Name: subtype-specific optical action potential recordings in human induced pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes
Uploaded: 2018-09-27T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes at JoVE.com

وأيد هذا العمل المنح المقدمة من مؤسسة البحوث الألمانية (Si 1747/1-1) وآخر كرنر-فريسينيوس-ستيفتونغ für Deutsche Stiftung هيرزفورشونج.

1. إعداد Cardiomyocytes المستمدة من اللجنة التوجيهية للتصوير
ملاحظة: أساليب المفاضلة الثقافة والقلب اللجنة التوجيهية قد نشرت قبل12،،من1314 وهي لا تناقش هنا بالتفصيل. يوصي بتنقية اللجنة التوجيهية-المهاجرة بالتحديد لاكتات، أو فصل الخ...

<ol>
	<li>Sinnecker, D., Laugwitz, K. L., Moretti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+development+and+toxicity+testing.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug development and toxicity testing.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 143 (2), 246-252 (2014).</li><li>Goedel, A., My, I., Sinnecker, D., Moretti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+and+Challenges+of+Pluripotent+Stem+Cells+in+Cardiac+Arrhythmia+Research.">Perspectives and Challenges of Pluripotent Stem Cells in Cardiac Arrhythmia Research.</a> Current Cardiology Reports. 19 (3), 23 (2017).</li><li>Rocchetti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+arrhythmogenic+mechanisms+of+long-QT+syndrome+CALM1-F142L+mutation+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Elucidating arrhythmogenic mechanisms of long-QT syndrome CALM1-F142L mutation in patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cardiovascular Research. 113 (5), 531-541 (2017).</li><li>Sinnecker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+long-QT+syndromes+with+iPS+cells.">Modeling long-QT syndromes with iPS cells.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 6 (1), 31-36 (2013).</li><li>Talkhabi, M., Aghdami, N., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiomyocyte+generation+from+pluripotent+stem+cells:+A+state-of-art.">Human cardiomyocyte generation from pluripotent stem cells: A state-of-art.</a> Life Sciences. , 98-113 (2016).</li><li>Ben-Ari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+electrophysiological+characteristics+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).</li><li>Den Hartogh, S. C., Passier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+Review:+Fluorescent+Reporters+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells:+Contributions+to+Cardiac+Differentiation+and+Their+Applications+in+Cardiac+Disease+and+Toxicity.">Concise Review: Fluorescent Reporters in Human Pluripotent Stem Cells: Contributions to Cardiac Differentiation and Their Applications in Cardiac Disease and Toxicity.</a> Stem Cells. 34 (1), 13-26 (2016).</li><li>Schweizer, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-specific+differentiation+of+cardiac+pacemaker+cell+clusters+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Subtype-specific differentiation of cardiac pacemaker cell clusters from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 229 (2017).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-specific+promoter-driven+action+potential+imaging+for+precise+disease+modelling+and+drug+testing+in+hiPSC-derived+cardiomyocytes.">Subtype-specific promoter-driven action potential imaging for precise disease modelling and drug testing in hiPSC-derived cardiomyocytes.</a> European Heart Journal. 38 (4), 292-301 (2017).</li><li>Lam, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+FRET+dynamic+range+with+bright+green+and+red+fluorescent+proteins.">Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Bhattacharya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes+and+characterization+by+flow+cytometry.">High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).</li><li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+production.">Lentivirus production.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1499 (2009).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Jung, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dantrolene+rescues+arrhythmogenic+RYR2+defect+in+a+patient-specific+stem+cell+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> EMBO Molecular Medicine. 4 (3), 180-191 (2012).</li><li>Lemoine, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+cardiomyocytes+cultured+in+3D+engineered+heart+tissue+show+physiological+upstroke+velocity+and+sodium+current+density.">Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density.</a> Scientific Reports. 7, 5464 (2017).</li><li>Dorn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+nkx2-5+transcriptional+repression+of+isl1+controls+cardiomyocyte+subtype+identity.">Direct nkx2-5 transcriptional repression of isl1 controls cardiomyocyte subtype identity.</a> Stem Cells. 33 (4), 1113-1129 (2015).</li><li>Kaestner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+Encoded+Voltage+Indicators+in+Circulation+Research.">Genetically Encoded Voltage Indicators in Circulation Research.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (9), 21626-21642 (2015).</li></ol>

تمكن الطريقة الموصوفة هنا على تسجيل بصري لوكالة الأنباء الجزائرية من نوع فرعي محدد (أي، البطين مثل الخلايا) من اتفاقية الأنواع المهاجرة التي ولدت من إيبسكس البشرية. اللجنة التوجيهية-المهاجرة البشرية أداة ناشئة للتصدي لمجموعة كبيرة من المشاكل الطبية والبيولوجية، والتمايز إلى أنواع ?...

