Name: sa-&#946;-galactosidase-based screening assay for the identification of senotherapeutic drugs
Uploaded: 2019-06-28T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about SA-ÃŽÂ²-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs at JoVE.com

Bu çalışma NıH hibe AG043376 (Proje 2 ve Core A, PDR tarafından desteklenmektedir; Proje 1 ve Core B, LJN) ve AG056278 (Proje 3 ve çekirdek A, PDR; ve proje 2, LJN) ve Glenn Vakfı (LJN) bir hibe.

Hayvan kullanımı Scripps Florida kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından onaylandı.
1. dölsel murin embriyonik fibroblast (MEF) üretimi – 12-15 gün
<ol><li>Daha önce33açıklandığı gibi embriyonik gün 13 (E13) hamile kadın fareler vahşi tip ve Ercc1-/- MEFS izole. Not: tüm aşağıdaki adımlar aseptik koşullarda ve steril aletler kullanılarak bir doku kültürü kaputu içinde gerçekleştirilir.</li>
	<li>E...

SA-β-GAL, aslında dimri ve Al tarafından keşfedilen hücresel yaşlanma için iyi tanımlanmış bir biyomarker . (1995) pH 623 ' de proliferasyon hücrelerine göre değerlendirildiğinde, senesans insan fibroblastların sa-β-GAL aktivitesinin arttığını gösteriyor. Bu arada, In vitro ve In vivo tahlil için sa-β-GAL farklı hücre tipleri ve dokular için kurulmuştur25,39,40. Bu prot...

