Name: subtype-specific optical action potential recordings in human induced pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes
Uploaded: 2018-09-27T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door subsidies uit de Duitse Research Foundation (Si 1747/1-1), het anders Kröner-Fresenius-Stiftung en de Deutsche Stiftung für Herzforschung.

1. bereiding van iPSC afkomstige Cardiomyocytes Imaging
Opmerking: Methoden voor iPSC cultuur en cardiale differentiatie zijn gepubliceerd vóór12,13,14 en worden niet hier in detail besproken. De zuivering van iPSC-CMs door handmatige microdissection, magnetische cel scheiding of lactaat selectie is aanbevolen, afhankelijk van het gebruikte protocol van differentiatie. Voor het volgende protocol werde...

<ol>
	<li>Sinnecker, D., Laugwitz, K. L., Moretti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+development+and+toxicity+testing.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug development and toxicity testing.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 143 (2), 246-252 (2014).</li><li>Goedel, A., My, I., Sinnecker, D., Moretti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+and+Challenges+of+Pluripotent+Stem+Cells+in+Cardiac+Arrhythmia+Research.">Perspectives and Challenges of Pluripotent Stem Cells in Cardiac Arrhythmia Research.</a> Current Cardiology Reports. 19 (3), 23 (2017).</li><li>Rocchetti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+arrhythmogenic+mechanisms+of+long-QT+syndrome+CALM1-F142L+mutation+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Elucidating arrhythmogenic mechanisms of long-QT syndrome CALM1-F142L mutation in patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cardiovascular Research. 113 (5), 531-541 (2017).</li><li>Sinnecker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+long-QT+syndromes+with+iPS+cells.">Modeling long-QT syndromes with iPS cells.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 6 (1), 31-36 (2013).</li><li>Talkhabi, M., Aghdami, N., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiomyocyte+generation+from+pluripotent+stem+cells:+A+state-of-art.">Human cardiomyocyte generation from pluripotent stem cells: A state-of-art.</a> Life Sciences. , 98-113 (2016).</li><li>Ben-Ari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+electrophysiological+characteristics+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).</li><li>Den Hartogh, S. C., Passier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+Review:+Fluorescent+Reporters+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells:+Contributions+to+Cardiac+Differentiation+and+Their+Applications+in+Cardiac+Disease+and+Toxicity.">Concise Review: Fluorescent Reporters in Human Pluripotent Stem Cells: Contributions to Cardiac Differentiation and Their Applications in Cardiac Disease and Toxicity.</a> Stem Cells. 34 (1), 13-26 (2016).</li><li>Schweizer, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-specific+differentiation+of+cardiac+pacemaker+cell+clusters+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Subtype-specific differentiation of cardiac pacemaker cell clusters from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 229 (2017).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-specific+promoter-driven+action+potential+imaging+for+precise+disease+modelling+and+drug+testing+in+hiPSC-derived+cardiomyocytes.">Subtype-specific promoter-driven action potential imaging for precise disease modelling and drug testing in hiPSC-derived cardiomyocytes.</a> European Heart Journal. 38 (4), 292-301 (2017).</li><li>Lam, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+FRET+dynamic+range+with+bright+green+and+red+fluorescent+proteins.">Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Bhattacharya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes+and+characterization+by+flow+cytometry.">High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).</li><li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+production.">Lentivirus production.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1499 (2009).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Jung, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dantrolene+rescues+arrhythmogenic+RYR2+defect+in+a+patient-specific+stem+cell+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> EMBO Molecular Medicine. 4 (3), 180-191 (2012).</li><li>Lemoine, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+cardiomyocytes+cultured+in+3D+engineered+heart+tissue+show+physiological+upstroke+velocity+and+sodium+current+density.">Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density.</a> Scientific Reports. 7, 5464 (2017).</li><li>Dorn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+nkx2-5+transcriptional+repression+of+isl1+controls+cardiomyocyte+subtype+identity.">Direct nkx2-5 transcriptional repression of isl1 controls cardiomyocyte subtype identity.</a> Stem Cells. 33 (4), 1113-1129 (2015).</li><li>Kaestner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+Encoded+Voltage+Indicators+in+Circulation+Research.">Genetically Encoded Voltage Indicators in Circulation Research.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (9), 21626-21642 (2015).</li></ol>

