Name: subtype-specific optical action potential recordings in human induced pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes
Uploaded: 2018-09-27T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den tyske Research Foundation (Si 1747/1-1), andet Kröner-Fresenius-Stiftung og Deutsche Stiftung für Herzforschung.

1. forberedelse af iPSC-afledte Cardiomyocytes til billedbehandling
Bemærk: Metoder til iPSC kultur og hjerte differentiering har været offentliggjort før12,13,14 og behandles ikke her i detaljer. Rensning af iPSC-CMs af manuel microdissection, magnetiske celleseparering eller laktat udvalg anbefales afhængigt af differentiering protokollen anvendes. For følgende protokol, blev microdissected expla...

<ol>
	<li>Sinnecker, D., Laugwitz, K. L., Moretti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+development+and+toxicity+testing.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug development and toxicity testing.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 143 (2), 246-252 (2014).</li><li>Goedel, A., My, I., Sinnecker, D., Moretti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+and+Challenges+of+Pluripotent+Stem+Cells+in+Cardiac+Arrhythmia+Research.">Perspectives and Challenges of Pluripotent Stem Cells in Cardiac Arrhythmia Research.</a> Current Cardiology Reports. 19 (3), 23 (2017).</li><li>Rocchetti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+arrhythmogenic+mechanisms+of+long-QT+syndrome+CALM1-F142L+mutation+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Elucidating arrhythmogenic mechanisms of long-QT syndrome CALM1-F142L mutation in patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cardiovascular Research. 113 (5), 531-541 (2017).</li><li>Sinnecker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+long-QT+syndromes+with+iPS+cells.">Modeling long-QT syndromes with iPS cells.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 6 (1), 31-36 (2013).</li><li>Talkhabi, M., Aghdami, N., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiomyocyte+generation+from+pluripotent+stem+cells:+A+state-of-art.">Human cardiomyocyte generation from pluripotent stem cells: A state-of-art.</a> Life Sciences. , 98-113 (2016).</li><li>Ben-Ari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+electrophysiological+characteristics+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).</li><li>Den Hartogh, S. C., Passier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+Review:+Fluorescent+Reporters+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells:+Contributions+to+Cardiac+Differentiation+and+Their+Applications+in+Cardiac+Disease+and+Toxicity.">Concise Review: Fluorescent Reporters in Human Pluripotent Stem Cells: Contributions to Cardiac Differentiation and Their Applications in Cardiac Disease and Toxicity.</a> Stem Cells. 34 (1), 13-26 (2016).</li><li>Schweizer, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-specific+differentiation+of+cardiac+pacemaker+cell+clusters+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Subtype-specific differentiation of cardiac pacemaker cell clusters from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 229 (2017).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-specific+promoter-driven+action+potential+imaging+for+precise+disease+modelling+and+drug+testing+in+hiPSC-derived+cardiomyocytes.">Subtype-specific promoter-driven action potential imaging for precise disease modelling and drug testing in hiPSC-derived cardiomyocytes.</a> European Heart Journal. 38 (4), 292-301 (2017).</li><li>Lam, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+FRET+dynamic+range+with+bright+green+and+red+fluorescent+proteins.">Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Bhattacharya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes+and+characterization+by+flow+cytometry.">High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).</li><li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+production.">Lentivirus production.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1499 (2009).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Jung, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dantrolene+rescues+arrhythmogenic+RYR2+defect+in+a+patient-specific+stem+cell+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> EMBO Molecular Medicine. 4 (3), 180-191 (2012).</li><li>Lemoine, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+cardiomyocytes+cultured+in+3D+engineered+heart+tissue+show+physiological+upstroke+velocity+and+sodium+current+density.">Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density.</a> Scientific Reports. 7, 5464 (2017).</li><li>Dorn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+nkx2-5+transcriptional+repression+of+isl1+controls+cardiomyocyte+subtype+identity.">Direct nkx2-5 transcriptional repression of isl1 controls cardiomyocyte subtype identity.</a> Stem Cells. 33 (4), 1113-1129 (2015).</li><li>Kaestner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+Encoded+Voltage+Indicators+in+Circulation+Research.">Genetically Encoded Voltage Indicators in Circulation Research.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (9), 21626-21642 (2015).</li></ol>

Metoden beskrevet her giver en optisk registrering af APs fra en bestemt undertype (dvs., ventrikel-lignende celler) af CMs genereret fra menneskelige iPSCs. Menneskelige iPSC-CMs er en spirende værktøj til at løse en lang række biologiske og medicinske problemer, og differentiering til forskellige CM undertyper er en vigtig kilde til eksperimentel variation. Ved hjælp af specifikke promotor elementer, er udtryk for en GEVI specifikt opnået i CMs repræsenterer undertype af interesse, som er derefter optis...

