Name: sa-&#946;-galactosidase-based screening assay for the identification of senotherapeutic drugs
Uploaded: 2019-06-28T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about SA-ÃŽÂ²-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs at JoVE.com

Эта работа была поддержана NIH Grants AG043376 (Проект 2 и Ядро А, ДНР; Проект 1 и Core B, LJN) и AG056278 (Проект 3 и Ядро A, PDR; и Проект 2, LJN) и грант от Фонда Гленна (LJN).

Использование животных было одобрено Комитетом по институциональному уходу и использованию животных ВАЗа, штат Флорида.
1. Поколение стареющее морин эмбрионального фибробласта (MEF) - 12-15 дней
<ol><li>Изолировать дикий тип и Ercc1-/- MEFs от беременных самок мышей в эмбр...

СА-З-Гал является четко определенным биомаркером клеточного сенесценции, первоначально обнаруженным Димри и др. (1995), показывающий, что старческие фибробласты человека имеют повышенную активность SA-и-Gal при оценке на рН 623 по сравнению с размножающимися клетками. Между...

Сотовый сенесценции был описан в первый раз Леонард Хейфлик и Пол Мурхед, который показал, что нормальные клетки имели ограниченную способность размножаться в культуре1. Чувствительные клетки не размножаться, несмотря на наличие питательных веществ, факторы роста и отсутствие ингибирования контакта, но остаются метаболически активными2. Это явление известно как репликативное сенесценции и в основном связано с сокращением теломер, по крайней мере в клетках человека3. Дальнейшие исследования показали, что клетки также могут подвергаться сенесценции в ответ на другие стимулы, такие как онкогенный стресс (онкоген индуцированный сенесценции, ОИС), повреждение ДНК, цитотоксические препараты, или облучение (стресс индуцированного сенесценции, SIS)4 , 5 , 6. В ответ на повреждение ДНК, в том числе эрозии теломер, клетки либо senesce, начать неконтролируемый рост клеток, или пройти апоптоз, если повреждение не может быть восстановлена. В этом случае, ценение клеток, кажется, полезно, как он действует в опухоли подавляет образом2. В отличие от этого, сенесценция увеличивается со старением из-за накопления повреждения клеток, включая повреждение ДНК. Так как старческие клетки могут выделять цитокины, металлопротеины и факторы роста, называемые сенесценции связанных секреторный фенотип (SASP), это возрастно-зависимое увеличение клеточного сенесценции и SASP способствует снижению ткани гомеостаза и впоследствии старения. Кроме того, это возрастно-зависимое увеличение бремени старения, как известно, вызывают метаболические заболевания, чувствительность к стрессу, синдромы прогерии, и нарушение исцеления7,8 и, в частности, отвечает за многочисленные возрастные заболеваний, таких как атеросклероз, остеоартрит, мышечная дегенерация, образование язвы, и болезнь Альцгеймера9,10,11,12,13. Устранение старческих клеток может помочь предотвратить или отсрочить дисфункцию тканей и продлить healthspan14. Это было показано в трансгенных моделях мыши14,15,16, а также с помощью сеноличных препаратов и комбинаций лекарств, которые были обнаружены как с помощью усилий по скринингу наркотиков и биоинформатический анализ пути, индуцированные специально в старческих клетках17,18,19,20,21,22. Выявление более оптимальных сенотерапевтических препаратов, способных более эффективно снизить бремя старческих клеток, является важным следующим шагом в развитии терапевтических подходов к здоровому старению.
Чувствительные клетки имеют характерные фенотипические и молекулярные особенности, как в культуре, так и в vivo. Эти маркеры сенесценции могут быть либо причиной, либо результатом индукции сенесценции, либо побочным продуктом молекулярных изменений в этих клетках. Тем не менее, ни один маркер не найден конкретно в старческих клетках. В настоящее время, сенесценция связанных й-galactosidase (SA-я-Гал) обнаружение является одним из наиболее характерных и установленных одноклеточных методов для измерения сенесценции в пробирке и in vivo. СА-З-Гал – это лизосомальная гидролаза с оптимальной ферментативной активностью при рН 4. Измерение его активности при рН 6 возможно, потому что старческие клетки показывают повышенную лисосомальную активность23,24. Для живых клеток, увеличение лизосомального рН получается путем лизосомальной щелочной с вакуолярной H -ATPase ингибитор Bafilomycin A1 или эндосомальный ингибификатор подкисления хлорохин25,26. 