Name: sa-&#946;-galactosidase-based screening assay for the identification of senotherapeutic drugs
Uploaded: 2019-06-28T14:30:00
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이 작품은 NIH 그랜트 AG043376에 의해 지원되었다 (프로젝트 2 및 코어 A, PDR; 프로젝트 1 및 코어 B, LJN) 및 AG056278 (프로젝트 3 및 코어 A, PDR, 프로젝트 2, LJN) 및 글렌 재단 (LJN)의 보조금.

동물 사용은 스크립스 플로리다 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다.
1. 노화 뮤린 배아 섬유 아세포 (MEF)의 생성 – 12-15 일
<ol><li>앞서33일설명한 바와 같이 배아일 13일(E13)에서 임신한 암컷 마우스로부터 야생형 및 Ercc1--MEFs를 분리한다. 참고 : 모든 다음 단계는 무균 조건하에서 멸균 기구를 사용하여 조직 배양 후드에서 수?...

SA-β-Gal은 Dimri et al.에 의해 원래 발견된 세포 노화에 대한 잘 정의된 바이오마커입니다. (1995) 노화성 인간 섬유아세포가 증식 세포에 비해 pH 623에서 분석되었을 때 SA-β-Gal의 활성이 증가한다는 것을 보여준다. 한편, SA-β-Gal에 대한 생체외 및 생체내 분석기는 상이한 세포 유형 및 조직25,39,40에대해 확?...