Hücresel yaşlanma Leonard Hayflick ve Paul Moorhead, normal hücrelerin kültür1çoğalmak için sınırlı bir yeteneği olduğunu gösterdi tarafından ilk kez tanımlanmıştır. İnce hücreler besin varlığı, büyüme faktörleri ve temas inhibisyonu eksikliği rağmen çoğalırlar başarısız, ancak metabolik olarak aktif kalır2. Bu fenomen çoğaltıcı yaşlanma olarak bilinir ve ağırlıklı olarak telomer kısaltma atfedildi, en azından insan hücrelerinde3. Daha fazla çalışmalar, hücrelerin aynı zamanda diğer uyaranlara yanıt olarak, Onkojenik stres (onkojen indüklenen senesans, OIS), DNA hasarı, sitotokleş ilaçlar veya ışınlama (stres indüklenen yaşlanma, SIS)4 gibi senesans geçmesi indüklenmiş olabilir göstermiştir , 5 , 6. DNA hasarına yanıt olarak, telomer erozyonu dahil, hücreler ya senesce, kontrollü hücre büyümesini başlatmak, ya da hasar onarılamaz eğer apoptozis geçmesi. Bu durumda, hücre yaşlanma bir tümör bastırıcı şekilde davranır gibi yararlı görünüyor2. Bunun aksine, DNA hasarı da dahil olmak üzere hücresel hasar birikimi nedeniyle yaşlanma ile senesans artar. Sert hücreler sitokinleri, metalloproteinazlar ve büyüme faktörlerini salgılayan, yaşlılık ilişkili salgı fenotipi (SASP) olarak adlandırılan bu yana, hücresel senesans ve SASP bu yaş bağımlı artış azaltılmış doku homeostaz katkıda ve daha sonra yaşlanma. Ayrıca, yaşlılık yükü bu yaş bağımlı artış metabolik hastalıklar, stres hassasiyeti, Progeria sendromlar, ve7,8 iyileşme bozulmuş ve kısmen, çoğunlukla sorumlu olduğu bilinmektedir çok sayıda yaş ile ilgili hastalıklar, ateroskleroz gibi, osteoartrit, kas dejenerasyonu, ülser oluşumu, ve Alzheimer hastalığı9,10,11,12,13. Sertleşme hücrelerinin giderilmesi, doku fonksiyon bozukluğu önlemeye veya geciktirmeye ve healthspan14' e uzatmaya yardımcı olabilir. Bu transgenik fare modelleri14,15,16 yanı sıra hem ilaç tarama çabaları ve Biyoinformatik analizi ile keşfedilen senolitik ilaçlar ve ilaç kombinasyonları kullanarak gösterildi Özellikle senesans hücrelerde indüklenen yollar17,18,19,20,21,22. Daha optimal senoterapötik ilaçların belirlenmesi, daha etkili bir şekilde parlak hücre yükünü azaltabilir, sağlıklı yaşlanma için terapötik yaklaşımlar gelişiminde önemli bir sonraki adımdır.
Parlak hücreler, hem kültürde hem de in vivo karakteristik fenoipik ve moleküler özellikleri gösterir. Bu senesans belirteçleri ya neden ya da senesans indüksiyon sonucu ya da bu hücrelerde moleküler değişikliklerin bir yan ürün olabilir. Ancak, hiçbir tek Marker özellikle parlak hücrelerde bulunamadı. Şu anda, yaşlanma-ilişkili β-galaktosidaz (SA-β-GAL) algılama, en iyi karakterize ve kurulan tek hücreli temel yöntemlerle yaşlanma in vitro ve In vivo ölçmek için biridir. SA-β-GAL pH 4 ' de optimum enzimatik aktivite ile lizozomal hidrolaz 'dir. PH 6 ' da aktivitesini ölçmek mümkündür, çünkü senesans hücreler daha fazla lizozomal etkinliğini gösteriyor23,24. Yaşayan hücreler için, artmış lizozomal pH, vakolar H+-ATPaz inhibitörü bafilomisin a1 veya endozomal asitleştirme inhibitörü chlorokine ile lizozomal alkali ile elde edilir25,26. 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galaktopyranoside (C12FDG), 12 karbon lipophilik kısım25nedeniyle hücrelerde parçalanabilen ürün korur gibi yaşayan hücrelerde substrat olarak kullanılır. Daha da önemlisi, SA-β-GAL aktivitesinin kendisi, doğru bir şekilde herhangi bir yol ile doğrudan bağlı değildir ve senesans vermek için gerekli değildir. Bu tahlil ile, yaşlı bireylerin cilt biyopsileri gibi heterojen hücre nüfusu ve yaşlanma dokularında bile, düzensiz hücreler tespit edilebilir. Ayrıca, çeşitli organizmalar ve koşullarda27,28,29, parlak hücre algılama için güvenilir bir marker olarak hücre yaşlanma ve yaşlanma23 arasında bir korelasyon göstermek için kullanılmıştır 30' a kadar. Burada, yüksek verim sa-β-GAL tarama tahlil floresan substrat dayalı C12fdg birincil fare embriyonik fibroblastlar kullanarak (MEFS) sağlam oksidatif stres indüklenen hücre yaşlanma açıklanan ve avantajları ve dezavantajları ele alınmaktadır. Bu tahlil farklı hücre türleri ile yapılabilir rağmen, Ercc1-eksikliği kullanımı, DNA tamir MEFS oksidatif stres koşullarında daha hızlı senesans indüksiyon için izin verir. Farelerde, DNA onarımının azaltılmış ifadesi ERCC1-XPF bozulmuş DNA onarımı, endojen DNA hasarının hızlandırılmış birikimi, yükseltilmiş ROS, mitokondriyal disfonksiyon, artmış parlak hücre yükü, kök hücre fonksiyonunun kaybı ve erken yaşlanma, doğal yaşlanma benzer31,32. Benzer şekilde, Ercc1-eksikliği MEFS kültür17daha hızlı bir şekilde yaşlanma geçmesi. İnanılmaz MEF tahlil önemli bir özelliği, her iyi, parlak hücre spesifik etkileri net gösteri için izin, parlak ve non-parlak hücrelerin bir karışımı vardır. Ancak, biz primer hücrelerde oksidatif stres kullanımı daha fizyolojik olduğunu inanıyoruz rağmen, bu tahlil aynı zamanda yaşlanma DNA zararlı ajanlar etoposid veya ışınlama gibi indüklenen hücre hatları ile kullanılabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:928px;" width="928">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">DMEM&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Corning</td>
			<td style="width:344px;">10-013-CV</td>
			<td style="width:167px;">medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ham&#39;s F10</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12390-035</td>
			<td style="width:167px;">medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">fetal bovine serum</td>
			<td>Tissue Culture Biologics</td>
			<td>101</td>
			<td style="width:167px;">serum</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1x non-essential amino acids</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-025-Cl</td>
			<td style="width:167px;">amino-acids</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">bafilomycin A1&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B1793</td>
			<td style="width:167px;">lysosomal inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">C12FDG</td>
			<td>Setareh Biotech</td>
			<td>7188</td>
			<td style="width:167px;">b-Gal substrate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hoechst 33342&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H1399</td>
			<td style="width:167px;">DNA intercalation agent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">17DMAG</td>
			<td>Selleck Chemical LLC</td>
			<td>50843</td>
			<td style="width:167px;">HSP90 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">InCell6000 Cell Imaging System</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">High Content Imaging System</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sa-&#946;-galactosidase-based screening assay for the identification of senotherapeutic drugs

