Name: sa-&#946;-galactosidase-based screening assay for the identification of senotherapeutic drugs
Uploaded: 2019-06-28T14:30:00
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Este trabalho foi apoiado pelo NIH Grants AG043376 (Project 2 e Core A, PDR; Projeto 1 e núcleo B, LJN) e AG056278 (projeto 3 e núcleo A, PDR; e projeto 2, LJN) e uma concessão da Fundação de Glenn (LJN).

O uso de animais foi aprovado pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Scripps Florida.
1. geração de fibroblastos embrionários senescentes murinos (MEF) – 12-15 dias
<ol><li>Isole o tipo selvagem e o Ercc1-/- mefs dos ratos fêmeas grávidos no dia embrionário 13 (E13) como descrito previamente33. Nota: todas as etapas seguintes são executadas em uma capa da cultura do tecido circunstâncias assépticas e usando instrum...

SA-β-GAL é um biomarcador bem definido para a senescência celular originalmente descoberta por Dimri et al. (1995) mostrando que os fibroblastos humanos senescentes aumentaram a atividade da SA-β-GAL quando analisados em pH 623 em comparação com as células proliferantes. Entretanto, os ensaios in vitro e in vivo para SA-β-GAL foram estabelecidos para diferentes tipos de células e tecidos25,39,...

