Name: sa-&#946;-galactosidase-based screening assay for the identification of senotherapeutic drugs
Uploaded: 2019-06-28T14:30:00
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Questo lavoro è stato sostenuto da NIH Grants AG043376 (Progetto 2 e Core A, PDR; Progetto 1 e Core B, LJN) e AG056278 (Progetto 3 e Core A, PDR; e Project 2, LJN) e una sovvenzione della Glenn Foundation (LJN).

L'uso degli animali è stato approvato dallo Scripps Florida Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Generazione di fibroblasto embrionale murino senescente (MEF) – 12-15 giorni
<ol><li>Isolare il tipo selvaggio e Ercc1-/- MEF da topi femmine in gravidanza alla giornata embrionale 13 (E13) come descritto in precedenza33. NOTA: Tutti i seguenti passaggi vengono eseguiti in una cappa di coltura tissutale in condizioni asettiche e utilizz...

È un biomarcatore ben definito per la senescenza cellulare originariamente scoperto da Dimri et al. (1995) dimostrando che i fibroblasti umani senescenti hanno aumentato l'attività di SA-z-Gal se sono stati analisi al pH 623 rispetto alle cellule che proliferano. Nel frattempo, in vitro e in vivo sono stati stabiliti saggi per SA-z-Gal per diversi tipi di cellule e tessuti25,39,40. Il metodo a ...