Cardiomyocytes (CMs) afledt af induceret pluripotente stamceller (iPSCs) er et kommende værktøj til at dissekere molekylære mekanismer for hjertesygdomme, at undersøge nye behandlingsformer, og at skærmen for negative hjerte narkotika effekter1,2 ,3. Lige fra starten, har arrhythmogenic sygdomme som channelopathies været et vigtigt fokus for denne forskning område4. Metoder til at undersøge elektriske fænotyper af CMs, såsom arytmier eller ændringer i aktionspotentialet (AP) morfologier, er derfor, i hjertet af denne teknologi.
En vigtig overvejelse i anvendelsen af iPSC-CMs er, at nuværende hjerte differentiering protokoller ikke resulterer i en homogen population af celler. I stedet, de er snarere en blanding af celler der ligner sinusknuden, atrieflimren, og ventrikulær CMs på forskellige niveauer af modning5,6,7,8. Denne forskelligartethed kan være en relevant kilde eksperimentel variation, især hvis parametre som AP varighed (APD) er undersøgt, som uløseligt er forskellige mellem CM undertyper (f.eks.APD er kortere i atrieflimren end i ventrikulær CMs). Den konventionelle tilgang til at løse dette problem er at undersøge enkelt iPSC-CMs ved hjælp af metoden patch klemme og klassificere hver celle som nodal-, atrieflimren-, eller ventrikulær-lignende, baseret på dens AP morfologi9. Enhver efterfølgende analyse kan begrænses derefter til de celler, der repræsenterer CM undertype af interesse. Den store ulempe ved denne strategi er dens begrænsede produktion og mangel på skalerbarhed. Derudover tillader patch klemme Elektrofysiologi invasiv art ikke billeddannelse af de samme celler sekventielt over længere perioder.
Her give vi eksperimentelle detaljer på en metode10 udviklet optisk billede APs i specifikke undertyper af iPSC-CMs. Dette overvinder problemet med subtype heterogenitet og øger dramatisk throughput sammenlignet med konventionelle metoder, så den hurtige fænotyper af iPSC-CMs bærer genetiske varianter eller bliver udsat for farmakologiske stoffer.
Oversigt over den undertype-specifikke optiske billeddannelse tilgang
En genetisk kodet spænding indikator (GEVI), hvis fluorescens egenskaber ændre på depolarisering og repolarisering af cellemembranen, bruges til optisk billede ændres af membran potentiale af CMs. GEVI anvendes her er den spænding-sensing fluorescerende protein VSFP-CR11, som består af en spænding-sensing transmembrane domæne smeltede sammen til et par en grøn (kløver) og en rød (mRuby2) fluorescerende proteiner (figur 1A). På grund af nærhed af de to fluorophores, excitation af den grønne fluorescerende proteiner resultater på en brøkdel af excitation energi overføres til den røde fluorescerende proteiner via Förster resonans energioverførsel (FRET). Derfor resulterer excitation af den grønne fluorescerende proteiner i en emission fra både grønne og de røde fluorescerende proteiner (figur 1A, øverste panel). Når cellen depolarizes, opstår en strukturel omlægning af spændingsmåler der giver sig udslag i en omlægning af de to fluorescerende proteiner, øge FRET effektivitet. Således overføres endnu mere for magnetisering energi fra grønne til de røde fluorescerende proteiner (figur 1A, nederste panel). Som et resultat, i en depolarized celle, grønne fluorescens emission er svagere, og den røde fluorescens emission er lysere end i en celle på hvile membran potentiale (figur 1B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig1.jpg"> Figur 1: optiske billeddannelse af membran potentiale med VSFP-kr.NOTANR (A) A skematisk skildrer handlingen af spænding-følsomme fluorescerende proteiner VSFP-CR er vist. Ved depolarisering af cellemembranen, en strukturel omlægning i den spænding-sensing transmembrane domæne giver sig udslag i en omlægning af green (normal god landbrugspraksis) og rød (RFP) fluorescerende proteiner, øge effektiviteten af den intramolekylære Förster resonans energioverførsel (FRET). (B) emission spektre af en VSFP ved excitation af normal god landbrugspraksis i celler på den hvilende membran potentiale (øverste panel) og i depolariseret celler (nederste panel) er afbildet. Den spektrale ændring ved depolarisering er overdrevet for klarhed. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Ændringer i FRET effektivitet spejling udsving af membranen potentiale er afbildet ved hjælp af et fluorescens mikroskop udstyret med en image splitter, som adskiller røde og grønne fluorescens emission og projekter dem på to tilstødende områder af chip af en sCMOS kamera (figur 2). Med dette set-up, kan fluorescens emission på to forskellige bølgelængde bands registreres samtidigt, hvilket giver mulighed for beregning af forholdet mellem rød til grøn fluorescens afspejler membran potentiale i hvert billede af en time-lapse serie.