5-Dodecanoylaminofluorescein Ди-з-D-galactopyranoside (C12FDG) используется в качестве субстрата в живых клетках, как он сохраняет расщепляние продукта в клетках из-за его 12 углеродных липофильных moiety25. Важно отметить, что сама деятельность SA-q-Gal не связана напрямую с каким-либо путем, выявленным в старческих клетках, и не является необходимой для того, чтобы вызвать сенесценцию. С помощью этого отзыва, старческие клетки могут быть определены даже в неоднородных популяций клеток и старения тканей, таких как биопсии кожи от пожилых людей. Он также был использован, чтобы показать корреляцию между старением клеток и старения23, как это надежный маркер для обнаружения старческих клеток в нескольких организмах и условиях27,28,29, 30. Здесь описывается скрининговый анализ с высокой пропускной результатом SA-'-Gal, основанный на флуоресцентном субстрате C12FDG с использованием первичных эмбриональных фибробластов мыши (MEFs) с надежно окислительным стрессом, индуцированным клеточным сенесценцией, и описаны его преимущества и недостатки обсуждаются. Хотя этот анализ может быть выполнен с различными типами клеток, использование Ercc1-дефицит,ремонт ДНК нарушения MEFs позволяет более быстроиндукции сенесценции в условиях окислительного стресса. У мышей снижение экспрессии эндонуклеи реаниализа ДНК ERCC1-XPF вызывает нарушение репарации ДНК, ускоренное накопление эндогенных повреждений ДНК, повышенную ROS, митохондриальную дисфункцию, повышенную старческой клеточной нагрузки, потерю функции стволовых клеток и преждевременное старение, аналогично естественному старению31,32. Аналогичным образом, Ercc1-дефицитныеMEFs проходят сенесценцию быстрее в культуре17. Важной особенностью старческого игпромата meF является то, что каждая скважина имеет смесь старческих и нестареческих клеток, что позволяет четко проявлять старческие клеточные эффекты. Однако, хотя мы считаем, что использование окислительного стресса в первичных клетках, чтобы вызвать сенесценцию является более физиологическим, этот анализ также может быть использован с клеточными линиями, где сенесценция индуцируется с ДНК повреждающих агентов, таких как этопозид или облучение.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:928px;" width="928">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">DMEM&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Corning</td>
			<td style="width:344px;">10-013-CV</td>
			<td style="width:167px;">medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ham&#39;s F10</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12390-035</td>
			<td style="width:167px;">medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">fetal bovine serum</td>
			<td>Tissue Culture Biologics</td>
			<td>101</td>
			<td style="width:167px;">serum</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1x non-essential amino acids</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-025-Cl</td>
			<td style="width:167px;">amino-acids</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">bafilomycin A1&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B1793</td>
			<td style="width:167px;">lysosomal inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">C12FDG</td>
			<td>Setareh Biotech</td>
			<td>7188</td>
			<td style="width:167px;">b-Gal substrate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hoechst 33342&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H1399</td>
			<td style="width:167px;">DNA intercalation agent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">17DMAG</td>
			<td>Selleck Chemical LLC</td>
			<td>50843</td>
			<td style="width:167px;">HSP90 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">InCell6000 Cell Imaging System</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">High Content Imaging System</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sa-&#946;-galactosidase-based screening assay for the identification of senotherapeutic drugs

