Name: subtype-specific optical action potential recordings in human induced pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes
Uploaded: 2018-09-27T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes at JoVE.com

这项工作得到了德国研究基金会 (Si 1747/1-1)、其他 Kröner-费森尤斯基金会和德意志基金会的资助。

1. iPSC 心肌细胞成像的制备
注: 在12、13、14之前已经公布了 iPSC 培养和心脏分化的方法, 并没有详细讨论。采用人工显微切割、磁性细胞分离或乳酸选择的方法纯化 iPSC CMs, 这取决于所使用的鉴别协议。对于以下的协议, microdissected 外植体从殴打地区, 产生使用单层分化协议13, 被采取在15天的...

<ol>
	<li>Sinnecker, D., Laugwitz, K. L., Moretti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+development+and+toxicity+testing.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug development and toxicity testing.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 143 (2), 246-252 (2014).</li><li>Goedel, A., My, I., Sinnecker, D., Moretti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+and+Challenges+of+Pluripotent+Stem+Cells+in+Cardiac+Arrhythmia+Research.">Perspectives and Challenges of Pluripotent Stem Cells in Cardiac Arrhythmia Research.</a> Current Cardiology Reports. 19 (3), 23 (2017).</li><li>Rocchetti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+arrhythmogenic+mechanisms+of+long-QT+syndrome+CALM1-F142L+mutation+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Elucidating arrhythmogenic mechanisms of long-QT syndrome CALM1-F142L mutation in patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cardiovascular Research. 113 (5), 531-541 (2017).</li><li>Sinnecker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+long-QT+syndromes+with+iPS+cells.">Modeling long-QT syndromes with iPS cells.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 6 (1), 31-36 (2013).</li><li>Talkhabi, M., Aghdami, N., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiomyocyte+generation+from+pluripotent+stem+cells:+A+state-of-art.">Human cardiomyocyte generation from pluripotent stem cells: A state-of-art.</a> Life Sciences. , 98-113 (2016).</li><li>Ben-Ari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+electrophysiological+characteristics+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).</li><li>Den Hartogh, S. C., Passier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+Review:+Fluorescent+Reporters+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells:+Contributions+to+Cardiac+Differentiation+and+Their+Applications+in+Cardiac+Disease+and+Toxicity.">Concise Review: Fluorescent Reporters in Human Pluripotent Stem Cells: Contributions to Cardiac Differentiation and Their Applications in Cardiac Disease and Toxicity.</a> Stem Cells. 34 (1), 13-26 (2016).</li><li>Schweizer, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-specific+differentiation+of+cardiac+pacemaker+cell+clusters+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Subtype-specific differentiation of cardiac pacemaker cell clusters from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 229 (2017).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-specific+promoter-driven+action+potential+imaging+for+precise+disease+modelling+and+drug+testing+in+hiPSC-derived+cardiomyocytes.">Subtype-specific promoter-driven action potential imaging for precise disease modelling and drug testing in hiPSC-derived cardiomyocytes.</a> European Heart Journal. 38 (4), 292-301 (2017).</li><li>Lam, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+FRET+dynamic+range+with+bright+green+and+red+fluorescent+proteins.">Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Bhattacharya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes+and+characterization+by+flow+cytometry.">High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).</li><li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+production.">Lentivirus production.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1499 (2009).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Jung, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dantrolene+rescues+arrhythmogenic+RYR2+defect+in+a+patient-specific+stem+cell+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> EMBO Molecular Medicine. 4 (3), 180-191 (2012).</li><li>Lemoine, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+cardiomyocytes+cultured+in+3D+engineered+heart+tissue+show+physiological+upstroke+velocity+and+sodium+current+density.">Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density.</a> Scientific Reports. 7, 5464 (2017).</li><li>Dorn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+nkx2-5+transcriptional+repression+of+isl1+controls+cardiomyocyte+subtype+identity.">Direct nkx2-5 transcriptional repression of isl1 controls cardiomyocyte subtype identity.</a> Stem Cells. 33 (4), 1113-1129 (2015).</li><li>Kaestner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+Encoded+Voltage+Indicators+in+Circulation+Research.">Genetically Encoded Voltage Indicators in Circulation Research.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (9), 21626-21642 (2015).</li></ol>

此处描述的方法允许从人类 iPSCs 生成 CMs 的特定子类型 (即心室样细胞) 中的 ap 进行光学记录。人类 iPSC-CMs 是一个新兴的工具, 以解决巨大的各种生物和医学问题, 和分化不同的 CM 亚型是一个重要的来源的实验变异性。通过使用特定的启动子元素, GEVI 的表达式在 CMs 中具体实现, 表示感兴趣的子类型, 然后进行光学成像。
从单 iPSC CMs 中成功获取 ap 取决于分离后的补种密...