De hier beschreven methode kunt een optische recording van APs van een specifiek subtype (d.w.z., ventriculaire-achtige cellen) van CMs gegenereerd op basis van menselijke iPSCs. Menselijke iPSC-CMs een opkomende instrument om een grote verscheidenheid aan biologische en medische problemen, en de differentiatie naar verschillende subtypen van CM is een belangrijke bron van experimentele variabiliteit. Met behulp van specifieke promotor elementen, wordt de expressie van een GEVI specifiek bereikt in CMs die het s...

Cardiomyocytes (CMs) afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) zijn een opkomende hulpmiddel om te ontleden van moleculaire mechanismen van hart-en vaatziekten, onderzoeken van nieuwe therapieën, en scherm voor bijwerkingen van geneesmiddelen cardiale effecten1,2 ,3. Vanaf het begin zijn arrhythmogenic ziekten zoals channelopathies een belangrijk aandachtspunt van dit onderzoek gebied4. Daarom zijn de methoden te onderzoeken elektrische fenotypes van CMs, zoals hartritmestoornissen of veranderingen in actiepotentiaal (AP) morphologies, in het hart van deze technologie.
Een belangrijke overweging bij de toepassing van iPSC-CMs is dat huidige cardiale differentiatie protocollen niet leiden een homogene bevolking van cellen tot. Integendeel, ze zijn eerder een mengsel van cellen die lijkt op de sinusknoop, atriale, en ventriculaire CMs op verschillende niveaus van rijping5,,6,,7,8. Deze heterogeniteit kunnen een relevante bron van experimentele variabiliteit, vooral als parameters zoals AP duur (APD) worden onderzocht, die intrinsiek verschillen tussen CM subtypen (bijvoorbeeldde APD is korter in atriale dan in ventriculaire CMs). De conventionele aanpak van dit probleem is te onderzoeken enkele iPSC-CMs met behulp van de methode van de klem patch en classificeren van elke cel als knooppunten-, atriale-, of ventriculaire-achtige, gebaseerd op de AP morfologie9. Een latere analyse kan vervolgens worden beperkt tot de cellen vertegenwoordigt het CM-subtype van belang. Het grote nadeel van deze strategie is de beperkte gegevensdoorvoer en de afwezigheid van schaalbaarheid. Het invasieve karakter van patch klem electrofysiologie staat bovendien geen de beeldvorming van dezelfde cellen sequentieel over langere tijd.
Wij bieden hier, experimentele details op een10 van de methode ontwikkeld om het beeld optisch APs in specifieke subtypen van iPSC-CMs. Dit overwint het probleem van de subtype heterogeniteit en drastisch verhoogt de doorvoer in vergelijking met conventionele methoden, zodat de snelle fenotypering voor iPSC-CMs uitvoering van genetische varianten of worden blootgesteld aan farmacologische agenten.
Overzicht van de subtype-specifieke optische beeldvorming aanpak
Een genetisch-gecodeerde voltage indicator (GEVI), waarvan fluorescentie-eigenschappen op de depolarisatie en repolarisatie van de celmembraan wijzigen, wordt gebruikt om het beeld optisch veranderingen van het membraanpotentiaal van CMs. De hier toegepast GEVI is de spanning detecterende fluorescent proteïne VSFP-CR11, die uit een spanning-sensing transmembraan domein gesmolten aan een combinatie van een groene (klaver) en een rode (mRuby2) TL proteïne (figuur 1A bestaat). Als gevolg van de nabijheid van de twee fluorophores, de excitatie van de groen fluorescente proteïne in een fractie van de energie van de excitatie worden overgebracht naar de rode fluorescerende eiwit via Förster resonance energy transfer (FRET) resultaten. Daarom is de excitatie van de groen fluorescente proteïne resulteert in een emissie van zowel de groene en de rode fluorescerende eiwitten (figuur 1A, bovenste deelvenster). Wanneer de cel depolarizes, een structurele omlegging van de voltage-sensor gebeurt dat vertaalt zich in een heroriëntering van de twee fluorescente proteïnen, verhoging van de efficiëntie van de FRET. Dus wordt nog meer van de excitatie-energie overgebracht van het groen aan de rode fluorescente proteïne (figuur 1A, lagere paneel). Dientengevolge, in een depolarized cel, de uitstoot van groene fluorescentie is minder scherp, en de rode fluorescentie-emissie is helderder dan in een cel in rust membraanpotentiaal (figuur 1B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig1.jpg"> Figuur 1: optische beeldvorming van de membraanpotentiaal met VSFP-CR. (A) A schematische voorstelling afgebeeld van de actie van de spanning-gevoelige fluorescent proteïne DIE VSFP-CR wordt weergegeven. Bij de depolarisatie van de celmembraan, een structurele herschikking in het spanning-sensing transmembraan domein vertaalt zich in een heroriëntering van de groene (GFP) en rode (RFP) TL proteïne, verhoging van de efficiëntie van de intramoleculaire Förster resonance energy transfer (FRET). (B) de emissie spectra van een VSFP op de excitatie van de GFP in cellen bij de rustpotentiaal membraan (bovenste deelvenster) en depolarized cellen (lagere paneel) worden afgebeeld. De spectrale verandering op depolarisatie is overdreven voor de duidelijkheid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