Cardiomyocytes (CMs) المستمدة من الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent (إيبسكس) أداة ناشئة تشريح الآليات الجزيئية لأمراض القلب، للتحقيق في رواية العلاجات، وشاشة للآثار السلبية للمخدرات القلب1،2 ،3. منذ البداية، كانت الأمراض أرهيثموجينيك مثل تشانيلوباثيس أحد مجالات تركيز هامة لهذا المجال البحث4. ونتيجة لذلك، أساليب للتحقيق تعمل الكهربائية لنظام الإدارة الوظيفية، مثل عدم انتظام ضربات القلب أو التغييرات في الإجراءات المحتملة (AP) مورفولوجيس، في صميم هذه التكنولوجيا.
اعتبار هام في تطبيق اللجنة التوجيهية-المهاجرة إلا تؤدي الحالية التمايز القلب البروتوكولات في عدد سكان متجانسة من الخلايا. بدلاً من ذلك، أنهم بدلاً من خليط من الخلايا تشبه العقدة الجيب أذينية، والمهاجرة البطين على مستويات مختلفة من النضج5،6،،من78. عدم تجانس هذه يمكن أن تكون مصدر ذات صلة تجريبية تقلب، خاصة إذا كان يتم التحقيق معلمات مثل مدة AP (APD)، الذي جوهريا تختلف بين الأنواع الفرعية سم (مثلاً، APD أقصر في الرجفان مما في البطين اتفاقية الأنواع المهاجرة). النهج التقليدي لمعالجة هذه المشكلة هو التحقيق في اللجنة التوجيهية-CMs واحد باستخدام الأسلوب المشبك التصحيح وتصنيف كل خلية العقدي-، أذينية-، أو الشبيهة بالبطين، استناداً إلى مورفولوجيا أ فب9. يمكن تقييد أي تحليل اللاحقة ثم إلى الخلايا تمثل النوع الفرعي سم للفائدة. العيب الرئيسي لهذه الاستراتيجية هو الإنتاجية المحدودة وعدم قابلية التوسع. وعلاوة على ذلك، لا تسمح طبيعة الغازية التصحيح المشبك الكهربية تصوير الخلايا نفس التتابع على مدى فترات زمنية طويلة.
هنا، نحن نقدم تفاصيل التجريبية على أسلوب10 وضعت على بصريا صورة APs في أنواع فرعية محددة من اللجنة التوجيهية-المهاجرة. هذا يتغلب على مشكلة عدم تجانس النوع الفرعي ويزيد الإنتاجية مقارنة بالأساليب التقليدية، يسمح فينوتيبينج السريع للجنة التوجيهية-المهاجرة تحمل المتغيرات الجينية أو يجري وكلاء المكشوفة الدوائية بشكل كبير.
نظرة عامة على النهج التصوير الضوئية الخاصة بالنوع الفرعي
مؤشر جهد المرمزة وراثيا (جيفي)، تغيير خصائصه الأسفار عند depolarization و repolarization من غشاء الخلية، يستخدم للصور بصريا التغييرات من إمكانات غشاء الأنواع المهاجرة. جيفي المطبقة هنا هي البروتين الفلورسنت الاستشعار من الجهد فسفب-الجمهورية التشيكية11، الذي يتألف من مجال transmembrane الاستشعار عن الجهد تنصهر فيها زوج خضراء (البرسيم) وبروتين فلورسنت أحمر (mRuby2) (الشكل 1A). بسبب قرب fluorophores اثنين، نتائج إثارة البروتينات الفلورية الخضراء في جزء صغير من الطاقة الإثارة التي يجري نقلها إلى الأحمر نيون البروتين عن طريق نقل الطاقة الرنين فورستر (الحنق). ولذلك، نتائج إثارة البروتينات الفلورية الخضراء في انبعاثات من الأخضر والأحمر البروتينات الفلورية (الشكل 1A، اللوحة العلوية). عند الخلية ديبولاريزيس، يحدث إعادة ترتيب هيكلية لاستشعار الجهد الذي يترجم إلى إعادة توجيه من البروتينات الفلورية اثنين، زيادة كفاءة الحنق. وهكذا، نقل أكثر من طاقة الإثارة من الأخضر للبروتين الأحمر نيون (الشكل 1A، لوحة أقل). نتيجة لذلك في خلية ديبولاريزيد، انبعاث فلورية خضراء باهتة، وأكثر إشراقا من انبعاث ومضان أحمر في زنزانة في استراحة غشاء المحتملة (الشكل 1B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig1.jpg"> رقم 1: التصوير الضوئي من غشاء المحتملة مع فسفب-CR. (A) A تخطيطي يصور عمل البروتين الفلورسنت المراعية للجهد ويرد فسفب-الجمهورية التشيكية. عند ديبولاريزيشن لغشاء الخلية، إعادة ترتيب هيكلية في مجال الاستشعار عن بعد الجهد transmembrane يترجم إلى إعادة توجيه الأخضر (التجارة والنقل) والحمراء بروتين فلوري (RFP)، زيادة كفاءة فورستر إينتراموليكولار صدى نقل الطاقة (بكى). ويرد (ب) الانبعاثات الأطياف من فسفب على الإثارة التجارة والنقل في الخلايا في إمكانات غشاء يستريح (اللوحة العلوية) والخلايا ديبولاريزيد (أسفل اللوحة). التغيير الطيفية عند depolarization مبالغ فيها للوضوح. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
التغييرات في كفاءة الحنق النسخ المتطابق بتقلبات الغشاء المحتملة هي تصويرها استخدام مجهر الأسفار مزودة صورة الفاصل، الذي يفصل بين انبعاثات ومضان أحمر وأخضر ومشاريع منها على المناطق المجاورة اثنين من الرقاقة من كاميرا سكموس (الشكل 2). مع هذا الإعداد، انبعاث fluorescence في شريطين مختلفة الطول الموجي يمكن تسجيلها في وقت واحد، مما يسمح حساب نسبة الأسفار الأحمر إلى الأخضر تعبر الغشاء المحتملة في كل صورة من سلسلة الوقت الفاصل بين.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig2.jpg"> رقم 2: تكوين نظام التصوير- المكونات الرئيسية لنظام التصوير المستخدمة للصورة يصور التغيرات الطيفية من البروتين الفلورسنت المراعية للجهد النسخ المتطابق غشاء التغييرات المحتملة في عالية دقة زمنية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