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig2.jpg"> Figur 2: konfiguration af imaging systemet. De vigtigste komponenter i den billedbehandlingssystem bruges til billede de spektrale ændringer af spænding-følsomme fluorescerende proteiner spejling membran potentielle ændringer på en høj tidsmæssige opløsning er afbildet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Udtryk for VSFP-CR i CMs er opnået ved lentiviral transduktion. Direkte udtryk til CM undertype af interesse, indeholder en lentivirus en promotor element ( MLC2v forstærker), der specifikt drev transskription i ventrikel-lignende iPSC-CMs10. Når iPSC-CMs, der repræsenterer en blanding af atrieflimren-lignende, nodal-lignende og ventrikel-lignende celler er transduced med denne lentivirus, er VSFP-CR kun udtrykt i ventrikel-lignende celler. Da den optiske aktionspotentialet imaging afhænger denne fluorescerende sensor, repræsenterer de optagede handling potentialer udelukkende CM undertype af interesse (figur 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig3.jpg"> Figur 3: promotor-drevet VSFP udtryk for undertype-specifikke membran potentielle imaging. (en) denne skematiske viser hvordan cardiomyocyte undertype-specifikke optisk aktionspotentialet optagelser er opnået. (b) iPSC-CMs inficeret med en VSFP under kontrol af den ventrikulære-specifikke MLC2v-forstærker er vist. Udtryk for en spændingsmåler ses kun i ventrikel-lignende CMs i normal god landbrugspraksis kanal (venstre panel). Der tilbydes også fasekontrast (midterste panel) og overlejringsbillede (højre panel). De hvide stiplede linjer markere celle grænser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#223;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21331046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS(Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16141079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax-I Supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050061</td>
			<td>alternative L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin bovine plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>Worthington Biochem</td>
			<td>LS004174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine Bromide (Polybrene)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9268</td>
			<td>enhancing lentiviral infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 cm glass-bottom microdishes</td>
			<td>MatTek corporation, Ashland, MA, USA</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stand</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DMI6000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope objective</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td colspan="2">HCX PL APO 63x/1.4-0.6 Oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor Technology, Belfast, UK</td>
			<td>Zyla V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope filter cube: excitation filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA</td>
			<td>ET480/40X</td>
			<td>bandpass 480/40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope filter cube: dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA</td>
			<td>T505lpxr</td>
			<td>longpass 505 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter</td>
			<td>&#160;Cairn Research, Faversham, UK</td>
			<td>OptoSplit II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter filter cube: dichroic mirror</td>
			<td>AHF Analysentechnik GmbH, T&#252;bigen, Germany</td>
			<td>568LPXR</td>
			<td>longpass 568 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter filter cube: emission filter 1 (GFP emission)</td>
			<td>AHF Analysentechnik GmbH, T&#252;bigen, Germany</td>
			<td>520/28 BrightLine HC</td>
			<td>bandpass 520/28 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter filter cube: emission filter 2 (RFP emission)</td>
			<td>AHF Analysentechnik GmbH, T&#252;bigen, Germany</td>
			<td>630/75 ET Bandpass</td>
			<td>bandpass 630/75 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacing inset</td>
			<td>Warner Instruments, Hamden, CT, USA</td>
			<td>RC-37FS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subtype-specific optical action potential recordings in human induced pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes

Cardiomyocytes genereres fra menneskelige inducerede pluripotente stamceller (iPSC-CMs) er en spirende værktøj i hjerte-kar-forskning. Snarere end at være en homogen population af celler, iPSC-CMs skabt af nuværende differentiering protokoller repræsenterer en blanding af celler med ventrikel-, atrieflimren-, og nodal-lignende fænotyper, som komplicerer fænotypiske analyser. Her, er en metode til optisk optage handling potentialer specifikt fra ventrikulær-lignende iPSC-CMs præsenteret. Dette opnås ved lentiviral transduktion med en konstruktion, hvor en genetisk kodet spænding indikator er under kontrol af en ventrikulær-specifikke promotor element. Når iPSC-CMs er transduced med denne konstruktion, udtrykkes spændingsmåler udelukkende i ventrikel-lignende celler, aktivering undertype-specifikke optisk membran potentielle optagelser ved hjælp af time-lapse Fluorescens mikroskopi.

I figur 4a, er en repræsentativ enkelt iPSC-CM afbildet med hvide punkterede linjer mærkning ROI trukket under imaging analysen i RFP (venstre) og normal god landbrugspraksis (højre side)-kanal. Signalet fra RFP kanal viser en periodisk stigning i fluorescerende intensitet under hver aktionspotentialet (figur 4b, øverste panel). Som beskrevet i indledningen, er det på grund af en stigende FRET forårsaget af ændringer i den...

Watch this Scientific Journal Video about Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes at JoVE.com

Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes

Her præsenterer vi en metode til optisk billede handling potentialer, specielt i ventrikel-lignende inducerede pluripotente stamceller-afledt cardiomyocytes. Metoden er baseret på udtrykket promotor-drevet af en spænding-følsomme fluorescerende proteiner.

Undertype-specifikke optisk aktionspotentialet optagelser i menneskelige induceret pluripotente stamceller-afledt ventrikulær Cardiomyocytes

Cardiomyocytes generated from human induced pluripotent stem cells (iPSC-CMs) are an emerging tool in cardiovascular research. Rather than being a ...

