Name: sa-&#946;-galactosidase-based screening assay for the identification of senotherapeutic drugs
Uploaded: 2019-06-28T14:30:00
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この作業は、NIH助成金AG043376(プロジェクト2とコアA、PDR;プロジェクト1とコアB、LJN)およびAG056278(プロジェクト3とコアA、PDR、プロジェクト2、LJN)とグレン財団(LJN)からの助成金。

動物の使用は、スクリプスフロリダ機関動物ケアと使用委員会によって承認されました.
1. 老化マウス胚性線維芽細胞(MEF)の生成 – 12-15日
<ol><li>前述の33日に胎児13日目(E13)で妊娠中の雌マウスから野生型およびErcc1-/-MEFを分離する。 注:以下のすべてのステップは、無菌条件下で組織培養フード内で行われ、滅菌器具を使用しています?...

SA-β-Galは、Dimriらによって最初に発見された細胞老化のための明確に定義されたバイオマーカーである。(1995)老化したヒト線維芽細胞が増殖細胞と比較してpH623でアッセイした場合のSA-β-Galの活性を増加させたことを示す。一方、SA-β-Galに対するインビトロおよびインビボアッセイは、異なる細胞型および組織25、39、40に対して確立されている。<...

細胞老化はレナード・ヘイフリックとポール・ムーアヘッドによって初めて説明され、正常細胞は培養1で増殖する能力が限られていることを示した。老化細胞は、栄養素、成長因子および接触阻害の欠如にもかかわらず増殖に失敗するが、代謝活性2のままである。この現象は複製性老化として知られており、主にテロメア短縮に起因し、少なくともヒト細胞3で起こった。さらなる研究は、細胞が発癌性ストレス(腫瘍遺伝子誘発老化、OIS)、DNA損傷、細胞傷害薬、または照射(ストレス誘発老化、SIS)などの他の刺激に応答して老化を受けるように誘導できることを示しています4,5,6.テロメア浸食を含むDNA損傷に対応して、細胞は老化、制御されていない細胞増殖を開始するか、損傷を修復できない場合はアポトーシスを受ける。この場合、細胞老化は腫瘍抑制的な方法2で作用するとして有益であると思われる。対照的に、老化はDNA損傷を含む細胞損傷の蓄積による老化と共に増加する。老化細胞はサイトカイン、メタロプロテイナーゼおよび成長因子を分泌することができるので、老化関連分泌表現型(SASP)と呼ばれる、この加齢依存性の増加は、細胞老化およびSASPの減少した組織恒常性に寄与し、その後、老化。また、老化負担のこの年齢依存的な増加は、代謝疾患、ストレス感受性、プロジェリア症候群、および治癒障害7、8を誘発することが知られており、部分的には、多数の加齢関連の原因であるアテローム性動脈硬化症、変形性関節症、筋変性症、潰瘍形成、およびアルツハイマー病9、10、11、12、13などの疾患。老化細胞を排除することは、組織機能不全を予防または遅延させ、健康寿命を延ばすのに役立ちます14.これは、トランスジェニックマウスモデル14、15、16だけでなく、薬物スクリーニングの努力とバイオインフォマティクス分析の両方を通じて発見されたセノリティック薬と薬物の組み合わせを使用して示されています。老化細胞17、18、19、20、21、22で特異的に誘導される経路。より最適なセノセラピューティクス薬を同定することは、老化細胞の負担をより効果的に軽減することができ、健康な老化のための治療アプローチの開発における重要な次のステップである。
老化細胞は、培養と生体内の両方で特徴的な色分性および分子的特徴を示す。これらの老化マーカーは、老化誘導の原因または結果またはこれらの細胞における分子変化の副産物である可能性がある。しかし、老化細胞では特異的に単一のマーカーは見つからない。現在、老化関連β-ガラクトーシダーゼ(SA-β-Gal)検出は、インビトロおよびインビボで老化を測定する最良の特徴付けおよび確立された単一細胞ベースの方法の1つである。SA-β-Galは、pH4で最適な酵素活性を有するリソソームヒドロラーゼである。老化細胞がリソソーム活性23、24の増加を示すので、pH6での活性の測定が可能である。生細胞の場合、増加したリソソームpHは、バクオールH+-ATPase阻害剤バフィロマイシンA1または内染染酸性化阻害剤クロロキン25、26を用いてリソソームアルカリ化によって得られる。5-ドデカノイラミノフレッセインDi-β-D-ガラクトピラノシド(C12FDG)は、その12炭素親油性部分25に起因する細胞内のク破物を保持するように生細胞の基質として使用される。重要なことに、SA-β-Gal活性自体は老化細胞で同定された経路と直接接続されず、老化を誘発する必要はない。このアッセイにより、老化細胞は、高齢者の皮膚生検などの異種細胞集団や老化組織においても同定することができる。また、いくつかの生物および条件27、28、29における老化細胞検出のための信頼できるマーカーであるとして、細胞老化と老化23との間の相関関係を示すために使用されている。 30.