A senescência celular foi descrita pela primeira vez por Leonard Hayflick e Paul Moorhead, que mostraram que as células normais tinham uma capacidade limitada de proliferar na cultura1. As células senescentes não proliferam apesar da presença de nutrientes, fatores de crescimento e falta de inibição de contato, mas permanecem metabolicamente ativos2. Esse fenômeno é conhecido como senescência replicativa e foi atribuído principalmente ao encurtamento do telômero, pelo menos nas células humanas3. Estudos adicionais mostraram que as células também podem ser induzidas a sofrer senescência em resposta a outros estímulos, como estresse oncogênico (senescência induzida por oncogenes, OIS), dano de DNA, drogas citotóxicas ou irradiação (senescência induzida por estresse, SIS)4 , 5. º , 6. em resposta a danos de DNA, incluindo a erosão do telômero, células ou senesce, iniciar o crescimento celular descontrolado, ou submeter-se a apoptose se o dano não pode ser reparado. Neste caso, a senescência da pilha parece ser benéfica porque actua em uma maneira supressiva do tumor2. Em contraste, a senescência é aumentada com o envelhecimento devido ao acúmulo de danos celulares, incluindo danos ao DNA. Desde que as pilhas senescentes podem secretar cytokines, metaloproteinases e fatores de crescimento, denominados o phenotype secretora senescência-associado (SASP), este aumento idade-dependente na senescência celular e no SASP contribui à homeostase diminuída do tecido e subsequentemente envelhecimento. Além disso, esse aumento dependente da idade na carga de senescência é conhecido por induzir doenças metabólicas, sensibilidade ao estresse, síndromes de progeria e cicatrização prejudicada7,8 e é, em parte, responsável pelas inúmeras doenças como aterosclerose, osteoartrite, degeneração muscular, formação de úlcera e doença de Alzheimer9,10,11,12,13. Eliminar as células senescentes pode ajudar a prevenir ou atrasar a disfunção tecidual e estender o Califórnia14. Isso tem sido demonstrado em modelos de camundongo transgênico14,15,16, bem como usando drogas senolíticas e combinações de drogas que foram descobertas através de ambos os esforços de triagem de drogas e análise Bioinformatica de vias induzidas especificamente em células senescentes17,18,19,20,21,22. A identificação de medicamentos senoterapêuticos mais ideais, capazes de reduzir de forma mais efetiva a carga celular senescente, é um passo importante no desenvolvimento de abordagens terapêuticas para o envelhecimento saudável.
As pilhas senescent mostram características fenotípicas e moleculars característicos, na cultura e in vivo. Estes marcadores da senescência podiam ser a causa ou o resultado da indução da senescência ou de um subproduto de mudanças moleculars nestas pilhas. No entanto, nenhum único marcador é encontrado especificamente em células senescentes. Atualmente, a detecção de β-galactosidase (SA-β-GAL) associada à senescência é um dos métodos mais caracterizados e estabelecidos com base em uma única célula para medir a senescência in vitro e in vivo. SA-β-GAL é uma hidrolase lisossomal com uma atividade enzimática ótima em pH 4. A mensuração de sua atividade em pH 6 é possível porque as células senescentes apresentam aumento da atividade lisossomal23,24. Para as células vivas, o aumento do pH lisossomal é obtido por alcalinização lisossomal com o inibidor vacuolar H+-ATPase bafilomicina a1 ou o inibidor da acidificação endossômica cloroquina25,26. 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside (C12FDG) é usado como substrato em células vivas, pois retém o produto clivada nas células devido à sua 12 fração lipofílica de carbono25. Importante, a atividade do SA-β-GAL própria não é conectada diretamente com nenhum caminho identificado em pilhas senescentes e não é necessário induzir a senescência. Com este ensaio, as células senescentes podem ser identificadas mesmo nas populações de células heterogêneas e nos tecidos de envelhecimento, como biópsias de pele de indivíduos mais velhos. Ele também tem sido usado para mostrar uma correlação entre a senescência celular e envelhecimento23 , pois é um marcador confiável para detecção de células senescentes em vários organismos e condições27,28,29, a 30. Aqui, um ensaio de triagem de SA-β-GAL de alta taxa de transferência baseado no substrato fluorescente C12FDG usando fibroblastos embrionários do mouse primário (mefs) com a senescência de células induzida por estresse oxidativo robusto é descrito e suas vantagens e desvantagens são discutidos. Embora este ensaio possa ser executado com tipos diferentes da pilha, o uso de Ercc1-deficiente, mefs danificado do reparo do ADN permite a indução mais rápida da senescência condições do stress oxidativo. Em camundongos, a expressão reduzida do reparo do DNA endonuclease ERCC1-XPF causa o reparo danificado do ADN, acumulação acelerada de dano endógeno do ADN, ROS elevados, deficiência orgânica mitochondrial, carga senescentes aumentada da pilha, perda da função da pilha de haste e envelhecimento prematuro, semelhante ao envelhecimento natural31,32. Similarmente, os MEFs Ercc1-deficientes submetem-se à senescência mais ràpida na cultura17. Uma característica importante do ensaio senescente de MEF é que cada poço tem uma mistura de células senescentes e não senescentes, permitindo a demonstração clara de efeitos específicos de células senescentes. No entanto, embora acreditemos que o uso de estresse oxidativo nas células primárias para induzir a senescência é mais fisiológico, este ensaio também pode ser usado com linhas celulares onde a senescência é induzida com agentes nocivos do DNA, como etoposide ou irradiação.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:928px;" width="928">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">DMEM&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Corning</td>
			<td style="width:344px;">10-013-CV</td>
			<td style="width:167px;">medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ham&#39;s F10</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12390-035</td>
			<td style="width:167px;">medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">fetal bovine serum</td>
			<td>Tissue Culture Biologics</td>
			<td>101</td>
			<td style="width:167px;">serum</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1x non-essential amino acids</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-025-Cl</td>
			<td style="width:167px;">amino-acids</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">bafilomycin A1&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B1793</td>
			<td style="width:167px;">lysosomal inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">C12FDG</td>
			<td>Setareh Biotech</td>
			<td>7188</td>
			<td style="width:167px;">b-Gal substrate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hoechst 33342&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H1399</td>
			<td style="width:167px;">DNA intercalation agent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">17DMAG</td>
			<td>Selleck Chemical LLC</td>
			<td>50843</td>
			<td style="width:167px;">HSP90 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">InCell6000 Cell Imaging System</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">High Content Imaging System</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sa-&#946;-galactosidase-based screening assay for the identification of senotherapeutic drugs