Hücre yaşlanma olumsuz sağlıklı bir ömrünü etkileyen bilinen yaşlanma damgasını biridir. Özellikle hücre kültüründe, denir senolytikler, güçlü hücreleri öldürebilir ilaçlar, in vivo ve genişletmek healthspan içinde parlak hücre yükü azaltabilir. Senolytikler birden fazla sınıf HSP90 inhibitörleri, bcl-2 aile inhibitörleri, piperlongumine, bir FOXO4 inhibitör peptid ve Dasatinib/Quercetin kombinasyonu dahil olmak üzere bugüne kadar tespit edilmiştir. Daha yüksek bir lizozomal pH 'da sa-β-GAL tespiti, parlak hücrelerin tespiti için en iyi karakterize işaretliklere biridir. Canlı hücre ölçümleri ile ilişkili β-galaktosidase (SA-β-GAL) etkinliğini kullanarak floresan substrat C12fdg ile kombinasyon halinde toplam hücre numarasının belirlenmesi ile birlikte bir DNA enterkalasyon Hoechst boya imkanı açar (senolytics) ya da SA-β-Gal ve diğer fenotipleri (senomorfik) önleyici hücreleri öldürerek ya da genel SA-β-GAL etkinliğini azaltan senoterapötik ilaçlar için ekran. Yüksek içerik floresan görüntü edinme ve analiz platformu kullanımı SA-β-GAL, hücre Morfoloji ve hücre numarası üzerinde etkileri için ilaç kütüphaneleri hızlı, yüksek verim taraması için izin verir.

SA-β-GAL aktivite çoğaltıcı tükenmesi, genotoksisik ve oksidatif stres, onkojen aktivasyonu için çeşitli şekillerde senesce indüklenen hücrelerde tespit edilebilir23,25,38. Geçerli modelde Ercc1-eksikliği fare embriyonik fibroblast hücreleri kullanarak, normoxic büyüme koşulları (20% O2) birkaç pasajlar için onları yetiştirdikten sonra hücre yaşlanma i...

Watch this Scientific Journal Video about SA-ÃŽÂ²-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs at JoVE.com

SA-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Hücresel senesans, Yaş ile ilgili kronik patolojilerin gelişiminde önemli bir faktördür. Parlak hücreleri hedefleyen terapinin tanımlanması, sağlıklı yaşlanmanın uzatılması için söz veriyor. Burada, tek hücrelerde senesans ilişkili β-galaktosidaz aktivitesinin ölçümüne dayalı senoterapötik teşhis için ekrana bir roman tahlil sunuyoruz.

