Name: sa-&#946;-galactosidase-based screening assay for the identification of senotherapeutic drugs
Uploaded: 2019-06-28T14:30:00
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Este trabajo fue apoyado por NIH Grants AG043376 (Proyecto 2 y Núcleo A, PDR; Proyecto 1 y Core B, LJN) y AG056278 (Proyecto 3 y Núcleo A, PDR; y Proyecto 2, LJN) y una subvención de la Fundación Glenn (LJN).

El uso de animales fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Scripps Florida.
1. Generación de fibroblasto embrionario murino senescente (MEF) – 12-15 días
<ol><li>Aislar el tipo silvestre y Ercc1-/- MEF de ratones hembra embarazadas en el día embrionario 13 (E13) como se describió anteriormente33. NOTA: Todos los pasos siguientes se llevan a cabo en una campana de cultivo de tejido en condiciones asépticas...

Es un biomarcador bien definido para la senescencia celular descubierto originalmente por Dimri et al. (1995) mostrando que los fibroblastos humanos senescentes han aumentado la actividad de SA-a-Gal cuando se analizan a pH 623 en comparación con las células que proliferan. Mientras tanto, se han establecido ensayos in vitro e in vivo para SA-a-Gal para diferentes tipos de células y tejidos25,39,40<...

La senescencia celular fue descrita por primera vez por Leonard Hayflick y Paul Moorhead,quienes mostraron que las células normales tenían una capacidad limitada para proliferar en el cultivo 1. Las células senescentes no proliferan a pesar de la presencia de nutrientes, factores de crecimiento y falta de inhibición del contacto, pero permanecen metabólicamente activas2. Este fenómeno se conoce como senescencia replicativa y se atribuyó principalmenteal acortamiento de los telómeros, al menos en las células humanas 3. Otros estudios han demostrado que las células también pueden ser inducidas para someterse a senescencia en respuesta a otros estímulos, como el estrés oncogénico (senescencia inducida por oncógeno, OIS), daño al ADN, fármacos citotóxicos o irradiación (senescencia inducida por estrés, SIS)4 , 5 , 6. En respuesta a daños en el ADN, incluida la erosión de los telómeros, las células se ensacian, inician el crecimiento celular incontrolado o se someten a apoptosis si el daño no puede ser reparado. En este caso, la senescencia celular parece ser beneficiosa ya que actúa de manera supresora tumoral2. Por el contrario, la senescencia aumenta con el envejecimiento debido a la acumulación de daño celular, incluyendo daño al ADN. Dado que las células senescentes pueden secretar citoquinas, metaloproteinasas y factores de crecimiento, denominaron fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP), este aumento dependiente de la edad en la senescencia celular y SASP contribuye a disminuir la homeostasis tisular y posteriormente envejecimiento. Además, este aumento dependiente de la edad en la carga de senescencia es conocido por inducir enfermedades metabólicas, sensibilidad al estrés, síndromes de progeria, y deterioro de la curación7,8 y es, en parte, responsable de los numerosos relacionados con la edad enfermedades, como aterosclerosis, osteoartritis, degeneración muscular, formación de úlceras, y enfermedad de Alzheimer9,10,11,12,13. La eliminación de las células senescentes puede ayudar a prevenir o retrasar la disfunción tisular y extender la vida saludable14. Esto se ha demostrado en los modelos de ratón transgénico14,15,16, así como mediante el uso de fármacos senolíticos y combinaciones de fármacos que se descubrieron a través de esfuerzos de detección de drogas y análisis bioinformáticos de vías inducidas específicamente en células senescentes17,18,19,20,21,22. Identificar fármacos senoterapéuticos más óptimos, capaces de reducir más eficazmente la carga celular senescente, es un paso importante en el desarrollo de enfoques terapéuticos para el envejecimiento saludable.