A senescência celular é uma das marcas de envelhecimento conhecidas por influenciar negativamente uma vida saudável. Drogas capazes de matar células senescentes especificamente na cultura celular, denominado senolíticos, pode reduzir a carga celular senescente in vivo e estender healthspan. Foram identificadas várias classes de senolíticos até à data, incluindo inibidores da HSP90, inibidores da família Bcl-2, piperlongumina, um peptídeo inibitório FOXO4 e a combinação de Dasatinib/quercetina. A detecção de SA-β-GAL em um aumento do pH lisossomal é um dos melhores marcadores caracterizados para a detecção de células senescentes. Medições de células ao vivo de atividade de β-galactosidase (SA-β-GAL) associada à senescência usando o substrato fluorescente C12FDG em combinação com a determinação do número total de células usando um corante de Hoechst de intercalação de DNA abre a possibilidade de tela para medicamentos senoterapêuticos que reduzem a atividade geral de SA-β-GAL por morte de células senescentes (senolíticos) ou suprimindo SA-β-GAL e outros fenótipos de células senescentes (senomorphics). O uso de uma plataforma de aquisição e análise de imagens fluorescentes de alto conteúdo permite a triagem rápida e de alta produtividade de bibliotecas de medicamentos para efeitos em SA-β-GAL, morfologia celular e número de células.

A atividade de SA-β-GAL pode ser detectada em células induzidas a continuamente por várias formas de exaustão replicativa, estresse genotóxico e oxidativo, à ativação do oncogene23,25,38. No modelo atual utilizando células de fibroblastos embrionárias com deficiência de camundongo Ercc1, as condições de crescimento normoxicas (20% O2) foram suficientes para induzi...

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SA-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

A senescência celular é o fator-chave no desenvolvimento de patologias crônicas relacionadas à idade. A identificação da terapêutica que visam as células senescentes mostra a promessa de estender o envelhecimento saudável. Aqui, nós apresentamos um ensaio novo à tela para a identificação do senotherapeutics baseado na medida da atividade associada da senescência β-galactosidase em únicas pilhas.

Ensaio de triagem à base de SA-β-galactosidase para a identificação de medicamentos Senoterapêuticos