Senoterapötik Ilaçların tanımlanması için SA-β-Galactosidaz tabanlı tarama tahlili

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

Burada ilk kez yaşlanmaya bağlı hastalıklarda yararlı olduğu gösterilmiştir senoterapötik bileşikler için yüksek iş itme ilaç tarama sağlayan bir yöntem açıklar. Aslında, bu özünde test edilen ilaçlar ile çeşitli klinik çalışmalar şu anda devam etmektedir. Bu tekniğin en büyük avantajı senoterapötik ilaçların iki tip ayırt etmektir, senolitik ve senomorfikler, senescent hücrelerde SA-beta-Galaktosidaz iyi tespit kullanarak.Bu teknik yeni senoterapötik bileşikler için önemli bir tarama aracıdır. Aslında, bu ekran yardımıyla tespit edilmiş çeşitli bileşikler çeşitli yüksek profilli yayınlarda yer almaktadır, ve klinik deneme şu anda bulunmaktadır. Bu teknik son derece çok yönlüdür ve birkaç yüksek işlem ekranlarına uyarlanabilir.Aslında, çok katlı ekranlar için mümkündür, ve birkaç yollarından birinin aktivasyonu veya inhibisyonu yoluyla senescence bastırmak bileşikler için ekran. Her embriyoyu bir milimetrelik parçalara ayırın ve birkaç kez yukarı ve aşağı boru. Daha sonra, her embriyodokularına 10 mililitre büyüme ortamı ekleyin.10 santimetrelik bir kültür kabına koyun ve 2-3 gün boyunca %3 oksijen ve %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yatırın. Ve her embriyonun geri kalanını %0.25 tripsin EDTA karışımı ile 10 dakika kuluçkaya yatırın. Hücreleri denemek için, ilk olarak, büyüme ortamını dikkatlice çıkarın ve hücreleri 10 mililitre 1X PBS ile iki kez yıkayın.Daha sonra hücrelere 025 tripsin EDTA çözeltisinin iki mililitresini ekleyin ve 2-3 dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Ardından, hücrelerin yüzeyden ayrıldığından emin olmak için hücreleri mikroskop altında inceleyin. Tripsin sindirimini sonlandırmak ve hücreleri konik bir tüpe aktarmak için aynı miktarda büyüme ortamı ekleyin.Sonra, hücreleri 200 kez G'de üç dakika santrifüj edin. Supernatant atın ve hücreleri yeniden askıya almak için taze büyüme ortamı ekleyin. Daha sonra, hücreleri sayın ve öngörülen hücre yoğunluğunda yeni plakalar halinde tohum.Senesiz alt ekimiçin, ilk olarak, bir-dört oranında bölünmüş konfluent hücreler. Sonra hücreleri 37 derecede %3 oksijen ve %5 karbondioksitle başka bir geçit için genişletirler. Daha sonra, hücre senescence indüklemek için, tohum bir-dört oranında bir pasajdan confluent hücreleri bölmek ve 37 santigrat derece% 20 oksijen ve% 5 karbondioksit ortamında üç gün boyunca onları kuluçka.Hücresel senescence izlemek için, gelişmiş bir Coulter Hücre Sayacı sistemi ile, her trypsinization adım sırasında hücre çapı ve hücre hacminde kademeli artış ölçmek. Beta-Gal tarama testine başlamak için, tohum 5, 000 senescent hücreleri veya 3, 000 non-senescent hücreleri iyi başına 96 iyi plakalar. Daha sonra, her kuyuya 100 mikrolitre büyüme ortamı ekleyin ve hücreleri 37 santigrat derecede, %20 oksijen ve %5 karbondioksitle altı saat boyunca kuluçkaya yatırın.Daha sonra, MEF hücrelerine ilaç seyreltmeleri ekleyin ve hücreleri %20 oksijende 37 derecede ve %5 karbondioksitle 24 ila 48 saat kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, ilaç çözeltisini çıkarın ve hücreleri 1X PBS'nin 100 mikrolitresiyle yıkayın. Lysozomal alkalinizasyon ikna etmek için, bafilomisin A1 çözeltisi 90 mikrolitre ile hücreleri tedavi, taze hücre kültürü