Kardiomyocytter genereret fra inducerede Pluripotente Stem eller IPS celler bruges i stigende grad til at besvare en række biologiske spørgsmål inden for hjerteelektrofysiologi. De vigtigste fordele ved denne teknologi er, at det giver mulighed for en dramatisk stigning i gennemløb samt subtype specifikke handling potentielle optagelser i ventrikel som myocytter, ved hjælp af en ventrikel specifik promotor element. Indførelsen af genetisk kodede spændingssensorer gennem lentiviral transduktion gør det muligt at optiske billeddannelser af human-induceret pluripotente stamceller-afledte kardiomyocytter handling potentialer.Begynd med at blande lentivirus-holdige cellekultur supernatant med cardiomyocyte vedligeholdelse medium, på en en til en ratio. Tilsæt hexadimetherine bromid ved en endelig koncentration på 8 mikrogram pr. milliliter for at øge infektionens effektivitet. Og erstatte cardiomyocyte vedligeholdelse medium i IPS celle-afledte kardiomyocytter kultur parabol, med infektionen medium.Dyrk de inficerede kardiomyocytter i 12 timer ved 37 grader Celsius, og erstatte infektionsmediet med frisk kardiomyocyt vedligeholdelsesmedie. Før billeddannelse, udveksle cellekultur medium med Tyrode's opløsning, suppleret med calcium. Derefter placere kardiomyocytter i en billeddannelse kammer på scenen af en omvendt epifluorescens mikroskop udstyret med et billede splitter.Hvis elektrisk tempo er påkrævet, installere pacing elektroder i billedbehandling kammer og forbinde elektroderne til en stimulus generator. Få cellerne i fokus, og find en celle, der udtrykker den genetisk kodede spændingsindikator i midten af visningsfeltet. Indstil den optiske kurve, så det udsendte lys dirigeres til billedsplitteren, og skift filterkuben i mikroskopet til den, der skal kombineres med filtrene i billedsplitteren.I den software, der styrer kameraet, skal du indstille anskaffelsesindstillingen, så højhastighedsbilleddannelse er mulig, og indstille billedsplitteren i henhold til producentens anvisninger. De to billeder, der repræsenterer de to forskellige emissionsbølgelængdebånd, skal være ved siden af hinanden, der hver især optager den ene halvdel af billedet. Kontroller og juster fokus for det billede, der produceres af kameraet, efter behov.Og juster lysstyrken af belysningslyset, så pixelmætning undgås. Indstil anskaffelsen af tidsserien, og dæmp lyset i rummet for at undgå omstrejfende lys, der påvirker målingen. Åbn derefter excitationslyslukkeren og begynd anskaffelsen af billedserien, der starter den elektriske pacing på det rette tidspunkt, som eksperimentelt passende.Når købet er færdigt, skal du lukke excitation lys lukkeren efter behov og gemme optagelsen til harddisken. Derefter, forlader optagelsen indstilling uændret, optage baggrunden over et område af coverslip uden celler. Til analyse af den optiske membran potentielle optagelser, åbne tiff stak, der indeholder cellerne i ImageJ, og bruge frihåndsvalg værktøj til at tegne en region af interesse over en fluorescerende cardiomyocyte, i den røde kanal, idet pas på, at området er stort nok, at cellen ikke vil flytte ud af regionen, mens ordregivende.Vælg derefter Analysér, Værktøjer, Interesseområdeleder, og vælg Tilføj T for at tilføje området som Interesseområde 1. Træk interesseområdet hen over den samme celle i den grønne kanal, og tilføj dette område som Interesseområde 2. Under menuerne Analyser og Angiv målinger skal du fjerne markeringen af alle indstillingerne med undtagelse af den grå middelværdi.Klik på Mere og Flere mål i Interessestyring for at markere indstillingerne Mål alle udsnit og Én række pr. udsnit i Region Interessestyring, og klik på OK. Der åbnes et vindue med et regneark med de tre rækker. Brug Fil og Gem som til at gemme regnearket i en kommasepareret værdifil. Luk vinduet med billedstakken og regnearksvinduet uden at lukke vinduet Interessestyringsområde, og åbn den tiffstak, der indeholder baggrundsmålingen.Klik på flere og flere målpunkter i Interessestyring for at markere indstillingerne Mål alle udsnit og Én række pr. udsnit, og klik på OK. Gem derefter baggrundsdataene i en separat csv-fil. Her er en repræsentativ enkelt IPS celle-afledt cardiomyocyte afbildet med de hvide stiplede linjer markerer de regioner af interesse, tegnet under billeddannelse analyse i RFP og GFP kanaler vises. Signalet fra RFP-kanalen viser en periodisk stigning i lysstofrørsintensitet under hver handlingspotentiale på grund af en stigende tvungen eller resonansenergioverførsel forårsaget af ændringer i membranpotentialet.Concordantly, GFP signalet udviser et periodisk fald i fluorescerende intensitet. RFP/GFP-forholdet er det biologiske signal, der anvendes i downstream-analyser, såsom virkningspotentiale varighed 50 og 90 målinger. For eksempel, ved hjælp af denne metode, 30-dages gamle ventrikel som IPS celle-afledte kardiomyocytter placeret på 0,5 Hertz, viste en gennemsnitlig handling potentiel varighed 50 af 439 millisekunder, og en gennemsnitlig handling potentiel varighed 90 af 520 millisekunder.Elektrisk stimulering af IPS celle-afledte kardiomyocytter ved stigende stimulation satser hver fem beats, viste en gradvis afkortning af aktionspotentialer som slå sats steg. Desuden, behandling af spontant slå IPS celle-afledte kardiomyocytter med isoproternol, en ikke-selektiv beta adreno receptor agonist, førte til en hurtig stigning i slå sats, der kunne øges yderligere med stigende doser af agonist. Mens denne metode giver overlegen gennemløb i forhold til klassiske elektrofysiologiske målinger, skal man være opmærksom på dens begrænsninger, herunder en tidsmæssig opløsning, der er begrænset af de iboende kinetiske egenskaber af fluorescerende spænding sensor.

Research

JoVE Journal

Biology

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv Udledning af menneskelige Hjerte prækursorer og cardiomyocytter fra Pluripotente humane embryonale stamceller med småmolekyle Induktion

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Selektion og isolering Kolonier af Human induceret pluripotente stamceller omprogrammeret fra voksne fibroblaster

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Omprogrammering humane somatiske celler i induceret pluripotente stamceller (IPSC&#39;er) under anvendelse af retroviral vektor med GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

Isolering og Kv-optagelser i murine atrielle og ventrikulære cardiomyocytter

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Human cardiomyocytes: En Differentiering Protocol fra Feeder-fri Menneskelige induceret pluripotente stamceller

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Effektiv Generation Menneskelige induceret pluripotente stamceller fra humane somatiske celler med Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

High Efficiency Differentiering af humane pluripotente stamceller til hjertemuskelceller og karakterisering ved hjælp af flowcytometri

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

Isolering af humane ventrikulære kardiomyocytter fra Vibratome-Cut Myocardial Slices

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

Automatiseret produktion af humane inducerede pluripotente stamceller-afledte kortikale og dopaminerge neuroner med integreret Live-Cell Overvågning

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...