세포 노화는 레너드 헤이플릭과 폴 무어헤드에 의해 처음으로 기술되었으며, 이들은 정상 세포가 배양1에서 증식하는 능력이 제한적이라는 것을 보여주었다. 노화 세포는 영양소의 존재에도 불구하고 증식하지 못하고, 성장 인자 및 접촉 억제의부족, 그러나 신진 대사 활성 남아 2. 이러한 현상은 복제 노쇠로 알려져 있으며 주로 인간 세포 3에서 텔로미어 단축에기인했다. 추가 연구는 세포가 또한 종양 발생 스트레스 (종양 유전자 유도 노쇠, OIS), DNA 손상, 세포 독성 약물, 또는 조사 (스트레스 유도 노쇠, SIS)와 같은 다른 자극에 대한 응답으로 노화를 겪도록 유도 될 수 있음을 보여 주었다4 , 5개 , 6. 텔로미어 침식을 포함한 DNA 손상에 반응하여 세포는 노화를 시작하거나 통제되지 않은 세포 성장을 시작하거나 손상을 복구 할 수없는 경우 세포 사멸을 겪습니다. 이 경우, 세포 노화는 종양 억제 방식으로 작용하므로 유익한 것으로보인다 2. 대조적으로, 노화는 DNA 손상을 포함하여 세포 손상의 축적 때문에 노화와 함께 증가합니다. 노화 세포는 사이토카인, 금속 단백질 및 성장 인자를 분비 할 수 있기 때문에 노화 관련 분비 표현형 (SASP)이라고 불립니다.이 노화 의존적 증가는 세포 노화 및 SASP의 노화 에 의존적 증가하여 조직 항상성 감소에 기여하고 그 후 노화. 또한, 이러한 노화 에 따른 노화 부담증가는 대사성 질환, 스트레스 감수성, 프로게리아 증후군및 장애인 치유 7,8을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 부분적으로는 수많은 노화관련 죽상동맥경화증, 골관절염, 근육변성, 궤양 형성, 및 알츠하이머병 9,10,11,12,13. 노화 세포를 제거하는 것은 조직 기능 장애를 방지하거나 지연시키고 건강 기간을 연장하는 데 도움이 될 수 있습니다14. 이는 형질전환 마우스 모델14,15,16뿐만 아니라 약물 스크리닝 노력과 생물정보학 분석을 통해 발견된 세포용해 약물 및 약물 조합을 이용하여 나타났다. 경로는 노화 세포에서 특히 유도17,18,19,20,21,22. 노화 세포 부담을 보다 효과적으로 줄일 수 있는 보다 최적의 세포 치료제를 식별하는 것은 건강한 노화를 위한 치료 접근법개발의 중요한 다음 단계입니다.
노화 세포는 배양 및 생체 내에서 특징적인 자형기능 및 분자 특징을 보여줍니다. 이 노화 마커는 이 세포에 있는 분자 변경의 원인 또는 노쇠 유도 또는 부산물 일 수 있었습니다. 그러나, 단 하나 마커는 노화 세포에서 구체적으로 찾아내지 않습니다. 현재, 노화 관련 β-갈락토시다아제(SA-β-Gal) 검출은 시험관내 및 생체 내 노화를 측정하는 가장 잘 특성화되고 확립된 단일 세포 기반 방법 중 하나이다. SA-β-Gal은 pH 4에서 최적의 효소 활성을 가진 리소좀 하이드로라제입니다. 노화 세포가 리소좀 활성이 증가하기 때문에 pH 6에서 의 활성을 측정하는 것이 가능하다23,24. 살아있는 세포의 경우, 증가된 리소좀 pH는 백액olar H +-ATPase억제제 바필로마이신 A1 또는 내인대 산성화 억제제 클로로퀸25,26을가진 리소좀 알칼리화에 의해 수득된다. 5-도데카노일아미노플루세신 디β-D-갈라코피라노사이드(C12FDG)는 12개의 탄소 지질학적 모에티(25)로 인해 세포 내의 갈라진 생성물을 유지함에 따라 살아있는 세포에서 기질로서 사용된다. 중요한 것은, SA-β-Gal 활동 자체는 노화 세포에서 확인된 어떤 통로와도 직접 연결되지 않으며 노화를 유도하기 위하여 필요하지 않습니다. 이 분석으로, 노화 세포는 더 오래된 개별에게서 피부 생검과 같은 이기종 세포 인구 및 노화 조직에서조차 확인될 수 있습니다. 또한 여러 유기체 및 조건에서 노화 세포 검출을 위한 신뢰할 수 있는 마커로서 세포 노화와노화(23) 사이의 상관관계를 보여주기 위해 사용되어왔다(27,28,29, 30. 여기서, 높은 처리량 SA-β-Gal 스크리닝 분석기 는 1차마우스 배아 섬유아세포(MEFs)를 이용하여 1차 마우스 배아 섬유아세포(MEFs)를 이용하여 형광기 판기 C 12FG를 기초로 하여 강력하고 산화적 스트레스 유도 된 세포 노화를 설명하며 그 장점과 단점을 설명한다. 논의됩니다. 이 분석법은 다른 세포 모형으로 행해질 수 있더라도, Ercc1-결핍, DNA 수선 손상MEFs의 사용은 산화 긴장의 조건 하에서 노화의 더 급속한 유도를 허용합니다. 마우스에서, DNA 수리 endonuclease ERCC1-XPF의 감소된 표현은 손상된 DNA 복구를 일으키는 원인이 되고, 내인성 DNA 손상의 가속한 축적, 상승된 ROS, 미토콘드리아 역기능, 증가된 노화 세포 부담, 줄기 세포 기능의 손실 및 조기 노화, 자연 노화와 유사31,32. 유사하게, Ercc1-결핍MEFs는 배양17에서더 빠르게 노화를 겪는다. 노화 MEF 분석의 중요한 특징은 각 우물은 노화 세포와 비 노화 세포의 혼합물을 가지고 있다는 것입니다, 노화 세포 특정 효과의 명확한 데모를 허용. 그러나, 우리는 노화를 유도하기 위하여 1 차적인 세포에 있는 산화 긴장의 사용이 더 생리적이라고 믿더라도, 이 분석은 또한 노화가 etoposide 또는 조사 같이 DNA 손상 에이전트로 유도되는 세포주로 이용될 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:928px;" width="928">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">DMEM&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Corning</td>
			<td style="width:344px;">10-013-CV</td>
			<td style="width:167px;">medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ham&#39;s F10</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12390-035</td>
			<td style="width:167px;">medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">fetal bovine serum</td>
			<td>Tissue Culture Biologics</td>
			<td>101</td>
			<td style="width:167px;">serum</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1x non-essential amino acids</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-025-Cl</td>
			<td style="width:167px;">amino-acids</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">bafilomycin A1&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B1793</td>
			<td style="width:167px;">lysosomal inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">C12FDG</td>
			<td>Setareh Biotech</td>
			<td>7188</td>
			<td style="width:167px;">b-Gal substrate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hoechst 33342&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H1399</td>
			<td style="width:167px;">DNA intercalation agent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">17DMAG</td>
			<td>Selleck Chemical LLC</td>
			<td>50843</td>
			<td style="width:167px;">HSP90 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">InCell6000 Cell Imaging System</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">High Content Imaging System</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sa-&#946;-galactosidase-based screening assay for the identification of senotherapeutic drugs