Las células senescentes muestran características fenotípicas y moleculares características, tanto en cultivo como in vivo. Estos marcadores de senescencia podrían ser la causa o el resultado de la inducción de la senescencia o un subproducto de los cambios moleculares en estas células. Sin embargo, no se encuentra un solo marcador específicamente en las células senescentes. En la actualidad, la detección de la galactosidasa asociada a la senescencia (SA-Gal) es uno de los métodos basados en células únicas mejor caracterizados y establecidos para medir la senescencia in vitro e in vivo. Es una hidrolasa lisosomal con una actividad enzimática óptima a pH 4. Medir su actividad a pH 6 es posible porque las células senescentes muestran un aumento de la actividad lisosomal23,24. Para las células vivas, el aumento del pH lisosomal se obtiene mediante alcalinización lisosomal con el inhibidor vacuolar H+-ATPase Bafilomicina A1 o el inhibidor de la acidificación endosomal cloroquina25,26. 5-DodecanoylaminofluoresceinDi-o-D-galactopyraside (C12FDG) se utiliza como sustrato en células vivas ya que retiene el producto de linaza en las células debido a su 12 mitades lipofílicas de carbono25. Es importante destacar que la actividad de SA-A-Gal en sí misma no está directamente relacionada con ninguna vía identificada en las células senescentes y no es necesaria para inducir la senescencia. Con este ensayo, las células senescentes se pueden identificar incluso en las poblaciones de células heterogéneas y tejidos envejecidos, como biopsias de piel de individuos mayores. También se ha utilizado para mostrar una correlación entre la senescencia celular y el envejecimiento23 ya que es un marcador fiable para la detección de células senescentes en varios organismos y condiciones27,28,29, 30. En este caso, se describe un ensayo de cribado de alto rendimiento sA-a-Gal basado en el sustrato fluorescente C12FDG utilizando fibroblastos embrionarios de ratón primario (MEF) con senescencia celular inducida por estrés oxidativo robusto y sus ventajas y desventajas se discuten. Aunque este ensayo se puede realizar con diferentes tipos de células, el uso de Ercc1-insuficiente, DETERIORO de la reparación del ADN MEFs permite una inducción más rápida de la senescencia en condiciones de estrés oxidativo. En ratones, la reducción de la expresión de la endonucleasa de reparación del ADN ERCC1-XPF causa deterioro de la reparación del ADN, acumulación acelerada de daño endógeno del ADN, ROS elevado, disfunción mitocondrial, aumento de la carga celular senescente, pérdida de la función de las células madre y envejecimiento prematuro, similar al envejecimiento natural31,32. Del mismo modo, los MEF con deficiencia de Ercc1sufren senescencia más rápidamente en el cultivo17. Una característica importante del ensayo MEF senescente es que cada pozo tiene una mezcla de células senescentes y no senescentes, lo que permite la demostración clara de efectos específicos de células senescentes. Sin embargo, aunque creemos que el uso del estrés oxidativo en las células primarias para inducir la senescencia es más fisiológico, este ensayo también se puede utilizar con líneas celulares donde la senescencia se induce con agentes dañinos para el ADN como la etoposido o la irradiación.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:928px;" width="928">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">DMEM&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Corning</td>
			<td style="width:344px;">10-013-CV</td>
			<td style="width:167px;">medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ham&#39;s F10</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12390-035</td>
			<td style="width:167px;">medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">fetal bovine serum</td>
			<td>Tissue Culture Biologics</td>
			<td>101</td>
			<td style="width:167px;">serum</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1x non-essential amino acids</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-025-Cl</td>
			<td style="width:167px;">amino-acids</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">bafilomycin A1&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B1793</td>
			<td style="width:167px;">lysosomal inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">C12FDG</td>
			<td>Setareh Biotech</td>
			<td>7188</td>
			<td style="width:167px;">b-Gal substrate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hoechst 33342&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H1399</td>
			<td style="width:167px;">DNA intercalation agent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">17DMAG</td>
			<td>Selleck Chemical LLC</td>
			<td>50843</td>
			<td style="width:167px;">HSP90 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">InCell6000 Cell Imaging System</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">High Content Imaging System</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sa-&#946;-galactosidase-based screening assay for the identification of senotherapeutic drugs