De veranderingen in de efficiëntie van de FRET spiegeling van de schommelingen van de membraanpotentiaal zijn beeld met behulp van een fluorescentie Microscoop voorzien van een afbeelding splitter, die scheidt van de rode en groene fluorescentie emissies en projecteert ze op twee aangrenzende gebieden van de chip van een sCMOS camera (Figuur 2). Met deze set-up, kan de emissie van de fluorescentie bij twee verschillende golflengte bands opgenomen worden gelijktijdig, waardoor de berekening van een ratio van rood-tot-groen fluorescentie na te denken van de membraanpotentiaal in elk beeld van een time-lapse serie.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig2.jpg"> Figuur 2: configuratie van het imaging systeem. De belangrijkste componenten van de imaging systeem gebruikt om te afbeelding de spectrale veranderingen van de spanning-gevoelige fluorescent proteïne spiegeling van de mogelijke wijzigingen van de membraan met een hoge temporele resolutie worden afgebeeld. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
De expressie van VSFP-CR in CMs wordt bereikt door lentivirale transductie. Directe uitdrukking aan het CM-subtype van belang, heeft de lentivirus een promotor element (de MLC2v -enhancer) die specifiek transcriptie in ventriculaire-achtige iPSC-CMs10 drijftbevat. Wanneer de iPSC-CMs waarmee een mengsel van cellen atriale-achtige, knooppunten-achtige en ventriculaire-achtige zijn getransduceerde met deze lentivirus, uit VSFP-CR zich alleen in de ventriculaire-achtige cellen. Aangezien de actiepotentiaal optische beeldvorming, hangt af van deze TL sensor, vertegenwoordigen de opgenomen actie potentials uitsluitend het CM-subtype van belang (Figuur 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig3.jpg"> Figuur 3: promotor-gedreven VSFP uitdrukking voor de potentiële imaging subtype-specifieke membraan. (een) dit schema toont hoe cardiomyocyte subtype-specifieke optische actiepotentiaal opnamen worden bereikt. (b) iPSC-CMs besmet met een VSFP onder de controle van de ventriculaire-specifieke MLC2v-enhancer worden weergegeven. De expressie van de voltage-sensor wordt waargenomen alleen in ventriculaire-achtige CMs in het GFP-kanaal (linkerdeel). De fase contrast (middelste deelvenster) en het overlaybeeld (rechtervenster) zijn ook aanwezig. De witte stippellijnen mark celbegrenzing. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#223;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21331046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS(Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16141079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax-I Supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050061</td>
			<td>alternative L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin bovine plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>Worthington Biochem</td>
			<td>LS004174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine Bromide (Polybrene)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9268</td>
			<td>enhancing lentiviral infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 cm glass-bottom microdishes</td>
			<td>MatTek corporation, Ashland, MA, USA</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stand</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DMI6000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope objective</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td colspan="2">HCX PL APO 63x/1.4-0.6 Oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor Technology, Belfast, UK</td>
			<td>Zyla V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope filter cube: excitation filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA</td>
			<td>ET480/40X</td>
			<td>bandpass 480/40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope filter cube: dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA</td>
			<td>T505lpxr</td>
			<td>longpass 505 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter</td>
			<td>&#160;Cairn Research, Faversham, UK</td>
			<td>OptoSplit II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter filter cube: dichroic mirror</td>
			<td>AHF Analysentechnik GmbH, T&#252;bigen, Germany</td>
			<td>568LPXR</td>
			<td>longpass 568 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter filter cube: emission filter 1 (GFP emission)</td>
			<td>AHF Analysentechnik GmbH, T&#252;bigen, Germany</td>
			<td>520/28 BrightLine HC</td>
			<td>bandpass 520/28 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter filter cube: emission filter 2 (RFP emission)</td>
			<td>AHF Analysentechnik GmbH, T&#252;bigen, Germany</td>
			<td>630/75 ET Bandpass</td>
			<td>bandpass 630/75 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacing inset</td>
			<td>Warner Instruments, Hamden, CT, USA</td>
			<td>RC-37FS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subtype-specific optical action potential recordings in human induced pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes

Cardiomyocytes gegenereerd op basis van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC-CMs) zijn een opkomende hulpmiddel bij cardiovasculair onderzoek. In plaats van een homogene bevolking van cellen, de iPSC-CMs gegenereerd door huidige differentiatie protocollen vertegenwoordigen een mengsel van cellen met ventriculaire-, atriale-, en knooppunten-achtige fenotypen, die compliceert fenotypische analyses. Hier, wordt een methode om optisch record actie potentials specifiek van ventriculaire-achtige iPSC-CMs gepresenteerd. Dit wordt bereikt door lentivirale transductie met een constructie waarin een genetisch-gecodeerde voltage-indicator onder de controle van een ventriculaire-specifieke promotor-element is. Wanneer iPSC-CMs zijn getransduceerde met deze constructie, wordt de voltage-sensor uitgedrukt uitsluitend in ventriculaire-achtige cellen, waardoor potentiële opnames subtype-specifieke optische membraan met behulp van time-lapse fluorescentie microscopie.

In figuur 4a, is een representatieve één iPSC-CM afgebeeld met de witte stippellijnen markering van de ROI getrokken tijdens de imaging analyse in de RFP (links) en het kanaal GFP (rechts). Het signaal van het RFP kanaal toont een periodieke verhoging in fluorescerende intensiteit tijdens elke actiepotentiaal (figuur 4b, bovenste deelvenster). Zoals beschreven in de inleiding, is dit te wijten aan een toenemende FRET veroorzaak...

Watch this Scientific Journal Video about Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes at JoVE.com

Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes

Hier presenteren we een methode om optisch beeld actie potentieel, specifiek in ventriculaire-achtige geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige cardiomyocytes. De methode is gebaseerd op de promotor-gedreven uitdrukking van een spanning-gevoelige fluorescent proteïne.

