Name: sa-&#946;-galactosidase-based screening assay for the identification of senotherapeutic drugs
Uploaded: 2019-06-28T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about SA-ÃŽÂ²-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av NIH Grants AG043376 (prosjekt 2 og Core A, PDR; Prosjekt 1 og Core B, LJN) og AG056278 (prosjekt 3 og Core A, PDR, og prosjekt 2, LJN) og et stipend fra Glenn Foundation (LJN).

Animal bruk ble godkjent av Scripps Florida institusjonelle Animal Care og use Committee.
1. generering av senescent murine embryonale Fibroblast (MEF) – 12-15 dager
<ol><li>Isolere vill type og Ercc1-/- MEFs fra gravide kvinnelige mus på embryonale dag 13 (E13) som beskrevet tidligere33. Merk: alle følgende trinn utføres i en vevs kultur hette under aseptisk forhold og ved bruk av sterile instrumenter.</li>
	<li>Resect embryo hodet over ø...

SA-β-gal er en veldefinert biomarkør for mobilnettet senescence opprinnelig oppdaget av Dimri et al. (1995) viser at senescent menneskelige fibroblaster har økt aktivitet av SA-β-gal når analyseres ved pH 623 sammenlignet med voksende celler. I mellomtiden, in vitro og in vivo-analysen for sa-β-gal har blitt etablert for ulike celletyper og vev25,39,40. Den fluorescens basert enkelt celle m...