La senescencia celular es una de las señas de identidad del envejecimiento que se sabe que influye negativamente en una vida saludable. Los medicamentos capaces de matar las células senescentes específicamente en el cultivo celular, llamados snolíticos, pueden reducir la carga celular senescente in vivo y extender la vida sanitaria. Hasta la fecha se han identificado múltiples clases de sílíticos, incluidos los inhibidores del HSP90, los inhibidores de la familia Bcl-2, la piperlongumina, un péptido inhibidor de FOXO4 y la combinación de Dasatinib/Quercetina. La detección de SA-a-Gal a un pH lisosomal aumentado es uno de los marcadores mejor caracterizados para la detección de células senescentes. Mediciones de células vivas de la actividad de la senescencia asociada a la galactosidasa (SA--Gal) utilizando el sustrato fluorescente C12FDG en combinación con la determinación del número celular total utilizando un tinte Hoechst intercalado de ADN abre la posibilidad de detectar medicamentos senoterapéuticos que reducen la actividad general de la SA-A-Gal matando a células senescentes (senolíticas) o suprimiendo SA--Gal y otros fenotipos de células senescentes (senomórficas). El uso de una plataforma de adquisición y análisis de imágenes fluorescentes de alto contenido permite la detección rápida y de alto rendimiento de las bibliotecas de medicamentos en busca de efectos en SA-A-Gal, morfología celular y número de célula.

La actividad de La ga-ga se puede detectar en células que son inducidas a la senescencia por diversas maneras desde el agotamiento replicativo, el estrés genotóxico y oxidativo, hasta la activación del oncogene23,25,38. En el modelo actual utilizando Células fibroblastas embrionarias de ratón Ercc1-deficientes, las condiciones de crecimiento normoxico (20% O2) fueron suf...

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SA-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

La senescencia celular es el factor clave en el desarrollo de patologías crónicas relacionadas con la edad. La identificación de las terapias que se dirigen a las células senescentes son prometedoras para extender el envejecimiento saludable. Aquí, presentamos un nuevo ensayo para la identificación de senoterapéuticos basado en la medición de la actividad de senescencia asociada a la galactosidasa en células individuales.

Ensayo de cribado basado en sA-Galactosidasa para la identificación de medicamentos senoterapéuticos