يتحقق التعبير عن فسفب-الجمهورية التشيكية في نظام الإدارة الوظيفية عن طريق توصيل لينتيفيرال. مباشرة التعبير إلى نوع فرعي سم من الفائدة، يحتوي لينتيفيروس على عنصر مروج (محسن MLC2v ) محركات النسخ على وجه التحديد في البطين مثل اللجنة التوجيهية-CMs10. عندما يتم ترانسدوسيد اللجنة التوجيهية-المهاجرة التي تمثل مزيجاً خلايا الشبيهة بالرجفان والعقدي مثل البطين مثل مع هذا lentivirus، يتم التعبير عن فسفب-CR فقط في الخلايا الشبيهة بالبطين. منذ التصوير الضوئية إمكانات العمل يعتمد على هذا الاستشعار الفلورسنت، تمثل إمكانات العمل المسجلة حصرا سم النوع الفرعي للفائدة (الشكل 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig3.jpg"> الشكل 3: التعبير فسفب يحركها المروج للتصوير المحتملة غشاء نوع فرعي على حدة. () هذا التخطيطي يوضح كيف تتحقق التسجيلات إمكانات العمل البصرية الخاصة بالنوع الفرعي كارديوميوسيتي. (ب) اللجنة التوجيهية-المهاجرة المصابة مع فسفب تحت سيطرة البطين الخاصة MLC2v-محسن ترد. ويلاحظ التعبير عن استشعار الجهد فقط في البطين مثل نظام الإدارة الوظيفية في قناة التجارة والنقل (اللوحة اليمنى). وترد أيضا مرحلة التباين (الفريق الأوسط) وتراكب الصورة (اللوحة اليمنى). خطوط منقطة أبيض علامة حدود الخلية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#223;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21331046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS(Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16141079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax-I Supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050061</td>
			<td>alternative L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin bovine plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>Worthington Biochem</td>
			<td>LS004174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine Bromide (Polybrene)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9268</td>
			<td>enhancing lentiviral infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 cm glass-bottom microdishes</td>
			<td>MatTek corporation, Ashland, MA, USA</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stand</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DMI6000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope objective</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td colspan="2">HCX PL APO 63x/1.4-0.6 Oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor Technology, Belfast, UK</td>
			<td>Zyla V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope filter cube: excitation filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA</td>
			<td>ET480/40X</td>
			<td>bandpass 480/40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope filter cube: dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA</td>
			<td>T505lpxr</td>
			<td>longpass 505 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter</td>
			<td>&#160;Cairn Research, Faversham, UK</td>
			<td>OptoSplit II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter filter cube: dichroic mirror</td>
			<td>AHF Analysentechnik GmbH, T&#252;bigen, Germany</td>
			<td>568LPXR</td>
			<td>longpass 568 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter filter cube: emission filter 1 (GFP emission)</td>
			<td>AHF Analysentechnik GmbH, T&#252;bigen, Germany</td>
			<td>520/28 BrightLine HC</td>
			<td>bandpass 520/28 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter filter cube: emission filter 2 (RFP emission)</td>
			<td>AHF Analysentechnik GmbH, T&#252;bigen, Germany</td>
			<td>630/75 ET Bandpass</td>
			<td>bandpass 630/75 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacing inset</td>
			<td>Warner Instruments, Hamden, CT, USA</td>
			<td>RC-37FS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subtype-specific optical action potential recordings in human induced pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes

كارديوميوسيتيس المتولدة من الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent (اللجنة التوجيهية-سم) أداة ناشئة في أبحاث القلب والأوعية الدموية. بدلاً من أن يكون عدد سكان متجانسة من الخلايا، تمثل اللجنة التوجيهية-CMs إنشاؤها بواسطة بروتوكولات المفاضلة الحالية خليط خلايا مع البطين-، أذينية-، وتعمل مثل العقدي، مما يزيد من تعقيد التحليلات المظهرية. ويرد هنا، طريقة لإمكانات العمل سجل بصريا على وجه التحديد من البطين مثل اللجنة التوجيهية-المهاجرة. ويتحقق ذلك بتوصيل لينتيفيرال مع بناء الذي مؤشر جهد المرمزة وراثيا تحت سيطرة عنصر المروج البطين على حدة. عندما يتم ترانسدوسيد اللجنة التوجيهية-المهاجرة مع هذا البناء، هو استشعار الجهد أعرب حصرا في البطين مثل الخلايا، تمكين غشاء البصرية الخاصة بالنوع الفرعي تسجيلات المحتملة باستخدام مجهر الأسفار الوقت الفاصل بين.

في الشكل 4a، هو يصور واحد ممثل اللجنة التوجيهية سم مع خطوط منقطة أبيض وسم دوروا رسمها أثناء تحليل التصوير في طلب تقديم العروض (الجانب الأيسر) وقناة التجارة والنقل (الجانب الأيمن). الإشارة من القناة طلب تقديم العروض يظهر زيادة دورية في شدة الفلورسنت خلال كل ?...

Watch this Scientific Journal Video about Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes at JoVE.com

Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes

هنا نقدم طريقة بصريا إمكانات العمل في الصورة، على وجه التحديد في cardiomyocytes البطين مثل المستحثة pluripotent المستمدة من الخلايا الجذعية. الأسلوب الذي يستند إلى التعبير يحركها المروج بروتين فلوري المراعية للجهد.

تسجيلات إمكانات العمل البصرية الخاصة بالنوع الفرعي في الإنسان التي يسببها Pluripotent الخلايا الجذعية المشتقة من Cardiomyocytes البطين

Cardiomyocytes generated from human induced pluripotent stem cells (iPSC-CMs) are an emerging tool in cardiovascular research. Rather than being a ...