Cellular senescence ble beskrevet for første gang av Leonard Hayflick og Paul Moorhead, som viste at normale celler hadde en begrenset evne til å spre i kultur1. Senescent celler ikke sprer seg til tross for tilstedeværelsen av næringsstoffer, vekstfaktorer og mangel på kontakt hemming, men forblir metabolically aktiv2. Dette fenomenet er kjent som replicative senescence og ble hovedsakelig tilskrevet telomere forkortelse, i hvert fall i humane celler3. Videre studier har vist at celler kan også bli overtalt til å gjennomgå senescence som svar på andre stimuli, slik som kreftfremkallende stress (diagnostisk indusert senescence, OIS), DNA skade, cytotoksisk narkotika, eller bestråling (stress indusert senescence, SIS)4 , 5 andre priser , 6. som svar på DNA-skade, inkludert telomere erosjon, celler enten senesce, starte ukontrollert cellevekst, eller gjennomgå apoptose Hvis skaden ikke kan repareres. I dette tilfellet, celle senescence synes å være gunstig som det fungerer i en svulst undertrykkende måte2. I kontrast er senescence økt med aldring på grunn av akkumulering av cellulære skader inkludert DNA skade. Siden senescent celler kan skille cytokiner, metalloproteinases og vekstfaktorer, kalt senescence-assosiert sekretoriske fenotype (SASP), denne Aldersavhengige økningen i mobilnettet senescence og SASP bidrar til redusert vev homeostase og senere aldring. Også denne Aldersavhengige økningen i senescence byrde er kjent for å indusere metabolske sykdommer, stress følsomhet, progeria syndromer og svekket helbredelse7,8 og er, delvis, ansvarlig for de mange alder-relaterte sykdommer, slik som aterosklerose, artrose, muskel degenerasjon, sårdannelse, og Alzheimers sykdom9,10,11,12,13. Eliminere senescent celler kan bidra til å forebygge eller forsinke vevs dysfunksjon og forlenge healthspan14. Dette har blitt vist i transgene Mouse-modellene14,15,16 , så vel som ved å bruke senolytic legemidler og legemiddel kombinasjoner som ble oppdaget gjennom både narkotika screening og Bioinformatic analyse av trasé indusert spesielt i senescent celler17,18,19,20,21,22. Identifisere mer optimal senotherapeutic narkotika, i stand til å mer effektivt redusere senescent celle byrde, er et viktig neste skritt i utviklingen av terapeutiske tilnærminger for sunn aldring.
Senescent celler viser karakteristiske fenotypiske og molekylære trekk, både i kultur og in vivo. Disse senescence markører kan være enten årsaken eller resultatet av senescence induksjon eller et biprodukt av molekylære endringer i disse cellene. Men ingen enkelt markør er funnet spesielt i senescent celler. Foreløpig er senescence-assosiert β-galaktosidase (SA-β-gal) deteksjon en av de beste-karakterisert og etablerte single-celle baserte metoder for å måle senescence in vitro og in vivo. SA-β-gal er en lysosomal Hydrolase med en optimal enzymatisk aktivitet ved pH 4. Måling av sin aktivitet ved pH 6 er mulig fordi senescent celler viser økt lysosomal aktivitet23,24. For levende celler, økt lysosomal pH oppnås ved lysosomal alkalinization med vacuolar H+-ATPase inhibitor Bafilomycin a1 eller endosomal forsuring inhibitor Chloroquine25,26. 5-Dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galaktopyranosid (C12FDG) brukes som substrat i levende celler som den beholder kløyvde produkt i cellene på grunn av sin 12 karbon lipofile moiety25. Viktigere, SA-β-gal aktivitet i seg selv er ikke direkte forbundet med noen sti identifisert i senescent celler og er ikke nødvendig å indusere senescence. Med denne analysen, kan senescent celler identifiseres selv i heterogene celle populasjoner og aldring vev, slik som huden biopsier fra eldre individer. Det har også blitt brukt til å vise en sammenheng mellom celle senescence og aldring23 som det er en pålitelig markør for senescent celle deteksjon i flere organismer og betingelser27,28,29, 30i det. Her, en høy gjennomstrømning SA-β-gal screening analysen basert på fluorescerende substrat C12FDG hjelp primær mus embryonale fibroblaster (MEFs) med robust oksidativt stress indusert celle senescence er beskrevet og dens fordeler og ulemper diskuteres. Selv om denne analysen kan utføres med ulike celletyper, bruk av Ercc1-mangelfull, DNA reparasjon svekket MEFs muliggjør raskere induksjon av senescence under forhold med oksidativt stress. I mus, redusert uttrykk for DNA-reparasjon endonuclease ERCC1-XPF forårsaker nedsatt DNA-reparasjon, akselerert opphopning av endogene DNA skade, forhøyet ROS, mitokondrie dysfunksjon, økt senescent celle byrde, tap av stilk cellen funksjon og prematur aldring, i likhet med naturlig aldring31,32. Tilsvarende Ercc1-mangelfull MEFs gjennomgår senescence raskere i kultur17. En viktig funksjon i senescent MEF analysen er at hver brønn har en blanding av senescent og ikke-senescent celler, slik at for den klare demonstrasjon av senescent celle-spesifikke effekter. Men selv om vi tror at bruk av oksidativt stress i primær celler for å indusere senescence er mer fysiologiske, denne analysen også kan brukes med cellelinjer der senescence er indusert med DNA skadelige stoffer som etoposid eller bestråling.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:928px;" width="928">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">DMEM&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Corning</td>
			<td style="width:344px;">10-013-CV</td>
			<td style="width:167px;">medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ham&#39;s F10</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12390-035</td>
			<td style="width:167px;">medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">fetal bovine serum</td>
			<td>Tissue Culture Biologics</td>
			<td>101</td>
			<td style="width:167px;">serum</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1x non-essential amino acids</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-025-Cl</td>
			<td style="width:167px;">amino-acids</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">bafilomycin A1&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B1793</td>
			<td style="width:167px;">lysosomal inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">C12FDG</td>
			<td>Setareh Biotech</td>
			<td>7188</td>
			<td style="width:167px;">b-Gal substrate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hoechst 33342&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H1399</td>
			<td style="width:167px;">DNA intercalation agent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">17DMAG</td>
			<td>Selleck Chemical LLC</td>
			<td>50843</td>
			<td style="width:167px;">HSP90 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">InCell6000 Cell Imaging System</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">High Content Imaging System</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sa-&#946;-galactosidase-based screening assay for the identification of senotherapeutic drugs

