Name: sa-&#946;-galactosidase-based screening assay for the identification of senotherapeutic drugs
Uploaded: 2019-06-28T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about SA-ÃŽÂ²-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs at JoVE.com

Detta arbete stöddes av NIH Grants AG043376 (projekt 2 och Core A, PDR; Projekt 1 och Core B, LJN) och AG056278 (projekt 3 och Core A, PDR; och projekt 2, LJN) och ett bidrag från Glenn Foundation (LJN).

Djuranvändning godkändes av Scripps Florida institutionella djuromsorg och användning kommittén.
1. generering av senescent murina embryonal fibroblast (MEF) – 12-15 dagar
<ol><li>Isolera vildtyp och Ercc1-/- MEFS från dräktiga honmöss vid embryonal dag 13 (E13) som beskrivits tidigare33. Anmärkning: alla följande steg utförs i en vävnad kultur huva under aseptiska förhållanden och med hjälp av sterila instrument.</li>
	<li>Resec...

SA-β-gal är en väldefinierad biomarkör för cellulär åldras som ursprungligen upptäcktes av dimri et al. (1995) visar att senescent humana fibroblaster har ökad aktivitet av SA-β-gal när analyseras vid pH 623 jämfört med prolifererande celler. Under tiden, in vitro-och in vivo-analys för sa-β-gal har fastställts för olika celltyper och vävnader25,39,40. Fluorescensbaserade encell...