Subtype-specifieke optische actiepotentiaal opnamen in mens geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige ventriculaire Cardiomyocytes

Cardiomyocytes generated from human induced pluripotent stem cells (iPSC-CMs) are an emerging tool in cardiovascular research. Rather than being a ...

Cardiomyocyten gegenereerd uit geïnduceerde Pluripotente Stam of IPS cellen worden steeds vaker gebruikt om een verscheidenheid aan biologische vragen op het gebied van cardiale elektrofysiologie te beantwoorden. De belangrijkste voordelen van deze technologie zijn dat het een dramatische toename van de doorvoer mogelijk maakt, evenals subtypespecifieke actie potentiële opnames in ventriculaire zoals myocyten, met behulp van een ventriculaire specifieke promotor element. De introductie van genetisch gecodeerde spanningssensoren door lentivirale transductie maakt de optische beeldvorming van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen-afgeleide cardiomyocyten actiemogelijkheden mogelijk.Begin met het mengen van lentivirus-bevattende celcultuur supernatant met cardiomyocyte onderhoudsmedium, bij een verhouding één op één. Voeg hexadimetherine bromide met een uiteindelijke concentratie van 8 microgram per milliliter, om de infectie efficiëntie te verbeteren. En vervang het cardiomyocyte onderhoudsmedium in de IPS cel-afgeleide cardiomyocyten cultuurschotel, met het infectiemedium.Kweek de geïnfecteerde cardiomyocyten gedurende 12 uur bij 37 graden Celsius en vervang het infectiemedium door vers cardiomyocyten onderhoudsmedium. Voor beeldvorming wissel je het celkweekmedium uit met de oplossing van Tyrode, aangevuld met calcium. Plaats vervolgens de cardiomyocyten in een beeldkamer op het podium van een omgekeerde epifluorescentiemicroscoop uitgerust met een beeldsplinator.Als elektrische pacing nodig is, installeer pacing elektroden in de beeldkamer en sluit de elektroden aan op een stimulus generator. Breng de cellen in beeld en zoek een cel die de genetisch gecodeerde spanningsindicator in het midden van het kijkveld uitdrukt. Stel het optische pad zo in dat het uitgezonden licht naar de beeldsplin wordt gerouteerd en schakel de filterkubus in de microscoop over op het pad dat moet worden gecombineerd met de filters in de beeldspl splitter.Stel in de software die de camera bestuurt de acquisitie-instelling zo in dat snelle beeldvorming mogelijk is en stel de beeldsplitser in volgens de instructies van de fabrikant. De twee beelden die de twee verschillende emissiegolflengtebanden vertegenwoordigen, moeten naast elkaar liggen, die elk de helft van het beeld bezetten. Controleer en pas de focus van het beeld dat door de camera wordt geproduceerd indien nodig aan.En pas de helderheid van het verlichtingslicht aan, zodat pixelverzadiging wordt vermeden. Stel de verwerving van de tijdreeks in en dim het licht in de ruimte om strooilicht te voorkomen dat de meting beïnvloedt. Open vervolgens de excitatielichtluiter en begin met de aankoop van de beeldreeks, waarbij de elektrische pacing op het juiste tijdstip begint, als experimenteel geschikt.Wanneer de overname is voltooid, sluit u de excitatielichtluis indien nodig en slaat u de opname op de harde schijf. Als u vervolgens de opnameinstelling ongewijzigd laat, neemt u de achtergrond op over een gebied van de coverslip zonder cellen. Voor analyse van de optische membraan potentiële opnames, open de tiff stack met de cellen in ImageJ, en gebruik maken van de vrije hand selectie tool om een regio van belang te trekken over een fluorescerende cardiomyocyte, in het rode kanaal, zorg ervoor dat het gebied groot genoeg is dat de cel niet zal bewegen uit de regio, terwijl contracting.Selecteer vervolgens Analyseren, Extra's, Regiobelang manager en selecteer T toevoegen, om de regio toe te voegen als Regio van Belang 1. Sleep het interessegebied over dezelfde cel in het groene kanaal en voeg deze regio toe als Regio van Belang 2. Schakel onder de menu's Metingen analyseren en instellen alle opties uit, behalve de gemiddelde grijswaarde.Klik in de Regio van belang manager op Meer en meer meten om de opties