La senescenza cellulare è stata descritta per la prima volta da Leonard Hayflick e Paul Moorhead, che hanno dimostrato che le cellule normali avevano una capacità limitata di proliferare nella coltura1. Le cellule senescenti non riescono a proliferare nonostante la presenza di nutrienti, fattori di crescita e mancanza di inibizione del contatto, ma rimangono metabolicamente attivi2. Questo fenomeno è noto come senescenza replicativa ed è stato attribuito principalmente all'accorciamento dei telomeri, almeno nelle cellule umane3. Ulteriori studi hanno dimostrato che le cellule possono anche essere indotte a subire senescenza in risposta ad altri stimoli, come lo stress oncogenico (senescenza indotta dall'oncogeno, OIS), danni al DNA, farmaci citotossici o irradiazione (senescenza indotta dallo stress, SIS)4 , 5 Del numero 3( , 6. In risposta al danno del DNA, compresa l'erosione dei telomeri, le cellule possono senescere, iniziano la crescita cellulare incontrollata o subiscono l'apoptosi se il danno non può essere riparato. In questo caso, la senescenza cellulare sembra essere utile in quanto agisce in modo repressivo tumorale2. Al contrario, la senescenza è aumentata con l'invecchiamento a causa dell'accumulo di danni cellulari tra cui il danno al DNA. Poiché le cellule senescenti possono secernere citochine, proteinasi di metallo e fattori di crescita, chiamato fenotipo secretoria associato alla senescenza (SASP), questo aumento dipendente dall'età della senescenza cellulare e sAS contribuisce alla diminuzione dell'omeostasi del tessuto e successivamente l'invecchiamento. Inoltre, questo aumento dipendente dall'età del carico di senescenza è noto per indurre malattie metaboliche, sensibilità allo stress, sindromi di progeria e guarigione alterata7,8 ed è, in parte, responsabile delle numerose età-correlati malattie, come l'aterosclerosi, l'osteoartrite, la degenerazione muscolare, la formazione di ulcere e il morbo di Alzheimer9,10,11,12,13. Eliminare le cellule senescenti può aiutare a prevenire o ritardare la disfunzione tissutale ed estendere la durata di salute14. Ciò è stato dimostrato nei modelli murini transgenici14,15,16, nonché utilizzando farmaci senolitici e combinazioni di farmaci che sono stati scoperti sia attraverso gli sforzi di screening farmacologico che l'analisi bioinformatica di percorsi indotti specificamente nelle cellule senescenti17,18,19,20,21,22. Identificare farmaci senoteri ottimali, in grado di ridurre in modo più efficace l'onere cellulare senescente, è un importante passo avanti nello sviluppo di approcci terapeutici per un invecchiamento sano.
Le cellule senescenti mostrano caratteristiche fenotipiche e molecolari caratteristiche, sia in coltura che in vivo. Questi marcatori di senescenza potrebbero essere la causa o il risultato dell'induzione della senescenza o un sottoprodotto dei cambiamenti molecolari in queste cellule. Tuttavia, nessun singolo marcatore si trova specificamente nelle cellule senescenti. Attualmente, il rilevamento associato alla senescenza con la galactosidase (SA-z-Gal) è uno dei metodi basati su una singola cellula più caratterizzati e consolidati per misurare la senescenza in vitro e in vivo. L'idrolasi lisosomia con un'attività enzimatica ottimale al pH 4 è un idrolasi lisoso. Misurare la sua attività al pH 6 è possibile perché le cellule senescenti mostrano una maggiore attività lisosomica23,24. Per le cellule viventi, l'aumento del pH lisosomiale si ottiene con alcalinizzazione lisosomica con il vacuolar H-L'inibitore di A!mycin A1 o l'inibitore dell'acidificazione endosomica cloroquine25,26. 5-Dodecanoylaminofluorescein Di-C12FDG) viene utilizzato come substrato nelle cellule viventi in quanto mantiene il prodotto fessurato nelle cellule a causa della sua moiety25lipofilica al carbonio. È importante sottolineare che l'attività SA-z-Gal stessa non è direttamente collegata ad alcuna via identificata nelle cellule senescenti e non è necessaria per indurre la senescenza. Con questo test, le cellule senescenti possono essere identificate anche nelle popolazioni cellulari eterogenee e nei tessuti di invecchiamento, come le biopsie cutanee di individui più anziani. E 'stato utilizzato anche per mostrare una correlazione tra senescenza cellulare e invecchiamento23 in quanto è un marcatore affidabile per il rilevamento delle cellule senescenti in diversi organismi e condizioni27,28,29, 30. In questo caso, viene descritto un saggio di screening SA-z-Gal ad alta produttività basato sul substrato fluorescente C12FDG che utilizza fibroblasti embrionali primari (MEF) con senescenza cellulare indotta dallo stress fortemente ossidativo e dei suoi vantaggi e svantaggi sono discussi. Anche se questo saggio può essere eseguito con diversi tipi di cellule, l'uso di Ercc1-deficient, DNA riparazione COMme compromessa consente una più rapida induzione di senescenza in condizioni di stress ossidativo. Nei topi, l'espressione ridotta dell'endonuclease del DNA endaccleatta ERCC1-XPF causa una riparazione compromessa del DNA, un accumulo accelerato di danni endogeni del DNA, ROS elevato, disfunzione mitocondriale, aumento del carico di cellule senescenti, perdita della funzione delle cellule staminali e invecchiamento precoce, simile all'invecchiamento naturale31,32. Allo stesso modo, i MEF carenti di Ercc1subiscono più rapidamente la senescenza nella cultura17. Una caratteristica importante del saggio SENescente MEF è che ogni pozzo ha una miscela di cellule senescenti e non senescenti, consentendo la chiara dimostrazione di effetti senescenti specifici delle cellule. Tuttavia, anche se crediamo che l'uso dello stress ossidativo nelle cellule primarie per indurre la senescenza sia più fisiologico, questo saggio può essere utilizzato anche con linee cellulari in cui la senescenza è indotta da agenti dannosi del DNA come l'etoposide o l'irradiazione.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:928px;" width="928">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">DMEM&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Corning</td>
			<td style="width:344px;">10-013-CV</td>
			<td style="width:167px;">medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ham&#39;s F10</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12390-035</td>
			<td style="width:167px;">medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">fetal bovine serum</td>
			<td>Tissue Culture Biologics</td>
			<td>101</td>
			<td style="width:167px;">serum</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1x non-essential amino acids</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-025-Cl</td>
			<td style="width:167px;">amino-acids</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">bafilomycin A1&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B1793</td>
			<td style="width:167px;">lysosomal inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">C12FDG</td>
			<td>Setareh Biotech</td>
			<td>7188</td>
			<td style="width:167px;">b-Gal substrate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hoechst 33342&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H1399</td>
			<td style="width:167px;">DNA intercalation agent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">17DMAG</td>
			<td>Selleck Chemical LLC</td>
			<td>50843</td>
			<td style="width:167px;">HSP90 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">InCell6000 Cell Imaging System</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">High Content Imaging System</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sa-&#946;-galactosidase-based screening assay for the identification of senotherapeutic drugs