ortamda seyreltilmiş 100 nanomolar son konsantrasyonda.Daha sonra hücreleri 37 derecede %20 oksijen ve %5 karbondioksit ortamında bir saat boyunca kuluçkaya yatırın. SA-beta-Gal aktivitesinin floresan analizi için, 100 mikromolar nihai konsantrasyonda, büyüme orta seyreltilmiş C12FDG taze bir çalışma çözümü yapmak. Daha sonra, 10 mikromolar son konsantrasyonunda kültür ortamına çalışma çözeltisi 10 mikrolitre ekleyin ve 20% oksijen ve% 5 karbondioksit% 27 santigrat derece hücreleri iki saat boyunca kuluçka hücreleri.Hücreleri 1X PBS'nin 100 mikrolitresiyle yıkayın. Daha sonra, mililitre başına iki mikrogram-mililitre Başına Hoechst 33342 boya mililitre başına iki mikrogram son konsantrasyonda ekleyin. Hücreleri 37 santigrat derecede, %20 oksijen ve %5 karbondioksitle 20 dakika kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra, ortamı çıkarın, 100 mikrolitre taze büyüme ortamı ekleyin ve görüntülemeye devam edin. Bu çalışmada, 17-DMAG gibi senolitik ilaçların tanımlanmasına izin verilen yüksek içerikli floresan görüntü edinimi ve analiz platformu, beşinci geçitte senescent hücreleri içeren murine embriyonik fibroblast hücre kültürlerinde genel SA-beta-Gal aktivitelerini azaltmıştır. Senescent ve senesiz hücrelerin karışımlarının yazılım tarafından oluşturulan kantitatif analizleri, senescent hücreye özgü etkilerin net bir şekilde gösterilmesine ve bafilomisin A.A.'nın arka plan beta-galaktosidaz aktivitesinin ortadan kaldırılmasına olanak sağlar.Bu deneme oksidatif stres altında birincil hücreler ile çalışma içerir, hangi izlenmesi gereken varyasyon yol açabilir. Bu işlem senoterapötik ilaçların saptanmasında ilk adımdır. Tarama sonuçlarını doğrulamak için ek hücre canlılığı ve hücre yılscent denemeler yapılması gerekir.İlk senolitik ilaç kombinasyonu dasatinib quercetin, ısı şok proteini 90 inhibitörleri, Bcl-2 aile inhibitörleri ve polifenol fisetin dahil olmak üzere birçok yeni senolitik ilaç bu deneme kullanılarak tespit edilmiştir.

Research

JoVE Journal

Biology

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

CD71/TER119 Flow-sitometrik Testi kullanarak Fare eritro-id progenitörlerin Tanımlama ve Analiz

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Floresans-mikroskopi Tarama ve nesil Sekanslama: organel Bütünlüğü ile ilgilendim Genlerin belirlenmesi için Faydalı Araçlar

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

GIRK Kanal Modülatörler belirlenmesi için Floresan Tarama Testi

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plant protein kompleksleri, çevirim sonrası değişikliklerin belirlenmesi

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

Tripanozomlann RNA Düzenleme karşı ilaçlar Tarama için bir Muhabiri olarak RNA Catalyst

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Yüksek Verimli Tarama kullanma Kinaz-substrat Çiftlerinin Kimlik


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Arabidopsis Protein-DNA Etkileşimleri Tespiti için Kromatin Immunoprecipitation Deneyi<em&gt; İn Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Helianthus Annuus'ta Büyük Ölçekli Termal Görüntüleme Taraması ile Bitki Transpirasyonunun Yeni Regülatörlerinin Belirlenmesi

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

Sipunculus nudus Coelomic Sıvı için yerinde Hibridizasyon

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. ...