Meten alle segmenten en Één rij per segment te selecteren en klik op OK. Er wordt een venster geopend met een spreadsheet met de drie rijen. Gebruik Bestand en Opslaan als om de spreadsheet op te slaan in een door komma's gescheiden waardebestand. Sluit het venster met de afbeeldingsstapel en het spreadsheetvenster zonder het venster Regio van Belangbeheer te sluiten en open de tiff-stapel met de achtergrondmeting.Klik in de regio van belang manager op de meer en meerdere meting om de opties Alle segmenten en Één rij per segment te selecteren en klik op OK. Sla vervolgens de achtergrondgegevens op in een apart csv-bestand. Hier wordt een representatieve cardiomyocyte van één IPS-cel afgebeeld met de witte stippellijnen die de interessegebieden markeren, die zijn getrokken tijdens de beeldvormingsanalyse in de RFP- en GFP-kanalen. Het signaal van het RFP-kanaal toont een periodieke toename van fluorescerende intensiteit tijdens elk actiepotentieel als gevolg van een toenemende gedwongen of resonantie-energieoverdracht veroorzaakt door veranderingen in het membraanpotentieel.Concordantly vertoont het GFP-signaal een periodieke afname van fluorescerende intensiteit. De RFP/GFP-verhouding is het biologische signaal dat wordt gebruikt in downstream-analyses, zoals actiepotentieelsduur 50- en 90-metingen. Bijvoorbeeld, met behulp van deze methode, 30-dagen oude ventriculaire zoals IPS cel-afgeleide cardiomyocyten geplaatst op 0,5 Hertz, toonde een gemiddelde actie potentiële duur 50 van 439 milliseconden, en een gemiddelde actie potentiële duur 90 van 520 milliseconden.Elektrische stimulatie van de IPS-cel-afgeleide cardiomyocyten bij toenemende stimulatie tarieven om de vijf slagen, toonde een geleidelijke verkorting van de actie mogelijkheden als het pak slaag tarief toegenomen. Bovendien leidde de behandeling van de spontaan kloppende IPS-cel-afgeleide cardiomyocyten met isoproternol, een niet-selectieve bèta-adrenoreceptor agonist, tot een snelle toename van het afstraffingspercentage, dat verder kan worden verhoogd met toenemende doses van de agonist. Hoewel deze methode een superieure doorvoer biedt in vergelijking met klassieke elektrofysiologische metingen, moet men zich bewust zijn van de beperkingen ervan, inclusief een temporele resolutie die wordt beperkt door de intrinsieke kinetische eigenschappen van de tl-spanningssensor.

Research

JoVE Journal

Biology

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Transfecteren en Nucleofecting Human geïnduceerde pluripotente stamcellen

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Efficiënte Afleiding van de Mens Cardiac precursoren en cardiomyocyten uit pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Selecteren en isoleren van Koloniën van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen geherprogrammeerd tegen Adult Fibroblasten

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Herprogrammeren menselijke somatische cellen in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) Met behulp van retrovirale vector met GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

Isolatie en Kv Channel Opnamen in Murine atriale en ventriculaire cardiomyocyten

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generatie van Human Cardiomyocytes: Een Differentiatie Protocol van Feeder-vrije Human geïnduceerde pluripotente stamcellen

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Efficiënte Generation humane geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke somatische cellen met Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

High Efficiency differentiatie van humane pluripotente stamcellen naar cardiomyocyten en karakterisering door flowcytometrie

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

Isolatie van human ventriculaire cardiomyocyten van Vibratome-Cut Myocardial Slices

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

Geautomatiseerde productie van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide corticale en dopaminerge neuronen met geïntegreerde live-cel monitoring

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...