Чувствительность клеток является одной из отличительных черт старения, как известно, негативно влияет на здоровую продолжительность жизни. Препараты, способные убивать старческие клетки специально в клеточной культуре, называют сенолитикой, могут уменьшить бремя старнейки клеток in vivo и расширить продолжительность жизни. На сегодняшний день выявлено несколько классов сенолитики, включая ингибиторы HSP90, ингибиторы семейства Bcl-2, пиперлонгумин, пептид ингибитор FOXO4 и сочетание дасатиниба/кверцетина. Обнаружение SA--з-Gal при повышенном лисосомальном рН является одним из наиболее характерных маркеров для обнаружения старческих клеток. Измерения живых клеток, связанных с сенесценцией, ассоциированной активностью (SA-q-Gal) с использованием флуоресцентного субстрата C12FDG в сочетании с определением общего числа клеток с помощью ДНК, интеркалирующей краситель Hoechst, открывает возможность экран для сенотерапевтических препаратов, которые либо уменьшают общую активность SA-и-Gal путем уничтожения старческих клеток (сенолитики) или путем подавления SA-и-Gal и других фенотипов старческих клеток (сеноморфики). Использование платформы для приобретения и анализа высокой содержания флуоресцентных изображений позволяет быстро, высокой пропускной проверки библиотек лекарственных средств для воздействия на SA-и-Gal, морфологию клеток и номер клеток.

Активность SA---Gal может быть обнаружена в клетках, которые индуцируются к сенесу различными способами от репликативного истощения, генотоксического и окислительного стресса до активации онкогена23,25,38. В текущей модел?...

Watch this Scientific Journal Video about SA-ÃŽÂ²-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs at JoVE.com

SA-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Клеточная чувствительность является ключевым фактором в развитии хронических возрастных патологий. Идентификация терапевтических средств, которые нацелены на старческие клетки, показывает перспективу для расширения здорового старения. Здесь мы представляем новый ассс для проверки для выявления сенотерапии на основе измерения сенесценции, связанной с активностью в одиночных клетках.

СА-З-Галактозидаза на основе скрининга Анализ для выявления senotherapeutic наркотиков