세포 노화는 건강한 수명에 부정적인 영향을 미치는 것으로 알려진 노화의 특징 중 하나입니다. 세포 배양에서 특히 노화 세포를 죽일 수있는 약물, senolytics라고, 생체 내에서 노화 세포 부담을 감소시키고 건강을 연장 할 수 있습니다. Senolytics의 여러 클래스는 현재까지 HSP90 억제제를 포함 하 여 확인 되었습니다., Bcl-2 가족 억제제, piperlongumine, FOXO4 억제 펩 티 드와 다 사 티 닙/케르세틴의 조합. 증가된 리소좀 pH에서 SA-β-Gal의 검출은 노화 세포의 검출을 위한 최고의 특징 마커 중 하나이다. 노화 관련 β-갈락토시다아제(SA-β-Gal) 활성의 살아있는 세포 측정은 호흐트트 염료를 인터컬레이팅하는 DNA를 이용하여 총 세포 수의 측정과 조합하여 형광 기질 C12FDG를 이용한 가능성을 열어준다. 노화 세포 (senolytics)를 죽이거나 SA-β-Gal 및 노화 세포의 다른 표현형을 억제하여 전반적인 SA-β-Gal 활성을 감소시키는 세포 치료 약물에 대한 스크린 (senomorphics). 높은 함량의 형광 이미지 수집 및 분석 플랫폼을 사용하면 SA-β-Gal, 세포 형태 및 세포 수에 미치는 영향에 대한 약물 라이브러리의 신속하고 높은 처리량 스크리닝이 가능합니다.

SA-β-Gal 활성은 복제고갈, 유전자 독성 및 산화 스트레스로부터 다양한 방법으로 노화하도록 유도되는 세포에서 종양유전자 활성화23,25,38에검출될 수 있다. Ercc1-결핍마우스 배아 섬유아세포세포를 이용한 현재 모델에서, 노르목성 성장 조건(20% O2)은 몇 개의 대행을 위해 이들을 경작한 후 세포 ?...

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SA-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

세포 노화는 만성 연령 과 관련된 병리 발달의 핵심 요소입니다. 노화 세포를 표적으로 하는 치료제의 식별은 건강한 노화를 연장하기 위한 약속을 보여줍니다. 여기서, 우리는 단일 세포에서 의 노화 관련 β-갈락토시다아제 활성의 측정에 기초하여 senotherapeutics의 식별을 위해 스크리블하는 새로운 분석방법을 제시한다.