يتم استخدام خلايا القلب المتولدة من الخلايا الجذعية أو IPS المستحثة متعددة القدرات بشكل متزايد للإجابة على مجموعة متنوعة من الأسئلة البيولوجية في مجال الفيزيولوجيا الكهربائية القلبية. المزايا الرئيسية لهذه التكنولوجيا هي أنها تسمح بزيادة كبيرة في الإنتاجية وكذلك النوع الفرعي تسجيلات محتملة للعمل في البطين مثل myocytes ، وذلك باستخدام عنصر المروج البطينية محددة. إدخال أجهزة استشعار الجهد المشفرة وراثيا من خلال تحويل العدس الفيروسية يسمح التصوير البصري لإمكانات عمل الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات التي يسببها الإنسان.تبدأ من خلال خلط خلية تحتوي على فيروس عدس اختلطت مع القلب و القلبية متوسطة الصيانة، بنسبة واحد إلى واحد. يضاف بروميد الهيكساديثيرين بتركيز نهائي يبلغ 8 ميكروغرام لكل ملليلتر، لتعزيز كفاءة العدوى. واستبدال القلبmyocyte المتوسطة الصيانة في طبق ثقافة القلب المشتقة من الخلايا IPS، مع المتوسطة العدوى.زراعة القلب المصابة لمدة 12 ساعة في 37 درجة مئوية، واستبدال وسط العدوى مع القلب الطازجة وسط الصيانة. قبل التصوير، تبادل متوسطة ثقافة الخلية مع حل التيرود، مع مكملة مع الكالسيوم. ثم ضع عضلة القلب في غرفة التصوير على خشبة مسرح مجهر epifluorescence المقلوب المجهزة بمقسم صورة.إذا كان هناك حاجة إلى سرعة كهربائية، فقم بتركيب أقطاب سرعة في غرفة التصوير وتوصيل الأقطاب الكهربائية بمولد تحفيز. جلب الخلايا في التركيز، وتحديد موقع خلية تعبر عن مؤشر الجهد المشفرة وراثيا في وسط مجال المشاهدة. تعيين المسار البصري بحيث يتم توجيه الضوء المنبعث إلى مقسم الصورة وتبديل مكعب مرشح في المجهر إلى واحد ليتم دمجها مع المرشحات في مقسم الصورة.في البرنامج الذي يتحكم في الكاميرا، قم بتعيين إعداد الاكتساب بحيث يكون التصوير عالي السرعة ممكنًا، ثم قم بإعداد مقسم الصور وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. وينبغي أن تكون الصورتان اللتين تمثلان نطاقين مختلفين من الموجات الموجية للانبعاثات متاخمة لكل منهما، وتشغل كل منهما نصف الصورة. فحص وضبط التركيز من الصورة التي تنتجها الكاميرا حسب الضرورة.وضبط سطوع ضوء الإضاءة بحيث يتم تجنب تشبع بكسل. تعيين اقتناء سلسلة زمنية، وتميم الضوء في الغرفة لتجنب الضوء الضال التي تؤثر على القياس. ثم فتح مصراع ضوء الإثارة والبدء في الحصول على سلسلة الصور ، بدءا من سرعة الكهربائية في الوقت المناسب ، كما هو مناسب تجريبيا.عند الانتهاء من عملية الاستحواذ، أغلق مصراع ضوء الإثارة حسب الضرورة واحفظ التسجيل على القرص الصلب. ثم، ترك إعداد التسجيل دون تغيير، تسجيل الخلفية على منطقة من الغطاء بدون خلايا. لتحليل التسجيلات المحتملة للغشاء البصري ، افتح كومة tiff التي تحتوي على الخلايا في ImageJ ، واستخدم أداة الاختيار الحر لرسم منطقة ذات أهمية على عضلة القلب الفلورية ، في القناة الحمراء ، مع الحرص على أن المنطقة كبيرة بما يكفي أن الخلية لن تنتقل من المنطقة أثناء التعاقد.بعد ذلك، حدد تحليل، أدوات، إدارة منطقة الاهتمام وحدد إضافة T، لإضافة المنطقة كمنطقة ذات فائدة 1. اسحب المنطقة ذات الاهتمام على نفس الخلية في القناة الخضراء، ثم أضف هذه المنطقة كمنطقة الاهتمام 2. ضمن القوائم تحليل و تعيين القياسات، قم بإلغاء تحديد كافة الخيارات باستثناء قيمة متوسط الرمادي.في إدارة منطقة الاهتمام، انقر فوق أكثر و متعدد قياس لتحديد خيارات قياس كافة الشرائح و صف واحد لكل شريحة ثم انقر فوق موافق. سيتم فتح إطار يحتوي على جدول بيانات يحتوي على الصفوف الثلاثة. استخدم ملف وحفظ باسم لحفظ جدول البيانات في ملف قيمة مفصولة بفاصلة. إغلاق الإطار مع مكدس الصور و إطار جدول البيانات دون إغلاق الإطار إدارة منطقة الاهتمام ثم فتح مكدس tiff يحتوي على قياس الخلفية.في إدارة منطقة الاهتمام، انقر فوق "قياس أكثر ومتعددة" لتحديد خيارات قياس كافة الشرائح و صف واحد لكل شريحة ثم انقر فوق موافق. ثم احفظ بيانات الخلفية في ملف CSV منفصل. هنا، يتم تصوير القلب القلبي العضلي القلبي المشتق من الخلايا المفردة التي ينبثقها IPS مع الخطوط البيضاء المنقطة التي تشير إلى المناطق ذات الاهتمام، ويتم رسمها أثناء تحليل التصوير في قنوات تقديم العروض والقنوات GFP. توضح الإشارة من قناة RFP زيادة دورية في كثافة الفلورسنت خلال كل عمل محتمل بسبب زيادة نقل الطاقة القسري أو الرنين الناجم عن التغيرات في إمكانات الغشاء.ومن الناحية التطابقية، تظهر إشارة GFP انخفاضاً دورياً في كثافة الفلورسنت. نسبة عروض تقديم العروض إلى برنامج المنح هو الإشارة البيولوجية المستخدمة في التحليلات النهائية، مثل قياس المدة المحتملة لـ 50 و90. على سبيل المثال، باستخدام هذه الطريقة، البطين القديم 30 يوما مثل خلايا القلب المشتقة من الخلايا IPS وضعت في 0.5 هيرتز، وأظهرت متوسط مدة العمل المحتملة 50 من 439 مللي ثانية، ومتوسط مدة الإجراء المحتملة 90 من 520 مللي ثانية.التحفيز الكهربائي للقلب الخلايا المشتقة من IPS في زيادة معدلات التحفيز كل خمس ضربات ، أظهر تقصيرًا تدريجيًا لإمكانات العمل مع زيادة معدل الضرب. وعلاوة على ذلك, العلاج من الضرب التلقائي IPS الخلايا المشتقة من القلب مع isoproternol, غير انتقائية بيتا أدرينو مستقبلات ناهض, أدى إلى زيادة فورية في معدل الضرب, التي يمكن زيادة مع زيادة جرعات من ناهض. في حين أن هذه الطريقة توفر إنتاجية متفوقة مقارنة بالقياسات الفسيولوجية الكهربائية الكلاسيكية ، يجب على المرء أن يكون على بينة من حدودها ، بما في ذلك دقة زمنية محدودة من الخصائص الحركية الجوهرية لمستشعر الجهد الفلوري.