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

Мы описываем здесь в первый раз метод, который позволяет высокой пропускной способности скрининга наркотиков для сенотерапевтических соединений, которые были показаны, чтобы быть полезным в связанных со старением заболеваний. В самом деле, несколько клинических испытаний с препаратами испытания в этой сущности в настоящее время продолжается. Основным преимуществом этого метода является различие между двумя типами сенотерапевтических препаратов, сенолитики и сеноморфики, с помощью хорошо установленного обнаружения SA-бета-галактозидазы в старческими клетками.Этот метод является важным инструментом скрининга для новых сенотерапевтических соединений. В самом деле, несколько соединений, которые были определены с помощью этого экрана показаны в различных громких публикаций, и в настоящее время в клинических испытаниях. Этот метод является чрезвычайно универсальным и может быть адаптирован к нескольким высокой пропускной способности экранов.В самом деле, это возможно мультиплекс экранов, и экран для соединений, которые подавляют сенесценции через активацию или ингибирование одного из нескольких путей. Фарш каждого эмбриона в один миллиметр штук и трубы его вверх и вниз несколько раз. Далее добавьте 10 миллилитров среды роста к тканям каждого эмбриона.Плита их в 10 сантиметров культуры блюдо, и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в 3%кислорода и 5%углекислого газа в течение двух-трех дней. И инкубировать остальную часть каждого эмбриона с 0,25%трипсина EDTA смеси в течение 10 минут. Чтобы трипсинизировать клетки, во-первых, тщательно удалить рост среды и мыть клетки с 10 миллилитров 1X PBS в два раза.Затем добавьте два миллилитров раствора EDTA 025 трипсина в клетки и инкубировать их при 37 градусах по Цельсию в течение двух-трех минут. Затем проинспектировать клетки под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки отделены от поверхности. Добавьте такое же количество среды роста, чтобы прекратить переваривание трипсина и перенесите клетки в коническую трубку.Затем центрифуга клетки на 200 раз G в течение трех минут. Откажитесь от супернатанта и добавьте свежую среду роста, чтобы повторно приостановить клетки. Затем подсчитайте клетки и посеять их в новых пластинах при прогнозируемых плотности клеток.Для не старческого субкультивации, во-первых, разделить слияние клеток в соотношении один к четырем. Затем инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию в 3%кислорода и 5%углекислого газа, чтобы продлить для другого прохода. Далее, чтобы вызвать старение клеток, семена расщепляют слияние клеток из прохода один в соотношении один к четырем и инкубировать их при 37 градусах по Цельсию в 20%кислорода и 5%углекислого газа окружающей среды в течение трех дней.Для мониторинга клеточной сенесценции, с передовой системой Coulter Cell Counter, измерять постепенное увеличение диаметра клеток и объема клеток во время каждого шага трипсинизации. Для начала бета-Gal скрининга анализа, семян 5000 старихих клеток или 3000 не-старческие клетки на хорошо в 96 пластин хорошо. Затем добавьте 100 микролитров среды роста к каждой колодец и инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия и 20%кислороде и 5%углекислом газе в течение шести часов.Затем добавьте разбавления препарата в клетки МЭФ и инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия в 20%кислороде и 5%углекислом газе в течение 24-48 часов. После инкубации удалите раствор препарата и промыте клетки 100 микролитров 1X PBS. Чтобы вызвать лизосомальную щелочность, предварительно обработать клетки 90 микролитров раствора бафиломицинА А1, разбавленного в среде культуры свежих клеток при конечной концентрации 100 наномоляров.Затем инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия в 20%кислорода и 5%углекислого газа окружающей среды в течение часа. Для флуоресцентного анализа активности SA-beta-Gal сделайте свежий рабочий раствор C12FDG разбавленным в среде роста, при конечной концентрации 100 микромолей. Затем добавьте 10 микролитров рабочего раствора в культурную среду при конечной концентрации 10 микромоляров и инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия в 20% кислорода и 5%углекислого газа в течение двух часов.Вымойте клетки 100 микролитров 1X PBS. Затем добавьте два микролитера 100 микрограмм на миллилитр Hoechst 33342 красителя при конечной концентрации в два микрограмма на миллилитр. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия, 20% кислорода и 5%углекислого газа в течение 20 минут.После инкубации удалите средства массовой информации, добавьте 100 микролитров свежей среды роста и приступайте к визуализации. В этом исследовании, с высоким содержанием флуоресцентных изображений приобретения и анализа платформы позволило для выявления сенолитических препаратов, таких как 17-DMAG, что снижение общей SA-бета-Гал деятельности в мурин эмбриональных фибробластов клеточных культур, содержащих старческие клетки в проходе пять. Программно-генерируемый количественный анализ смесей старческими и не старческими клетками позволяет четко провести демонстрацию старческого клеточного воздействия, а также устранение фоновой активности бета-галактозидазы бафиломицином A.Убедитесь, что все необходимые элементы управления клетками включены, особенно необработанные старческие клетки и старческие клетки, обработанные с положительным контролем.Это эссе включает в себя работу с первичными клетками под окислительным стрессом, который может привести к вариации, которые должны контролироваться. Эта процедура является первым шагом в выявлении сенотерапевтических препаратов. Дополнительные жизнеспособности клеток и клеток старческие эссе должны быть выполнены для подтверждения результатов скрининга.Несколько новых сенолитических препаратов были обнаружены с помощью этого эссе, в том числе первый сенолитический препарат сочетание дасатиниб кверцетин, тепловой шок белка 90 ингибиторы, Bcl-2 семьи ингибиторы, и полифенол фицетин.

Research

JoVE Journal

Biology

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

Идентификация и анализ Мышь прародителей эритроидных использованием CD71/TER119 Flow-цитометрии Пробирной

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Флуоресценции микроскопии Скрининг и следующего поколения секвенирования: Полезные инструменты для идентификации генов, вовлеченных в органелл Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

Флуоресцентные Анализ Скрининг на выявление каналов модуляторы GIRK

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Идентификация пост-трансляционных модификаций растительных белковых комплексов

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

РНК Catalyst в качестве корреспондента Скрининг препаратов против РНК редактирования в трипаносом

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Высокопроизводительный скрининг для химических модуляторов посттранскрипционно регулируемых генов

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Идентификация киназы-подложки пар Использование высокопроизводительного скрининга


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Хроматина иммунопреципитации для идентификации Arabidopsis взаимодействий белок-ДНК<em&gt; В Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Идентификация новых регуляторов транспирации растений путем масштабного теплового скрининга в Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

На месте Гибридизация для Sipunculus nudus Coelomic жидкости

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. ...