La senescenza cellulare è uno dei segni distintivi dell'invecchiamento noto per influenzare negativamente una vita sana. I farmaci in grado di uccidere le cellule senescenti specificamente nella coltura cellulare, chiamato senolitico, possono ridurre il carico di cellule senescenti in vivo ed estendere la salute. Diverse classi di senolitica sono state identificate fino ad oggi, tra cui inibitori HSP90, inibitori della famiglia Bcl-2, piperlongumine, un peptide inibitorio FOXO4 e la combinazione di Dasatinib/Quercetin. La rilevazione di SA-z-Gal in un pH lisonico aumentato è uno dei migliori marcatori caratterizzati per la rilevazione di cellule senescenti. Le misurazioni delle cellule vive dell'attività di senescenza associati alla galactosidasi (SA-z-Gal) utilizzando il substrato fluorescente C12FDG in combinazione con la determinazione del numero totale di cellule utilizzando un colorante Hoechst intercalante del DNA apre la possibilità di schermo per i farmaci senoteri che riducono l'attività complessiva di SA-z-Gal uccidendo cellule senescenti (senolytica) o sopprimendo SA-z-Gal e altri fenotipi delle cellule senescenti (senomorfici). L'uso di una piattaforma di acquisizione e analisi di immagini fluorescenti ad alto contenuto consente di uno screening rapido e ad alto consumo delle librerie di farmaci per gli effetti sulla SA-z-Gal, la morfologia cellulare e il numero di cellule.

L'attività di SA-z-Gal può essere rilevata in cellule che sono indotte a senescenza da vari modi da esaurimento replicativo, stress genotossico e ossidativo, all'attivazione dell'oncogene23,25,38. Nell'attuale modello che utilizza le cellule fibroblaste embrionali di Ercc1- carenti, le condizioni di crescita normossiche (20% O2) erano sufficienti a indurre la senescenza cell...

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SA-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

La senescenza cellulare è il fattore chiave nello sviluppo di patologie croniche legate all'età. L'identificazione delle terapie che colpisce le cellule senescenti è promettente per estendere l'invecchiamento sano. Qui, presentiamo un nuovo saggio da vagliare per l'identificazione delle senoterapie sulla base della misurazione dell'attività di senescenza associata a z-Galactosidase in singole cellule.

Saggio di screening basato su SA-Galactosidase per l'identificazione dei farmaci senoterapici