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

Aquí describimos por primera vez un método que permite la detección de fármacos de alto rendimiento para compuestos senoterapéuticos que han demostrado ser beneficiosos en enfermedades relacionadas con el envejecimiento. De hecho, varios ensayos clínicos con fármacos probados en esta esencia están actualmente en curso. La principal ventaja de esta técnica es distinguir entre dos tipos de fármacos senoterapéuticos, senolíticos y senomorfos, mediante el uso de la detección bien establecida de SA-beta-Galactosidasa en células senescentes.Esta técnica es una importante herramienta de cribado para nuevos compuestos senoterapéuticos. De hecho, varios compuestos que se han identificado con la ayuda de esta pantalla se presentan en varias publicaciones de alto perfil, y actualmente están en ensayo clínico. Esta técnica es extremadamente versátil y puede adaptarse a varias pantallas de alto rendimiento.De hecho, es posible multiplexar pantallas, y la pantalla de compuestos que suprimen la senescencia a través de la activación o inhibición de una de varias vías. Pica cada embrión en trozos de un milímetro y entubalo hacia arriba y hacia abajo varias veces. A continuación, añadir 10 mililitros de medio de crecimiento a los tejidos de cada embrión.Artiarlos en un plato de cultivo de 10 centímetros, e incubar a 37 grados centígrados en 3% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono durante dos a tres días. E incubar el resto de cada embrión con 0.25%trypsin EDTA mezcla durante 10 minutos. Para probar las células, primero, retire cuidadosamente el medio de crecimiento y lave las células con 10 mililitros de 1X PBS dos veces.Luego, agregue dos mililitros de una solución EDTA de 025 trippsina a las células, e incubarlos a 37 grados Centígrados durante dos a tres minutos. A continuación, inspeccione las células bajo un microscopio para asegurarse de que las células se separan de la superficie. Agregue la misma cantidad de medio de crecimiento para terminar la digestión de la trippsina, y transferir las células a un tubo cónico.Luego, centrifuga las células a 200 veces G durante tres minutos. Deseche el sobrenadante y agregue un medio de crecimiento fresco para volver a suspender las células. A continuación, cuente las células y se las semilla en nuevas placas en la densidad de celdas proyectada.Para la subcultivación no senescente, primero, divida las células confluentes en una proporción de uno a cuatro. Luego incuba las células a 37 grados celsius en 3%oxígeno y 5%dióxido de carbono para extenderse para otro pasaje. A continuación, para inducir la senescencia celular, las semillas dividen las células confluentes del paso uno en una proporción de uno a cuatro e incubarlas a 37 grados centígrados en 20%oxígeno y 5% de dióxido de carbono durante tres días.Para monitorear la senescencia celular, con un avanzado sistema de contador de celdas Coulter, mida el aumento gradual en el diámetro de la célula y el volumen de la célula durante cada paso de la tripsinación. Para comenzar el ensayo de cribado beta-Gal, siembra 5.000 células senescentes o 3.000 células no senescentes por pozo en 96 placas de pozo. Luego, agregue 100 microlitros de medio de crecimiento a cada pozo e incuba las células a 37 grados Celsius y 20%oxígeno y 5% dióxido de carbono durante seis horas.A continuación, agregue diluciones de fármacos a las células MEF e incubar las células a 37 grados centígrados en 20%oxígeno y 5% de dióxido de carbono durante 24 a 48 horas. Después de la incubación, retire la solución del medicamento y lave las células con 100 microlitros de 1X PBS. Para inducir la alcalinización lisosomal, pretrata las células con 90 microlitros de solución de bafilomicina A1, diluidas en un medio de cultivo celular fresco a una concentración final de 100 nanomolares.Luego, incuba las células a 37 grados centígrados en un 20% de oxígeno y un 5% de dióxido de carbono durante una hora. Para el análisis de fluorescencia de la actividad SA-beta-Gal, haga una solución de trabajo fresca de C12FDG diluida en medio de crecimiento, a una concentración final de 100 micromolares. Luego, agregue 10 microlitros de la solución de trabajo al medio de cultivo a una concentración final de 10 micromolares, e incubar las células a 37 grados centígrados en 20% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono durante dos horas.Lavar las células con 100 microlitros de 1X PBS. A continuación, añada dos microlitros de un tinte Hoechst 33342 de 100 microgramos por mililitro a una concentración final de dos microgramos por mililitro. Incubar las células a 37 grados centígrados, 20% de oxígeno y 5% dióxido de carbono durante 20 minutos.Después de la incubación, retire el medio, agregue 100 microlitros de medio de crecimiento fresco y proceda a la toma de imágenes. En este estudio, una plataforma de adquisición y análisis de imágenes fluorescentes de alto contenido permitió la identificación de fármacos senolíticos, como 17-DMAG, que redujeron las actividades generales de SA-beta-Gal en cultivos celulares de fibroblastos embrionarios murinos que contienen células senescentes en el paso cinco. Los análisis cuantitativos generados por software de mezclas de células senescentes y no senescentes permiten la demostración clara de los efectos senescentes específicos de las células, y la eliminación de la actividad beta-galactosidasa de fondo por bafilomicina A.Asegúrese de que se incluyan todos los controles celulares necesarios, especialmente las células senescentes no tratadas y las células senescentes tratadas con un control positivo.Este ensayo incluye trabajar con células primarias bajo estrés oxidativo, lo que puede conducir a variaciones que necesitan ser monitoreadas. Este procedimiento es el primer paso en la detección de fármacos senoterapéuticos. Es necesario realizar ensayos adicionales de viabilidad celular y senescentes celulares para confirmar los resultados de la proyección.Se han detectado varios fármacos senolíticos nuevos utilizando este ensayo, incluyendo la primera combinación de fármacos senolíticos dasatinib quercetina, inhibidores de la proteína de choque térmico 90, inhibidores de la familia Bcl-2 y la fisetina de polifenol.

Research

JoVE Journal

Biology

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

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Investigación

Biología

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Fluorescencia microscopia de Selección y secuenciación de próxima generación: Herramientas útiles para la identificación de genes implicados en la integridad de los Orgánulos

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