Cellular åldras beskrevs för första gången av Leonard Hayflick och Paul Moorhead, som visade att normala celler hade en begränsad förmåga att förgöra sig i kultur1. Senescent celler misslyckas med att förgöra trots närvaron av näringsämnen, tillväxtfaktorer och brist på kontakthämning, men förblir metaboliskt aktiva2. Detta fenomen kallas replikativ åldras och var främst tillskrivs telomerförkortning, åtminstone i mänskliga celler3. Ytterligare studier har visat att celler också kan induceras att genomgå åldras som svar på andra stimuli, såsom onkogen stress (Onkogene inducerad åldras, OIS), DNA-skador, cytotoxiska läkemedel, eller bestrålning (Stress inducerad åldras, SIS)4 , ,5 , 6. som svar på DNA-skador, inklusive telomererosion, celler antingen senesce, starta okontrollerad celltillväxt, eller genomgå apoptos om skadan inte kan repareras. I detta fall verkar cell åldras vara fördelaktigt eftersom det agerar i en tumör suppressiv sätt2. I motsats, åldras ökas med åldrande på grund av ansamling av cellulära skador inklusive DNA-skador. Eftersom senescent celler kan utsöndra cytokiner, metalloproteinaser och tillväxtfaktorer, kallas åldras-associerade sekretoriska fenotyp (SASP), denna åldersberoende ökning av cellulära åldras och SASP bidrar till minskad vävnad homeostas och därefter åldras. Också, denna åldersberoende ökning av åldras bördan är känd för att inducera metabola sjukdomar, stress känslighet, progeri syndrom, och nedsatt läkning7,8 och är, delvis, ansvarig för de många åldersrelaterade sjukdomar, såsom åderförkalkning, artros, muskulös degeneration, magsår bildning, och Alzheimers sjukdom9,10,11,12,13. Eliminera senescent celler kan bidra till att förebygga eller fördröja vävnad dysfunktion och förlänga healthspan14. Detta har visats i transgena musmodeller14,15,16 samt genom att använda senolytiska läkemedel och kombinationer av läkemedel som upptäcktes genom både läkemedels screening insatser och bioinformatisk analys av vägar inducerade specifikt i senescent celler17,18,19,20,21,22. Identifiera mer optimala senoterapeutiska läkemedel, kunna mer effektivt minska senescent cell börda, är ett viktigt nästa steg i utvecklingen av terapeutiska metoder för hälsosamt åldrande.
Senescent celler uppvisar karakteristiska fenotypiska och molekylära egenskaper, både i kultur och in vivo. Dessa åldras markörer kan vara antingen orsaken eller resultatet av åldras induktion eller en biprodukt av molekylära förändringar i dessa celler. Emellertid, ingen enskild markör finns specifikt i senescent celler. För närvarande, åldras-associerade β-galaktosidas (sa-β-gal) upptäckt är en av de bäst kännetecknas och etablerade encelliga metoder för att mäta åldras in vitro-och in vivo. SA-β-gal är en lysosomala hydrolas med en optimal enzymatisk aktivitet vid pH 4. Att mäta sin aktivitet vid pH 6 är möjligt eftersom senescent celler visar ökad lysosomala aktivitet23,24. För levande celler, ökad lysosomalt pH erhålls genom lysosomala alkalinisering med vakuolär H+-ATPas hämmare bafilomycin a1 eller endosomala försurnings hämmare klorokin25,26. 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside (C12FDG) används som substrat i levande celler eftersom den behåller den kluvna produkten i cellerna på grund av dess 12 kol lipofila delen25. Viktigt, SA-β-gal aktivitet i sig är inte direkt samband med någon väg som identifierats i senescent celler och är inte nödvändigt att inducera senescence. Med denna analys, senescent celler kan identifieras även i de heterogena cellpopulationer och åldrande vävnader, såsom hudbiopsier från äldre individer. Det har också använts för att visa ett samband mellan cell åldras och åldrande23 eftersom det är en pålitlig markör för senescent cell detektering i flera organismer och villkor27,28,29, 30. Här, en hög genomströmning sa-β-gal screeninganalys baserad på fluorescerande substrat C12FDG använder primära mus embryonala fibroblaster (MEFS) med robust oxidativ stress inducerad cell åldras beskrivs och dess fördelar och nackdelar diskuteras. Även om denna analys kan utföras med olika celltyper, användning av Ercc1-brist, DNA Repair nedsatt MEFS möjliggör snabbare induktion av åldras under förhållanden av oxidativ stress. Hos möss, minskat uttryck av DNA reparation Endonuklease ERCC1-XPF orsakar nedsatt DNA-reparation, accelererad ackumulering av endogena DNA-skador, förhöjda ROS, mitokondriell dysfunktion, ökad senescent cell börda, förlust av stamcells funktion och för tidigt åldrande, liknande naturligt åldrande31,32. På liknande sätt genomgår Ercc1-brist MEFS åldras snabbare i kultur17. Ett viktigt inslag i den senescent MEF analysen är att varje brunn har en blandning av senescent och icke-senescent celler, vilket möjliggör en tydlig demonstration av senescent cellspecifika effekter. Men, även om vi tror att användningen av oxidativ stress i primära celler för att inducera åldras är mer fysiologisk, denna analys kan också användas med cellinjer där åldras induceras med DNA-skadliga agenter som etoposid eller bestrålning.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:928px;" width="928">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">DMEM&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Corning</td>
			<td style="width:344px;">10-013-CV</td>
			<td style="width:167px;">medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ham&#39;s F10</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12390-035</td>
			<td style="width:167px;">medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">fetal bovine serum</td>
			<td>Tissue Culture Biologics</td>
			<td>101</td>
			<td style="width:167px;">serum</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1x non-essential amino acids</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-025-Cl</td>
			<td style="width:167px;">amino-acids</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">bafilomycin A1&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B1793</td>
			<td style="width:167px;">lysosomal inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">C12FDG</td>
			<td>Setareh Biotech</td>
			<td>7188</td>
			<td style="width:167px;">b-Gal substrate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hoechst 33342&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H1399</td>
			<td style="width:167px;">DNA intercalation agent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">17DMAG</td>
			<td>Selleck Chemical LLC</td>
			<td>50843</td>
			<td style="width:167px;">HSP90 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">InCell6000 Cell Imaging System</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">High Content Imaging System</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sa-&#946;-galactosidase-based screening assay for the identification of senotherapeutic drugs

Cell åldras är en av kännetecknen för åldrande kända för att negativt påverka en hälsosam livslängd. Droger som kan döda senescent celler specifikt i cellkultur, kallas senolytika, kan minska senescent cell börda in vivo och förlänga healthspan. Flera klasser av senolytika har identifierats hittills inklusive HSP90 hämmare, BCL-2 familj hämmare, piperlongumine, en FOXO4 hämmande peptid och kombinationen av dasatinib/quercetin. Detektion av SA-β-gal vid en ökad lysosomalt pH är en av de bäst karakteriserade markörer för detektion av senescent celler. Levande cell mätningar av senescens-associerad β-galaktosidas (sa-β-gal) aktivitet med det fluorescerande substratet C12FDG i kombination med bestämning av det totala cellnumret med hjälp av en DNA-interkalerande Hoechst Dye öppnar möjligheten att Screen för senoterapeutiska läkemedel som antingen minskar Total SA-β-gal aktivitet genom att döda senoida celler (senolytika) eller genom att undertrycka SA-β-gal och andra fenotyper av senescerande celler (senomorphics). Användning av en hög halt fluorescerande bild förvärv och analysplattform möjliggör snabb, hög genomströmning screening av läkemedelsbibliotek för effekter på SA-β-gal, cellmorfologi och cell nummer.