ここでは、強い酸化ストレス誘発細胞老化を有する一次マウス胚線維芽細胞(MEF)を用いた蛍光基質C12 FDGに基づく高スループットSA-β-Galスクリーニングアッセイとその長所と短所について説明する。が議論されています。このアッセイは、異なる細胞型で行うことができるが、Ercc1-欠乏、DNA修復障害MEFの使用は、酸化ストレスの条件下で老化のより迅速な誘導を可能にする。マウスでは、DNA修復エンドヌクレアーゼERCC1-XPFの発現の低下は、DNA修復の障害を引き起こし、内因性DNA損傷の蓄積の加速、ROSの上昇、ミトコンドリア機能障害、老化細胞負荷の増加、幹細胞機能の喪失および早期老化, 自然老化に似ています31,32.同様に、Ercc1-欠乏MEFは、培養17でより急速に老化を受ける。老化MEFアッセイの重要な特徴は、各ウェルが老化細胞と非老化細胞の混合物を有し、老化細胞特異的効果の明確なデモンストレーションを可能にすることである。しかし、一次細胞における酸化ストレスを利用して老化を誘発することはより生理学的であると考えていますが、このアッセイは、エトポシドや照射などのDNA損傷剤で老化が誘導される細胞株にも使用できます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:928px;" width="928">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">DMEM&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Corning</td>
			<td style="width:344px;">10-013-CV</td>
			<td style="width:167px;">medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ham&#39;s F10</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12390-035</td>
			<td style="width:167px;">medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">fetal bovine serum</td>
			<td>Tissue Culture Biologics</td>
			<td>101</td>
			<td style="width:167px;">serum</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1x non-essential amino acids</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-025-Cl</td>
			<td style="width:167px;">amino-acids</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">bafilomycin A1&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B1793</td>
			<td style="width:167px;">lysosomal inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">C12FDG</td>
			<td>Setareh Biotech</td>
			<td>7188</td>
			<td style="width:167px;">b-Gal substrate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hoechst 33342&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H1399</td>
			<td style="width:167px;">DNA intercalation agent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">17DMAG</td>
			<td>Selleck Chemical LLC</td>
			<td>50843</td>
			<td style="width:167px;">HSP90 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">InCell6000 Cell Imaging System</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">High Content Imaging System</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sa-&#946;-galactosidase-based screening assay for the identification of senotherapeutic drugs