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

Descriviamo qui per la prima volta un metodo che consente lo screening farmacologico ad alta produttività per i composti senoterapici che si sono dimostrati benefici nelle malattie legate all'invecchiamento. In effetti, diversi studi clinici con farmaci testati in questa essenza sono attualmente in corso. Il principale vantaggio di questa tecnica è distinguere tra due tipi di farmaci senoterapici, senolitici e senomorfi, utilizzando il ben consolidato rilevamento della SA-beta-Galattosidasi nelle cellule senescenti.Questa tecnica è un importante strumento di screening per nuovi composti senoterapici. In effetti, diversi composti che sono stati identificati con l'aiuto di questo schermo sono presenti in varie pubblicazioni di alto profilo e sono attualmente in sperimentazione clinica. Questa tecnica è estremamente versatile e può essere adattata a diversi schermi ad alta produttività.In effetti, è possibile schermi multiplex e schermo per composti che sopprimono la senescenza attraverso l'attivazione o l'inibizione di una delle diverse vie. Tritare ogni embrione in pezzi di un millimetro e condirlo su e giù più volte. Successivamente, aggiungere 10 millilitri di mezzo di crescita ai tessuti di ogni embrione.Placcarli in un piatto di coltura di 10 centimetri e incubarli a 37 gradi Celsius in ossigeno al 3% e 5% di anidride carbonica per due o tre giorni. E incubare il resto di ogni embrione con una miscela EDTA allo 0,25% di tripsideina per 10 minuti. Per tripinare le cellule, in primo luogo, rimuovere con cura il mezzo di crescita e lavare le cellule con 10 millilitri di 1X PBS due volte.Quindi, aggiungere due millilitri di una soluzione EDTA di 025 tripina alle cellule e incubarli a 37 gradi Celsius per due o tre minuti. Quindi, ispezionare le cellule al microscopio per assicurarsi che le cellule siano staccate dalla superficie. Aggiungere la stessa quantità di mezzo di crescita per terminare la digestione della tripina e trasferire le cellule in un tubo conico.Quindi, centrifugare le cellule a 200 volte G per tre minuti. Scartare il supernatante e aggiungere un nuovo mezzo di crescita per sospendere di nuovo le celle. Quindi, contare le cellule e seminarle in nuove piastre alla densità cellulare proiettata.Per la subcoltivazione non senescente, in primo luogo, dividere le cellule confluenti con un rapporto uno-a-quattro. Quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius in 3% di ossigeno e 5% di anidride carbonica per estendersi per un altro passaggio. Successivamente, per indurre la senescenza cellulare, i semi dividono le cellule confluenti dal passaggio uno a un rapporto da uno a quattro e le incubano a 37 gradi Celsius nel 20% di ossigeno e al 5% di ambiente di anidride carbonica per tre giorni.Per monitorare la senescenza cellulare, con un avanzato sistema Coulter Cell Counter, misurare il graduale aumento del diametro cellulare e del volume cellulare durante ogni fase di tripsicinazione. Per iniziare il test di screening beta-Gal, seminare 5.000 cellule senescenti o 3.000 cellule non senescenti per pozzo in 96 piastre di pozzo. Quindi, aggiungere 100 microlitri di mezzo di crescita a ciascun pozzo e incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 20% di ossigeno e 5% di anidride carbonica per sei ore.Successivamente, aggiungere diluizioni di farmaci alle cellule MEF e incubare le cellule a 37 gradi Celsius nel 20% di ossigeno e 5% di anidride carbonica per 24-48 ore. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione farmacologica e lavare le cellule con 100 microlitri di 1X PBS. Per indurre l'alcalinizzazione lisosomiale, pre-trattare le cellule con 90 microlitri di soluzione di bafilomicina A1, diluite in mezzo di coltura cellulare fresca ad una concentrazione finale di 100 nanomolari.Quindi, incubare le cellule a 37 gradi Celsius nel 20% di ossigeno e nel 5% di anidride carbonica per un'ora. Per l'analisi a fluorescenza dell'attività SA-beta-Gal, creare una nuova soluzione di lavoro di C12FDG diluito nel mezzo di crescita, ad una concentrazione finale di 100 micromolare. Quindi, aggiungere 10 microlitri della soluzione di lavoro al mezzo di coltura a una concentrazione finale di 10 micromolari e incubare le cellule a 37 gradi Celsius in ossigeno al 20% e 5% di anidride carbonica per due ore.Lavare le celle con 100 microlitri di 1X PBS. Successivamente, aggiungere due microlitri di un colorante Hoechst 33342 da 100 microgrammi per millilitro ad una concentrazione finale di due microgrammi per millilitro. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius, 20% ossigeno e 5% di anidride carbonica per 20 minuti.Dopo l'incubazione, rimuovere il supporto, aggiungere 100 microlitri di mezzo di crescita fresco e procedere all'imaging. In questo studio, una piattaforma di acquisizione e analisi di immagini fluorescenti ad alto contenuto ha permesso l'identificazione di farmaci senolitici, come 17-DMAG, che hanno ridotto le attività complessive sa-beta-Gal nelle colture cellulari di fibroblasti embrionali murini contenenti cellule senescenti nel passaggio cinque. Le analisi quantitative generate dal software di miscele di cellule senescenti e non senescenti consentono la chiara dimostrazione di effetti specifici delle cellule senescenti e l'eliminazione dell'attività beta-galattosidasi di fondo da parte della bafilomicina A.Assicurarsi che siano inclusi tutti i controlli cellulari necessari, in particolare le cellule senescenti non trattate e le cellule senescenti trattate con un controllo positivo.Questo saggio include il lavoro con le cellule primarie sotto stress ossidativo, che può portare a variazioni che devono essere monitorate. Questa procedura è il primo passo nell'individuazione dei farmaci senoterapici. Ulteriori saggi di vitalità cellulare e senescenti cellulari devono essere eseguiti per confermare i risultati dello screening.Diversi nuovi farmaci senolitici sono stati rilevati utilizzando questo saggio, tra cui la prima combinazione di farmaci senolitici dasatinib quercetina, inibitori della proteina shock termico 90, inibitori della famiglia Bcl-2 e il polifenolo fisetina.

Research

JoVE Journal

Biology

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

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