SA-β-gal aktivitet kan detekteras i celler som induceras till senesce av olika sätt från replikativ utmattning, genotoxisk och oxidativ stress, till Onkogene aktivering23,25,38. I den nuvarande modellen med Ercc1-bristfällig mus embryonala fibroblastceller, behandling tillväxtvillkor (20% O2) var tillräckliga för att inducera cell åldras efter odla dem för några pass...

Watch this Scientific Journal Video about SA-ÃŽÂ²-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs at JoVE.com

SA-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cellulära åldras är den viktigaste faktorn i utvecklingen av kroniska åldersrelaterade sjukdomar. Identifiering av Therapeutics som riktar sig till senescent celler visar löfte om att förlänga hälsosamt åldrande. Här presenterar vi en ny analys till Screen för identifiering av senotherapeutics baserat på mätning av åldras associerade β-galaktosidas aktivitet i enskilda celler.

SA-β-Galaktosidasbaserad screening analys för identifiering av Senoterapeutiska läkemedel

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

Vi beskriver här för första gången en metod som tillåter hög genomströmning drog screening för senotherapeutic föreningar som har visat sig vara till nytta i åldrande-relaterade sjukdomar. I själva verket, flera kliniska prövningar med läkemedel som testats i detta väsen pågår för närvarande. Den största fördelen med denna teknik är att skilja mellan två typer av senotherapeutic läkemedel, senolytics och senomorphics, genom att använda den väletablerade upptäckt av SA-beta-Galactosidase i senescent celler.Denna teknik är ett viktigt screening verktyg för nya senotherapeutic föreningar. I själva verket, flera föreningar som har identifierats med hjälp av denna skärm är med i olika uppmärksammade publikationer, och är för närvarande i klinisk prövning. Denna teknik är extremt mångsidig, och kan anpassas till flera skärmar med hög genomströmning.I själva verket, Det är möjligt att multiplex skärmar, och skärm för föreningar som undertrycker senescence via aktivering eller hämning av en av flera vägar. Finhacka varje embryo i en millimeter bitar och rör upp och ner flera gånger. Därefter lägger du till 10 milliliter tillväxtmedium till vävnaderna i varje embryo.Platta dem i en 10 centimeter kultur skålen, och inkubera vid 37 grader Celsius i 3%syre och 5%koldioxid i två till tre dagar. Och ruva resten av varje embryo med 0,25%trypsin EDTA blandning i 10 minuter. För att försökapsinisera celler, först, försiktigt bort tillväxtmediet och tvätta cellerna med 10 milliliter 1X PBS två gånger.Tillsätt sedan två milliliter av en 025 trypsin EDTA-lösning på cellerna och inkubera dem i 37 grader Celsius i två till tre minuter. Därefter inspektera cellerna under ett mikroskop för att se till att cellerna lossnat från ytan. Lägg till samma mängd tillväxtmedium för att avsluta trypsin matsmältningen, och överföra cellerna till ett koniskt rör.Sedan centrifugera cellerna vid 200 gånger G i tre minuter. Kasta supernatant, och tillsätt färsk tillväxt medium för att åter upphäva cellerna. Därefter räknar du cellerna och så dem i nya plattor vid den projicerade celltätheten.För icke-senescent subcultivation, först, dela sammanflyta celler vid ett-till-fyra förhållande. Sedan inkubera celler vid 37 grader Celsius i 3% syre och 5% koldioxid att förlänga för en annan passage. Nästa, att inducera cell senescence, frö split confluent celler från passage ett vid ett förhållande av ett till fyra och inkubera dem på 37 grader Celsius i 20%syre och 5%koldioxid miljö i tre dagar.För att övervaka cellulär senescence, med ett avancerat System för Coulter Cell Counter, mät den gradvisa ökningen av celldiameter och cellvolym under varje trypsinization-steg. För att börja beta-Gal screening assay, utsäde 5, 000 senescent celler eller 3, 000 icke-senescent celler per brunn i 96 brunn plattor. Tillsätt sedan 100 mikroliter tillväxtmedium till varje brunn och inkubera celler vid 37 grader Celsius och 20%syre och 5%koldioxid i sex