוש הקרנת תפוקה גבוהה


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

הכרומטין immunoprecipitation Assay עבור זיהוי של אינטראקציות החלבון-דנ&quot;א ארבידופסיס<em&gt; In vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

זיהוי של הרגולטורים הרומן של דיות צמח על ידי הקרנת הדמיה תרמית בקנה מידה גדול בהליוציץ השנתי

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

באתרו היברידיזציה עבור סיפונקולוס נודוס מנוזל קואוממית

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. ...