細胞老化は、健康寿命に悪影響を及ぼすと知られている老化の特徴の一つである。細胞培養において特異的に老化細胞を殺すことができる薬物は、セノリティックと呼ばくことができ、生体内の老化細胞の負担を軽減し、健康寿命を延ばすことができる。HSP90阻害剤、Bcl-2ファミリー阻害剤、ピペロングミン、FOXO4阻害ペプチドおよびダサチニブ/ケルセチンの組み合わせを含む複数のクラスのセノリティックスが同定されている。増加したリソソームpHでのSA-β-Galの検出は、老化細胞の検出のための最良の特徴付きマーカーの一つである。蛍光基質C12 FDGを用いて老化関連β-ガラクトシダーゼ(SA-β-Gal)活性のライブ細胞測定を、DNAインターカレートホエヒト色素を用いて全細胞数の決定と組み合わせることで、その可能性を開く。老化細胞の死化(セノリティクス)またはSA-β-Galおよび他の発せ子細胞(セノモルフィック)の他の現象を抑制することによって、全体的なSA-β-Gal活性を低下させるセノセラピューティクス薬のスクリーン。高含有量の蛍光画像取得および分析プラットフォームを使用することで、SA-β-Gal、細胞形態および細胞数に対する影響に対する薬物ライブラリーの迅速かつ高スループットスクリーニングが可能になります。

SA-β-Gal活性は、複製的な疲労、遺伝子毒性および酸化ストレスから、発癌活性化23、25、38まで様々な方法で老化するように誘導される細胞において検出することができる。Ercc1-欠損マウス胚線維芽細胞を用いた現行モデルでは、ノルモキシック増殖条件(20%O2)は、それらをいくつかの通路で?...

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SA-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

細胞老化は、慢性加齢病理の発症における重要な因子である。老化細胞を標的とする治療薬の同定は、健康な老化を延長する約束を示す。ここでは、単一細胞における老化関連β-ガラクトシダーゼ活性の測定に基づくセノセラピューティクスの同定をスクリーニングするための新規アッセイを提示する。