Research

JoVE Journal

Biology

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

وبنقل العدوى إلى الإنسان Nucleofecting الجذعية المحفزة المستحثة خلايا

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

كفاءة اشتقاق السلائف القلب البشري وافرة القوة العضلية من خلايا المنشأ الجنينية البشرية التعريفي مع جزيء صغير

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

اختيار وعزل المستعمرات من صنع الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة برمجتها من الخلايا الليفية الكبار

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

إعادة برمجة الخلايا الجسدية البشرية المستحثة إلى الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) استخدام ناقلات فيروسات الرجعية مع GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

العزلة وتسجيلات قناة كيلو فولت في الفئران Cardiomyocytes الأذيني البطيني و

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

جيل من العضلية الإنسان: البروتوكول التمايز من خالية من الطاعم المستحثة الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

كفاءة الجيل المستحثة الإنسان افرة القوة الخلايا الجذعية من الخلايا الجسدية البشرية مع سينداي الفيروسات

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

التمايز كفاءة عالية من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان لالعضلية وتوصيف بواسطة التدفق الخلوي

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

عزل القلب البطيني البشري من شرائح عضلة القلب المقطّع بالهزاز

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

الإنتاج الآلي من الإنسان المستحثة الخلايا الجذعية المشتقة الخلايا الجذعية الخلايا العصبية القشرية والدوبامين مع المتكاملة مراقبة الخلايا الحية

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...