Cell senescence er et av kjennetegnene på aldring kjent for å negativt påvirke en sunn levetid. Narkotika i stand til å drepe senescent celler spesielt i cellekultur, betegnet senolytics, kan redusere senescent celle byrden i vivo og forlenge healthspan. Flere klasser av senolytics har blitt identifisert hittil inkludert HSP90 hemmere, BCL-2 familie hemmere, piperlongumin, en FOXO4 hemmende peptid og kombinasjonen av dasatinib/quercetin. Påvisning av SA-β-gal ved økt lysosomal pH er en av de beste karakterisert markører for påvisning av senescent celler. Live celle målinger av senescence-assosiert β-galaktosidase (SA-β-gal) aktivitet ved hjelp av fluorescerende substrat C12FDG i kombinasjon med fastsettelse av det totale celle tallet ved hjelp av en DNA interkalering Hoechst Dye åpner muligheten til å skjermen for senotherapeutic medikamenter som enten redusere total SA-β-gal aktivitet ved å drepe av senescent celler (senolytics) eller ved å undertrykke SA-β-gal og andre fenotyper av senescent celler (senomorphics). Bruk av et høyt innhold fluorescerende bildeoppkjøp og analyseplattform gjør det mulig for rask, høy gjennomstrømming screening av stoffet bibliotekene for effekter på SA-β-gal, celle morfologi og celle nummer.

SA-β-gal aktivitet kan oppdages i celler som er indusert for å senesce av ulike måter fra replicative utmattelse, gentoksisk og oksidativt stress, til diagnostisk aktivisering23,38. I dagens modell med Ercc1-mangelfull mus embryonale Fibroblast celler, normoxic vekstforhold (20% O2) var tilstrekkelig til å indusere celle senescence etter dyrking av dem for et par passasjer...

Watch this Scientific Journal Video about SA-ÃŽÂ²-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs at JoVE.com

SA-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cellular senescence er nøkkelen faktor i utviklingen av kroniske alder-relaterte patologi. Identifisering av legemiddel selskap som mål senescent celler viser løftet for å forlenge sunn aldring. Her presenterer vi en roman analysen til skjermen for identifisering av senotherapeutics basert på måling av senescence knyttet β-Galaktosidase aktivitet i enkeltceller.

SA-β-Galaktosidase-basert screening analysen for identifisering av Senotherapeutic narkotika