由诱导多能干细胞 (iPSCs) 衍生的心肌细胞 (CMs) 是一种新的工具, 用于解剖心脏疾病的分子机制, 研究新的治疗方法, 并筛查1、2 的不良心脏药物效应。,3。从一开始, 致心律失常疾病如 channelopathies 已经成为这个研究领域的一个重要的焦点4。因此, 研究 CMs 电子表型的方法, 如心律失常或动作电位 (AP) 形态的变化, 是该技术的核心。
在应用 iPSC CMs 的一个重要的考虑是, 目前的心脏分化协议并没有导致细胞的同源种群。相反, 它们是在不同的成熟度5,6,7,8, 类似窦房结, 心房和心室 CMs 的细胞的混合物。这种异质性可能是实验变异性的相关来源, 特别是如果研究了 AP 持续时间 (apd) 的参数, 这在 CM 亚型 (例如, 在心房的 APD 比心室 CMs 短)。解决这一问题的常规方法是使用膜片钳方法调查单个 iPSC CMs, 并根据 AP 形态学9将每个细胞分类为节、心房或心室状。随后的任何分析都可以限制为表示感兴趣的 CM 子类型的单元格。该策略的主要缺点是其吞吐量有限, 且缺乏可伸缩性。而且, 膜片钳电生理学的侵入性不允许在延长的时间段内按顺序对同一细胞进行成像。
在这里, 我们提供的实验细节的方法10发展到光学图像 ap 的特定亚型 iPSC CMs。这克服了亚型异质性的问题, 大大增加了与传统方法相比的吞吐量, 允许快速分型 iPSC CMs 携带遗传变种或接触到药理制剂。
亚型特定光学成像方法综述
一种基因编码的电压指示器 (GEVI), 其荧光特性在细胞膜的退极化和复极化上发生变化, 用于 CMs 膜电位的光学图像变化。GEVI 在这里应用的是电压传感荧光蛋白 VSFP-CR11, 它包括一个电压传感跨膜领域融合到一对绿色 (三叶草) 和红色 (mRuby2) 荧光蛋白 (图 1A)。由于两个显影的接近, 绿色荧光蛋白的激发会导致激发能量的一小部分通过Förster 共振能量转移 (烦恼) 转移到红色荧光蛋白中。因此, 绿色荧光蛋白的激发导致了绿色和红色荧光蛋白的排放 (图 1A, 上部板)。当细胞 depolarizes 时, 电压传感器的结构重排发生转化为两种荧光蛋白的重新定位, 提高了烦恼的效率。因此, 更多的励磁能量从绿色转移到红色荧光蛋白 (图 1A, 下板)。因此, 在偏振光细胞中, 绿色荧光发射是变暗, 红色荧光发射比在静止膜电位下的细胞更亮 (图 1B)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig1.jpg"> 图 1: VSFP 膜电位的光学成像.(a) 显示了一种描述电压敏感荧光蛋白 VSFP 的作用的示意图。在细胞膜的退极化后, 电压传感跨膜领域的结构重排转化为绿色 (GFP) 和红色 (RFP) 荧光蛋白的重新定位, 提高分子内 Förster 的效率。共振能量传递 (烦恼)。(B) 描述了 VSFP 在静止膜电位 (上板) 和偏振光细胞 (下板) 的细胞中激发 GFP 的发射光谱。在退极化时的光谱变化被夸大为清晰。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig1large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
在焦虑效率的变化, 镜像的波动, 膜电位的影像是使用一个荧光显微镜配备了图像分配器, 分离红色和绿色的荧光排放, 并将其投射到两个相邻的区域sCMOS 相机的芯片 (图 2)。利用这一设置, 可以同时记录两个不同波长波段的荧光发射量, 从而能够计算出一个时间序列的每一个图像中的红-绿荧光比值来反映膜电位。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig2.jpg"> 图 2: 成像系统的配置.描述了成像系统的主要组成部分, 用于图像的电压敏感荧光蛋白的光谱变化镜像的薄膜电位变化的高时间分辨率。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig2large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
慢病毒载体转导实现了 VSFP 在 CMs 中的表达。为了直接表达对 CM 亚型的兴趣, 慢病毒北疆包含一个启动器元素 ( MLC2v增强), 特别推动转录在心室样 iPSC-CMs10。当 iPSC-CMs, 代表心房样, 节样, 和心室样细胞的混合转基因与此慢病毒北疆, VSFP CR 只表达在心室样细胞。由于光学动作电位成像依赖于这种荧光传感器, 记录的动作电位完全代表了 CM 亚型的兴趣 (图 3)。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig3.jpg"> 图 3: 用于子类型特定的膜电位成像的启动子驱动的 VSFP 表达式.(a) 这个示意图显示了心肌细胞亚型特定的光学动作电位记录是如何实现的。(b) VSFP 在心室特异 MLC2v-enhancer 控制下感染 iPSC 的 CMs。电压传感器的表达仅观察到 GFP 通道中的心室样 CMs (左面板)。还提供了相位对比度 (中间板) 和叠加图像 (右面板)。白色虚线标记单元格边界。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig3large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#223;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21331046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS(Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16141079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax-I Supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050061</td>
			<td>alternative L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin bovine plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>Worthington Biochem</td>
			<td>LS004174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine Bromide (Polybrene)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9268</td>
			<td>enhancing lentiviral infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 cm glass-bottom microdishes</td>
			<td>MatTek corporation, Ashland, MA, USA</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stand</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DMI6000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope objective</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td colspan="2">HCX PL APO 63x/1.4-0.6 Oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor Technology, Belfast, UK</td>
			<td>Zyla V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope filter cube: excitation filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA</td>
			<td>ET480/40X</td>
			<td>bandpass 480/40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope filter cube: dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA</td>
			<td>T505lpxr</td>
			<td>longpass 505 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter</td>
			<td>&#160;Cairn Research, Faversham, UK</td>
			<td>OptoSplit II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter filter cube: dichroic mirror</td>
			<td>AHF Analysentechnik GmbH, T&#252;bigen, Germany</td>
			<td>568LPXR</td>
			<td>longpass 568 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter filter cube: emission filter 1 (GFP emission)</td>
			<td>AHF Analysentechnik GmbH, T&#252;bigen, Germany</td>
			<td>520/28 BrightLine HC</td>
			<td>bandpass 520/28 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter filter cube: emission filter 2 (RFP emission)</td>
			<td>AHF Analysentechnik GmbH, T&#252;bigen, Germany</td>
			<td>630/75 ET Bandpass</td>
			<td>bandpass 630/75 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacing inset</td>
			<td>Warner Instruments, Hamden, CT, USA</td>
			<td>RC-37FS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subtype-specific optical action potential recordings in human induced pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes

由人类诱导的多潜能干细胞 (iPSC CMs) 产生的心肌细胞是心血管研究的新兴工具。目前的分化协议所产生的 iPSC-CMs, 与其说是同质的细胞群, 不如说是细胞与心室、心房和结节样表型的混合体, 这就复杂了对表型的分析。本文提出了一种从心室样 iPSC-CMs 的光学记录动作电位的方法。这是通过慢病毒载体转导与一个结构, 其中一个基因编码的电压指示器是在一个心室特定的启动子元素的控制。当 iPSC CMs 与此构造转基因时, 电压传感器只表达在心室样细胞中, 使用时间失效荧光显微镜使亚型特定的光学膜电位记录得以实现。

在图 4a中, 用白色虚线标明了在 RFP (左侧) 和 GFP (右侧) 通道中的图像分析过程中绘制的 ROI, 并描述了一个代表的单 iPSC CM。从 RFP 通道发出的信号显示每次动作电位期间荧光强度的周期性增加 (图 4b, 上部板)。如导言所述, 这是由于膜电位的变化引起的焦虑加剧 (图 1)。和谐, GFP 信号显示荧光强度周期性下降...

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Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes

在这里, 我们提出了一种光学图像动作电位的方法, 特别是在心室样诱导多潜能干细胞衍生心肌细胞。该方法基于对电压敏感的荧光蛋白的启动子驱动表达式。

人诱导的多潜能干细胞源性心室心肌细胞亚型特异光学动作电位记录

Cardiomyocytes generated from human induced pluripotent stem cells (iPSC-CMs) are an emerging tool in cardiovascular research. Rather than being a ...