SA-β-갈락토시다아제 계 선별 분석법

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

노화관련 질환에 유익한 것으로 나타난 세노테라피 화합물에 대한 고처리량 약물 스크리닝을 허용하는 방법을 처음으로 설명하고 있습니다. 사실, 이 본질에서 시험된 약으로 몇몇 임상 시험은 현재 진행 중입니다. 이 기술의 주요 장점은 노화 세포에서 SA 베타-갈라콘토시다아제의 잘 확립된 검출을 사용하여 두 가지 유형의 혈청 치료 약물, 혈청술 및 분리제를 구별하는 것입니다.이 기술은 새로운 senotherapeutic 화합물을 위한 중요한 검열 공구입니다. 사실, 이 화면의 도움으로 확인 된 여러 화합물은 다양 한 높은 프로필 간행물에 등장, 그리고 임상 시험에 현재. 이 기술은 매우 다재다능하며 여러 고처리량 화면에 적용 될 수 있습니다.사실, 그것은 멀티 플렉스 스크린에 가능, 그리고 여러 경로 중 하나의 활성화 또는 억제를 통해 노화를 억제 하는 화합물에 대 한 화면. 각 배아를 1밀리미터 조각으로 다진 후 여러 번 위아래로 파이프를 넣습니다. 다음으로, 각 배아의 조직에 성장 매체의 10 밀리리터를 추가합니다.10센티미터 배양 접시에 담아 2~3일 동안 37도의 산소와 5%의 이산화탄소를 배양합니다. 그리고 10 분 동안 0.25 %의 트립신 EDTA 혼합물로 각 배아의 나머지 부분을 배양합니다. 세포를 트립시화하려면 먼저 성장 배지를 조심스럽게 제거하고 1X PBS의 10 밀리리터로 세포를 두 번 세척하십시오.그런 다음 025 트립신 EDTA 용액의 2 밀리리터를 세포에 추가하고 섭씨 37도에서 2~3분 동안 배양합니다. 다음으로 현미경으로 세포를 검사하여 세포가 표면에서 분리되는지 확인합니다. 트립신 소화를 종료하고, 원추형 튜브로 세포를 전송하는 성장 배지의 동일한 양을 추가합니다.그런 다음 세포를 3분 동안 200배 G로 원심분리합니다. 상체를 버리고 새로운 성장 배지를 추가하여 세포를 다시 중단합니다. 다음으로, 세포를 계산하고 투영된 세포 밀도에서 새 플레이트에 종자합니다.비 노화 하위 재배를 위해, 첫째, 1 대 4 비율로 수렴 세포를 분할합니다. 그런 다음 3%의 산소와 5%의 이산화탄소로 섭씨 37도에서 세포를 배양하여 다른 통로를 확장합니다. 다음으로, 세포 노화를 유도하기 위하여는, 종자 분할 응수세포는 1-4의 비율로 통로에서 1에서 분할하고 3 일 동안 20%의 산소및 5% 이산화탄소 환경에서 섭씨 37도에서 배양합니다.고급 쿨터 셀 카운터 시스템으로 세포 노화를 모니터링하려면 각 trypsinization 단계에서 세포 직경과 세포 부피가 점진적으로 증가하는 것을 측정합니다. 베타-갈 스크리닝 분석, 종자 5, 000 노화 세포 또는 3, 000 비 노화 세포당 96 웰 플레이트. 그런 다음 각 우물에 100 마이크로리터의 성장 배지를 추가하고 6시간 동안 섭씨 37도, 산소 20%, 이산화탄소 5%로 세포를 배양합니다.다음으로, MEF 세포에 약물 희석을 추가하고 24~48시간 동안 20%의 산소와 5%의 이산화탄소로 37°C의 세포배양증을 한다. 인큐베이션 후, 1X PBS의 100 마이크로리터로 약물 용액을 제거하고 세포를 세척하십시오. 리소소피 알칼리화를 유도하기 위해, 100 나노몰라의 최종 농도에서 신선한 세포 배양 배지에서 희석된 90마이크로리터의 바필로마이신 A1 용액으로 세포를 미리 치료한다.그런 다음, 세포가 섭씨 37도에서 산소 20% 및 이산화탄소 환경 5%에서 한 시간 동안 배양합니다. SA-베타-갈 활성의 형광 분석을 위해, 100 마이크로몰러의 최종 농도에서 성장 매체에서 희석된 C12FDG의 신선한 작업 용액을 만듭니다. 이어서, 10 마이크로몰라의 최종 농도에서 배양 배지에 10 마이크로리터를 추가하고, 2시간 동안 20%의 산소와 5%의 이산화탄소로 섭씨 37도에서 세포를 배양한다.1X PBS의 100 마이크로리터로 셀을 세척합니다. 다음으로, 밀리리터 당 100 마이크로그램당 2개의 마이크로리터를 밀리리터당 2마이크로그램의 최종 농도에 첨가합니다. 세포는 섭씨 37도, 산소 20%, 이산화탄소 5%로 20분 간 배양합니다.인큐베이션 후, 미디어를 제거하고, 신선한 성장 매체의 100 마이크로 리터를 추가하고, 이미징을 진행합니다. 본 연구에서는, 고함량 형광 화상 획득 및 분석 플랫폼은 17-DMAG와 같은 혈청약의 식별을 허용하여, 5번 통로에서 노화 세포를 포함하는 뮤린 배아 섬유아세포 배양에서 전체 SA-베타-갈 활동을 감소시켰습니다. 노쇠와 비 노화 세포의 혼합물의 소프트웨어 생성 정량 분석은 노화 세포 특이적 효과의 명확한 데모를 허용하고, bafilomycin A.에 의한 배경 베타 갈라토시다제 활성의 제거를 허용합니다.이 에세이는 산화 스트레스하에서 1 차 세포와 함께 일하는 것을 포함하며, 이는 모니터링해야 하는 변이로 이어질 수 있습니다. 이 절차는 세노 치료제의 검출의 첫 번째 단계입니다. 추가 세포 생존력 및 세포 노화 에세이는 스크리닝 결과를 확인하기 위하여 능력을 발휘할 필요가 있습니다.몇 가지 새로운 senolytic 약물이 에세이를 사용 하 여 검출 되었습니다., 첫 번째 senolytic 약물 조합 dasatinib quercetin를 포함 하 여, 열 충격 단백질 90 억제제, Bcl-2 가족 억제제, 그리고 폴리페놀 피세틴.

Research

JoVE Journal

Biology

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

CD71/TER119 흐름 cytometric 어세를 사용하여 마우스 Erythroid Progenitors의 제품 식별 및 분석

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

연구

생물학

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

형광 - 현미경 검사와 차세대 장면 : Organelle 무결성에 관련된 유전자의 식별을위한 유용한 도구

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

GIRK 채널의 변조기를 식별을위한 형광 검사 분석

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

식물 단백질 복합체의 번역 후 변형의 확인

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

Trypanosomes에서 RNA 편집에 대한 마약 검사에 대한 기자로 RNA 촉매

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

높은 처리량 검열을 사용 키나제 기판 쌍의 식별


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

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애기 장대 단백질 DNA 상호 작용의 식별을위한 염색질 면역 침전 분석<em&gt; 생체</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

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헬리안투스 아누스의 대규모 열화상 스크리닝에 의한 새로운 식물 증발 규제 기관 식별

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

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시분큘러스 누두스 Coelomic 유체에 대한 시투 혼성화

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. ...