セノ治療薬同定のためのSA-β-ガラクトーシダーゼベーススクリーニングアッセイ

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

我々は、老化関連疾患において有益であることが示されたセノ治療薬化合物に対するハイスループット薬物スクリーニングを可能にする方法をここで初めて説明する。実際, この本質でテストされた薬でいくつかの臨床試験は現在進行中.この技術の主な利点は、セノリノティクスとセノモルフィクスの2種類のセノマテ治療薬を区別し、老化細胞におけるSA-β-ガラクトシダーゼの十分に確立された検出を使用することです。この技術は、新しいセノ治療薬化合物の重要なスクリーニングツールである。実際には、この画面の助けを借りて識別されているいくつかの化合物は、様々な注目の出版物で紹介され、現在臨床試験中です。この手法は非常に汎用性が高く、複数のハイスループットスクリーンに適合する可能性があります。実際には、多重スクリーン、およびいくつかの経路の1つの活性化または阻害を介して老化を抑制する化合物のスクリーンを可能にする。各胚を1ミリメートルにミンチし、数回上下にパイプします。次に、各胚の組織に10ミリリットルの成長培地を加える。10センチメートルの培養皿に入れ、3%の酸素で摂氏37度、2〜3日間5%の二酸化炭素でインキュベートします。そして、各胚の残りの部分を0.25%トリプシンEDTA混合物で10分間インキュベートする。細胞をトリプシン化するには、まず、増殖培地を慎重に除去し、10ミリリットルの1X PBSで細胞を2回洗浄する。その後、025トリプシンEDTA溶液を2ミリリットル加え、摂氏37度で2~3分間インキュベートします。次に、顕微鏡下で細胞を検査し、細胞が表面から切り離されていることを確認します。同じ量の増殖培地を加えてトリプシン消化を終了し、細胞を円錐管に移す。その後、細胞をGの200倍で3分間遠心する。上清を捨て、新たな増殖培地を加え、細胞を再中断する。次に、セルを数え、予測されたセル密度で新しいプレートにシードします。非老化サブ栽培の場合、まず、コンフルエント細胞を1対4の比率で分割する。その後、3%の酸素と5%の二酸化炭素で37°Cの細胞をインキュベートし、別の通路のために拡張します。次に、細胞老化を誘導するために、1〜4の割合で1〜4の割合で1つの通路からコンフルエント細胞を播種し、20%の酸素で摂氏37度、5%の二酸化炭素環境で3日間インキュベートする。高度なコールターセルカウンターシステムで細胞の老化を監視するには、各トリプシン化工程中の細胞径と細胞体積の漸進的な増加を測定する。β-Galスクリーニングアッセイを開始するために、種子5,000老化細胞または3,000個の非老化細胞を96ウェルプレートで1ウェルあたり。その後、各ウェルに100マイクロリットルの成長培地を加え、摂氏37度で細胞をインキュベートし、20%の酸素と5%の二酸化炭素を6時間インキュベートします。次に、MEF細胞に薬物希釈液を加え、20%の酸素で摂氏37度、24〜48時間の二酸化炭素を5%で培養します。インキュベーション後、薬物溶液を取り除き、100マイクロリットルの1X PBSで細胞を洗浄します。リソソームアルカリ化を誘導するために、90マイクロリットルのバフィロマイシンA1溶液を用いて細胞を前処理し、100ナノモルの最終濃度で新鮮な細胞培養培地に希釈した。その後、20%の酸素と5%の二酸化炭素環境で37°Cの細胞を1時間インキュベートします。SA-β-Gal活性の蛍光分析のために、成長培地で希釈したC12FDGの新しい働き溶液を、100マイクロモルの最終濃度で作る。次に、10マイクロモルの最終濃度で培養液に10マイクロリットルの作業溶液を加え、20%酸素で37°C、2時間の二酸化炭素を5%で細胞をインキュベートする。1X PBSの100マイクロリットルで細胞を洗浄します。次に、1ミリリットル当たり100マイクログラムのHoechst 33342染料の2マイクロリットルを、1ミリリットル当たり2マイクログラムの最終濃度で添加します。20分間、摂氏37度、酸素20%、炭酸ガス5%で細胞をインキュベートします。インキュベーション後、培地を取り出し、100マイクロリットルの新鮮な成長培地を加え、イメージングに進む。本研究では、17-DMAGなどのセノリノクティック薬の同定を可能にした高含有蛍光画像取得および分析プラットフォームにより、老化細胞を含むマウス胚性線維芽細胞培養におけるSA-β-Galの全体的な活動を5回の経過で減少させた。老化細胞と非老化細胞の混合物のソフトウェア生成定量分析は、老化細胞特異的効果の明確なデモンストレーションを可能にし、バフィロマイシンA.A.A.陽性対照で処理されたすべての必要な細胞制御が含まれていることを確認してください。このエッセイには、酸化ストレス下の原発細胞の操作が含まれており、監視する必要がある変動につながる可能性があります。この手順は、セノ治療薬の検出の第一歩です。スクリーニング結果を確認するために、追加の細胞生存率および細胞老化エッセイを行う必要があります。このエッセイを使用していくつかの新しいセノリノリゼドラッグ薬が検出されました, 最初のセノリノリューコ薬の組み合わせダサチニブケルセチンを含みます, ヒートショックタンパク質 90阻害剤, Bcl-2ファミリー阻害剤, ポリフェノールフィセチン.

Research

JoVE Journal

Biology

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

CD71/TER119フローサイトメトリーアッセイを用いてマウス赤血球前駆細胞の同定と解析

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

蛍光顕微鏡スクリーニングと次世代シーケンシング：オルガネラの整合性に関与する遺伝子の同定のための有用なツール

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

GIRKチャネルのモジュレーターを同定するための蛍光スクリーニングアッセイ

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

植物タンパク質複合体の翻訳後修飾の同定

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

トリパノソーマにおけるRNA編集に対する薬剤をスクリーニングするためのレポーターとして、RNA触媒

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

転写後調節される遺伝子の化学モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

ハイスループットスクリーニングを使用したキナーゼ基質ペアの同定


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

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シロイヌナズナタンパク質-DNA相互作用の同定のための免疫沈降アッセイクロマチン<em&gt;インビボ</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

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ヘリアンサス・アンヌウスにおける大規模な熱画像スクリーニングによる植物蒸散の新規レギュレーターの同定

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

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シチュヌチュ・ニュードゥス・コロミック流体のハイブリダイゼーションで

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. ...