timmar.Därefter lägger läkemedel utspädningar till MEF-celler och inkubera cellerna på 37 grader Celsius i 20%syre och 5%koldioxid för 24 till 48 timmar. Efter inkubation, ta bort läkemedelslösningen och tvätta celler med 100 mikroliter av 1X PBS. För att inducera lysosomal alkalinisering, pre-behandla celler med 90 mikroliter av bafilomycin A1 lösning, utspädd i färska cellodling medium vid en slutlig koncentration av 100 nanomolar.Sedan, inkubera celler vid 37 grader Celsius i 20%syre och 5% koldioxid miljö i en timme. För fluorescensanalys av SA-beta-Gal-aktivitet, gör en fräsch arbetslösning av C12FDG utspädd i tillväxtmedium, vid en slutkoncentration på 100 mikromolar. Tillsätt sedan 10 mikroliter av arbetslösningen till odlingsmediet vid en slutlig koncentration av 10 mikromolar, och inkubera celler vid 37 grader Celsius i 20%syre och 5%koldioxid i två timmar.Tvätta celler med 100 mikroliter av 1X PBS. Lägg sedan till två mikroliter av ett 100 mikrogram per milliliter Hoechst 33342-färgämne vid en slutlig koncentration av två mikrogram per milliliter. Inkubera cellerna vid 37 grader Celsius, 20%syre och 5% koldioxid i 20 minuter.Efter inkubation, ta bort media, tillsätt 100 mikroliter av färskt tillväxtmedium, och gå vidare till bildbehandling. I denna studie, en hög halt fluorescerande bild förvärv och analys plattform tillåtet för identifiering av senolytiska läkemedel, såsom 17-DMAG, som minskade den totala SA-beta-Gal verksamhet i murine embryonala fibroblast cellkulturer som innehåller senescent celler i passage fem. De programvarugenererade kvantitativa analyserna av blandningar av senescent och icke-senescent celler möjliggör tydlig demonstration av senescent cell-specifika effekter, och eliminering av bakgrund beta-galaktosidase aktivitet genom bafilomycin A.Se till att alla nödvändiga cellkontroller ingår, särskilt obehandlade senescent celler och senescent celler behandlas med en positiv kontroll.Denna uppsats omfattar att arbeta med primära celler under oxidativ stress, vilket kan leda till variation som måste övervakas. Detta förfarande är det första steget i detektion av senoterapeutiska läkemedel. Ytterligare cellen livskraft och cellen senescent uppsatser måste utföras för att bekräfta screening resultat.Flera nya senolytiska läkemedel har upptäckts med hjälp av denna uppsats, inklusive den första senolytiska läkemedelskombinationen dasatinib quercetin, värmechockprotein 90-hämmare, Bcl-2-familjen inhibitorer, och polyfenol fisetin.

Research

JoVE Journal

Biology

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

Kartläggning och analys av mus erytroida stamceller med CD71/TER119 Flow-cytometrisk analys

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Fluorescens-mikroskopi Screening och nästa generations sekvensering: Användbara verktyg för identifiering av gener involverade i Organell Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

En fluorescerande screeningsanalys för att identifiera modulatorer av GIRK kanaler

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identifiering av posttranslationella modifieringar av växtproteinkomplex

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

RNA-katalysator som en reporter för screening droger mot RNA Redigera i trypanosomer

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Hög kapacitet Screening för kemiska modulatorer av Post-transkription Reglerade Gener

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Identifiering av kinas-substrat par Använda högkapacitetsscreening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Kromatin Immunoprecipitation analys för identifiering av Arabidopsis Protein-DNA-interaktioner<em&gt; In Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Identifiering av nya regulatorer av växttranspiration genom storskalig termisk avbildningsscreening i Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

In situ Hybridisering för Sipunculus nudus Coelomic Fluid

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. ...