由诱导多能干细胞或IPS细胞产生的心肌细胞越来越多地用于回答心脏电生理学领域的各种生物学问题。该技术的主要优点是，它允许在心室（如卵细胞）中，使用心室特异性启动子元素，实现吞吐量的大幅提高以及亚型特定动作电位记录。通过扁病毒转导引入基因编码电压传感器，可以光学成像人类诱导多能干细胞衍生的心肌细胞作用潜力。首先将含有扁病毒的细胞培养物与心肌细胞维持介质混合，比例为一比一。以每毫升8微克的最终浓度加入六溴酰胺，以提高感染效率。用感染培养基代替IPS细胞衍生心肌细胞培养皿中的心肌细胞维持培养基。培养受感染的心肌细胞在37摄氏度下12小时，用新鲜的心肌细胞维持介质取代感染介质。在成像之前，用Tyrode的溶液交换细胞培养基，并辅以钙。然后将心肌细胞放在带图像分离器的倒置荧光显微镜的舞台上的成像室中。如果需要电起搏，请将起搏电极安装在成像室中，然后将电极连接到刺激发生器。将细胞聚焦，并在观察场中心找到表示基因编码电压指示器的单元。设置光路，以便发射光路由到图像分路器，并在显微镜中将滤光立方体切换到要与图像分路器中的滤光片组合的滤光片立方体。在控制摄像机的软件中，设置采集设置，以便实现高速成像，并根据制造商的说明设置图像拆分器。表示两个不同发射波长波段的两个图像应相邻，每个图像占据图像的一半。根据需要检查和调整摄像机制作的图像的焦点。并调整照明灯的亮度，以避免像素饱和。设置时间序列的采集，使室内光线变暗，以避免杂散光影响测量。然后打开激发光快门，开始采集图像系列，在适当的时间点开始电起搏，在实验上适当。采集完成后，请视需要关闭激励灯快门，然后将录制保存到硬盘驱动器。然后，在保持录制设置不变的情况下，在没有单元格的盖玻片区域上记录背景。要分析光膜电位记录，请打开包含 ImageJ 中细胞的 tiff 堆栈，并使用自由选择工具在红色通道中荧光心肌细胞上绘制感兴趣的区域，注意该区域足够大，细胞在收缩时不会移出该区域。接下来，选择"分析"、"工具、兴趣区域管理器"，然后选择"添加 T"，将该区域添加为"感兴趣区域"1。将感兴趣区域拖动到绿色通道中的同一单元格上，然后将此区域添加为"感兴趣区域"2。在"分析和设置测量"菜单下，取消选择除"均值灰色"值以外的所有选项。在"感兴趣区域管理器"中，单击"更多"和"多度量"以选择"测量所有切片和每个切片一行"选项，然后单击"确定"。将打开一个窗口，其中包含包含三行的电子表格。使用"文件"和"保存"将电子表格保存到逗号分隔的值文件中。使用图像堆栈和电子表格窗口关闭窗口，而不关闭"兴趣区域管理器"窗口，然后打开包含背景测量的 tiff 堆栈。在"感兴趣区域管理器"中，单击"更多和多度量值"以选择"测量所有切片和每个切片一行"选项，然后单击"确定"。然后将背景数据保存在单独的 csv 文件中。在这里，在RFP和GFP通道的成像分析过程中绘制的具有代表性的单IPS细胞衍生心肌细胞与标记感兴趣区域的白色虚线进行描绘。来自 RFP 通道的信号显示，由于膜电位变化导致的强迫或共振能量转移增加，每次动作电位期间荧光强度会周期性增加。一致性地，GFP 信号显示荧光强度的周期性下降。RFP/GFP 比率是下游分析中使用的生物信号，例如作用电位持续时间 50 和 90 测量。例如，使用此方法，30 天大心室（如 IPS 细胞衍生心肌细胞）放置在 0.5 赫兹，显示平均行动电位持续时间 50 的 439 毫秒，以及平均行动潜在持续时间 90 的 520 毫秒。IPS细胞衍生心肌细胞的电刺激每五次提高刺激速率，表明随着跳动率的增加，动作潜力逐渐缩短。此外，使用异丙醇（一种非选择性β肾上腺素受体激动剂）自发跳动IPS细胞衍生的心肌细胞的治疗，导致跳动率的迅速提高，随着激动剂剂量的增加，这种反应可能会进一步增加。虽然与传统的电生理测量相比，此方法可提供卓越的吞吐量，但必须了解其局限性，包括受荧光电压传感器内在动力学特性限制的时间分辨率。

Research

JoVE Journal

Biology

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

人类诱导多能干细胞的转染和Nucleofecting

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

科研

生物学

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

高效的推导人类心脏的前体和从多能干的小分子诱导人类胚胎干细胞的心肌细胞

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

选择和隔离殖民地的人类诱导多能干细胞重新编程成年成纤维细胞

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

人类体细胞重编程为诱导多能干细胞（iPS细胞）用绿色荧光蛋白逆转录病毒载体

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

在小鼠的心房和心室肌细胞的分离及钾离子通道的录音

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

人类心肌细胞的生成：从馈线人类诱导多能干细胞的分化协议

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

从人类体细胞与仙台病毒高效的新一代人类诱导多能干细胞

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

人类多能干细胞的高效分化为心肌细胞，并鉴定流式细胞仪

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

人体心室心肌细胞与颤音-切切心肌切片分离

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

通过集成活细胞监测，自动生产人类诱导多能干细胞衍生皮质神经元和多巴胺神经元

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...