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

Vi beskriver her for første gang en metode som tillater høy gjennomstrømning narkotika screening for senotherapeutic forbindelser som har vist seg å være gunstig i aldring-relaterte sykdommer. Faktisk er flere kliniske studier med legemidler testet i denne essensen for tiden pågående. Den største fordelen med denne teknikken er å skille mellom to typer senotherapeutic narkotika, senolytika og senomorphics, ved hjelp av veletablert påvisning av SA-beta-Galaktosidase i senescent celler.Denne teknikken er et viktig screeningverktøy for nye senotherapeutic forbindelser. Faktisk er flere forbindelser som har blitt identifisert ved hjelp av denne skjermen omtalt i ulike høyprofilerte publikasjoner, og er for tiden i klinisk studie. Denne teknikken er ekstremt allsidig, og kan tilpasses flere skjermer med høy gjennomstrømming.Faktisk er det mulig å multipleksskjermer, og skjerm for forbindelser som undertrykker senescence via aktivering eller hemming av en av flere veier. Hakke hvert embryo i en millimeter stykker og rør det opp og ned flere ganger. Deretter legger du til 10 milliliter vekstmedium til vevet til hvert embryo.Plate dem i en 10 centimeter kultur rett, og inkuber ved 37 grader Celsius i 3% oksygen og 5% karbondioksid i to til tre dager. Og inkuber resten av hvert embryo med 0,25% trypsin EDTA-blanding i 10 minutter. For å prøvepsinisere celler, først, fjern forsiktig vekstmediet og vask cellene med 10 milliliter 1X PBS to ganger.Deretter legger du til to milliliter av en 025 trypsin EDTA-løsning til cellene, og inkuberer dem ved 37 grader Celsius i to til tre minutter. Deretter inspiserer du cellene under et mikroskop for å sikre at cellene er løsrevet fra overflaten. Legg til samme mengde vekstmedium for å avslutte trypsinfordøyelsen, og overfør cellene til et konisk rør.Deretter sentrifuger cellene ved 200 ganger G i tre minutter. Kast det overnaturlige, og tilsett fersk vekstmedium for å suspendere cellene på nytt. Deretter teller cellene og frø dem i nye plater på den projiserte celletettheten.For ikke-senescent subcultivation, først, delt samtidige celler på en en-til-fire ratio. Deretter inkubere celler ved 37 grader Celsius i 3% oksygen og 5% karbondioksid for å strekke seg for en annen passasje. Deretter, for å indusere cellesenscence, frø splittet samløpet celler fra passasje en i forholdet mellom en til fire og inkubere dem ved 37 grader Celsius i 20% oksygen og 5% karbondioksid miljø i tre dager.For å overvåke cellulær senescence, med et avansert Coulter Cell Counter-system, måler du den gradvise økningen i cellediameter og cellevolum under hvert trypsiniseringstrinn. For å begynne beta-Gal screening analyse, frø 5, 000 senescent celler eller 3000 ikke-senescent celler per brønn i 96 brønnplater. Deretter legger du til 100 mikroliter vekstmedium til hver brønn og inkubere celler ved 37 grader Celsius og 20% oksygen og 5% karbondioksid i seks timer.Deretter legger du til legemiddelfortynninger til MEF-celler og inkuberer cellene ved 37 grader Celsius i 20% oksygen og 5% karbondioksid i 24 til 48 timer. Etter inkubasjon, fjern legemiddeloppløsningen og vask celler med 100 mikroliter 1X PBS. For å indusere lysosomal alkalisering, pre-behandle celler med 90 mikroliter bafilomycin A1 løsning, fortynnet i friske celle kultur medium ved en endelig konsentrasjon på 100 nanomolar.Deretter inkubere celler ved 37 grader Celsius i 20% oksygen og 5% karbondioksidmiljø i en time. For fluorescensanalyse av SA-beta-Gal-aktivitet, lag en ny arbeidsløsning av C12FDG fortynnet i vekstmedium, med en endelig konsentrasjon på 100 mikromos. Deretter legger du til 10 mikroliter av arbeidsløsningen til kulturmediet ved en endelig konsentrasjon på 10 mikromos, og inkubere celler ved 37 grader Celsius i 20% oksygen og 5% karbondioksid i to timer.Vask celler med 100 mikroliter 1X PBS. Deretter legger du til to mikroliter av en 100 mikrogram per milliliter Hoechst 33342 fargestoff ved en endelig konsentrasjon på to mikrogram per milliliter. Inkuber cellene ved 37 grader Celsius, 20% oksygen og 5% karbondioksid i 20 minutter.Etter inkubasjon, fjern mediet, legg til 100 mikroliter med frisk vekstmedium, og fortsett til bildebehandling. I denne studien, en høyinnhold fluorescerende bilde oppkjøp og analyse plattform tillatt for identifisering av senolytiske legemidler, som 17-DMAG, som reduserte den generelle SA-beta-Gal aktiviteter i murine embryonale fibroblast cellekulturer som inneholder senescent celler i passasje fem. De programvaregenererte kvantitative analysene av blandinger av senescent og ikke-senescent celler gir mulighet for klar demonstrasjon av senescent cellespesifikke effekter, og eliminering av bakgrunn beta-galaktosidase aktivitet av bafilomycin A.Sørg for at alle nødvendige cellekontroller er inkludert, spesielt ubehandlede senescent celler og senescent celler behandlet med en positiv kontroll.Dette essayet inkluderer arbeid med primære celler under oksidativt stress, noe som kan føre til variasjon som må overvåkes. Denne prosedyren er det første trinnet i påvisning av senterapeutiske legemidler. Ytterligere celle levedyktighet og celle senescent essays må utføres for å bekrefte screening resultatene.Flere nye senolytiske legemidler har blitt oppdaget ved hjelp av dette essayet, inkludert den første senolytiske legemiddelkombinasjonen dasatinib quercetin, varmesjokkprotein 90-hemmere, Bcl-2-familiehemmere og polyfenolfisetin.

Research

JoVE Journal

Biology

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Fluorescens-mikroskopi Screening og neste generasjons sekvensering: Nyttige verktøy for identifikasjon av gener involvert i Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

En fluoriserende Screening Assay for å identifisere modulatorer av GIRK kanaler

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identifisering av Post-translasjonell Modifikasjoner av Plant Protein komplekser

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

RNA Catalyst som reporter for Screening narkotika mot RNA Redigering i trypanosomer

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Høy gjennomstrømming Screening for kjemi modulatorer av Post-transcriptionally Regulerte Gener

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Identifisering av kinase-substrat Pairs Bruke Høy throughput screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunutfelling analyse for identifikasjon av Arabidopsis Protein-DNA interaksjoner<em&gt; I Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Identifikasjon av nye regulatorer av plantetranspirasjon ved storskala termisk bildebehandling screening i Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. ...