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

Descrevemos aqui pela primeira vez um método que permite a triagem de medicamentos de alto rendimento para compostos senoterapêuticos que têm se mostrado benéficos em doenças relacionadas ao envelhecimento. De fato, vários ensaios clínicos com medicamentos testados nesta essência estão em andamento. A principal vantagem desta técnica é distinguir entre dois tipos de drogas senoterapêuticas, senolíticos e senomórficos, usando a detecção bem estabelecida de SA-beta-Galactosidase em células senescentes.Esta técnica é uma importante ferramenta de triagem para novos compostos senoterapêuticos. De fato, vários compostos que foram identificados com a ajuda desta tela são apresentados em várias publicações de alto perfil, e estão atualmente em teste clínico. Esta técnica é extremamente versátil, e pode ser adaptada a várias telas de alto rendimento.Na verdade, é possível telas multiplex, e tela para compostos que suprimem a senescência através da ativação ou inibição de uma das várias vias. Pique cada embrião em pedaços de um milímetro e encose-o várias vezes. Em seguida, adicione 10 mililitros de crescimento médio aos tecidos de cada embrião.Emplaque-os em um prato de cultura de 10 centímetros, e incubar a 37 graus Celsius em 3% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono por dois a três dias. E incubar o resto de cada embrião com 0,25% de mistura EDTA de trippsina por 10 minutos. Para tentar experimentar as células, primeiro, remova cuidadosamente o meio de crescimento e lave as células com 10 mililitros de 1X PBS duas vezes.Em seguida, adicione dois mililitros de uma solução EDTA de trippsina 025 às células, e incuba-os a 37 graus Celsius por dois a três minutos. Em seguida, inspecione as células sob um microscópio para garantir que as células sejam separadas da superfície. Adicione a mesma quantidade de meio de crescimento para terminar a digestão de trippsina e transfira as células para um tubo cônico.Em seguida, centrifugar as células a 200 vezes G por três minutos. Descarte o supernasce e adicione meio de crescimento fresco para suspender as células. Em seguida, conte as células e semee as em novas placas na densidade celular projetada.Para subcultivação não senescente, primeiro, células confluentes divididas em uma proporção de um para quatro. Em seguida, incubar células a 37 graus Celsius em 3% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono para estender para outra passagem. Em seguida, para induzir a senescência celular, as sementes dividem as células confluentes da passagem um a uma proporção de um a quatro e incubam-nas a 37 graus Celsius em 20% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono por três dias.Para monitorar a senescência celular, com um avançado sistema Coulter Cell Counter, meça o aumento gradual do diâmetro celular e do volume celular durante cada etapa de trypsinização. Para iniciar o ensaio de triagem beta-Gal, sementes 5.000 células senescentes ou 3.000 células não senescentes por poço em 96 placas de poço. Em seguida, adicione 100 microliters de crescimento médio a cada poço e incubar células a 37 graus Celsius e 20% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono por seis horas.Em seguida, adicione diluições de drogas às células MEF e incuba as células a 37 graus Celsius em 20% de oxigênio e 5% dióxido de carbono por 24 a 48 horas. Após a incubação, remova a solução de medicamentos e lave células com 100 microliters de 1X PBS. Para induzir a alcalinização lisesômica, pré-tratar células com 90 microlitadores de solução bafilomicina A1, diluídas em meio de cultura celular fresca em uma concentração final de 100 nanomolar.Em seguida, incubar células a 37 graus Celsius em 20% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono por uma hora. Para análise de fluorescência da atividade SA-beta-Gal, faça uma nova solução de trabalho de C12FDG diluída em meio de crescimento, em uma concentração final de 100 micromolar. Em seguida, adicione 10 microliters da solução de trabalho ao meio da cultura em uma concentração final de 10 micromolares, e incubar células a 37 graus Celsius em 20% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono por duas horas.Lave células com 100 microliters de 1X PBS. Em seguida, adicione dois microliters de um corante Hoechst 33342 de 100 microgramas por mililitro, a uma concentração final de dois microgramas por mililitro. Incubar as células a 37 graus Celsius, 20% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono por 20 minutos.Após a incubação, remova a mídia, adicione 100 microliters de meio de crescimento fresco e prossiga para a imagem. Neste estudo, uma plataforma de aquisição e análise de imagem fluorescente de alto teor permitiu a identificação de medicamentos senolíticos, como o 17-DMAG, que reduziu as atividades globais de SA-beta-Gal em culturas de células fibroblastos embrionárias murinas contendo células senescentes na passagem cinco. As análises quantitativas geradas pelo software de misturas de células senescentes e não senescentes permitem a demonstração clara de efeitos senescentes específicos das células, e a eliminação da atividade beta-galactosidase de fundo por bafilomicina A.Certifique-se de que todos os controles celulares necessários estão incluídos, especialmente células senescentes não tratadas e células senescentes tratadas com um controle positivo.Este ensaio inclui trabalhar com células primárias sob estresse oxidativo, o que pode levar a variações que precisam ser monitoradas. Este procedimento é o primeiro passo na detecção de medicamentos senoterapêuticos. Viabilidade celular adicional e ensaios senescentes celulares precisam ser realizados para confirmar os resultados da triagem.Várias novas drogas senolíticas foram detectadas usando este ensaio, incluindo a primeira combinação de drogas senolíticas dasatinib quercetin, inibidores de proteína de choque térmico 90, inibidores familiares Bcl-2, e a fisetina polifenol.

Research

JoVE Journal

Biology

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

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Biologia

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