Name: subtype-specific optical action potential recordings in human induced pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes
Uploaded: 2018-09-27T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Si 1747/1-1), die Else Kröner-Fresenius-Stiftung und der Deutschen Stiftung Für Herzforschung unterstützt.

1. Vorbereitung des iPSC-abgeleitete Kardiomyozyten für Imaging
Hinweis: Methoden für iPSC Kultur und kardialen Differenzierung vor12,13,14 veröffentlicht worden und werden hier nicht ausführlich diskutiert. Die Reinigung des iPSC-CMs durch manuelle Mikrodissektion, magnetische Zellseparation oder Laktat-Auswahl wird empfohlen, je nach Differenzierung Protokoll verwendet. Für das folgende Protokoll...

<ol>
	<li>Sinnecker, D., Laugwitz, K. L., Moretti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+development+and+toxicity+testing.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug development and toxicity testing.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 143 (2), 246-252 (2014).</li><li>Goedel, A., My, I., Sinnecker, D., Moretti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+and+Challenges+of+Pluripotent+Stem+Cells+in+Cardiac+Arrhythmia+Research.">Perspectives and Challenges of Pluripotent Stem Cells in Cardiac Arrhythmia Research.</a> Current Cardiology Reports. 19 (3), 23 (2017).</li><li>Rocchetti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+arrhythmogenic+mechanisms+of+long-QT+syndrome+CALM1-F142L+mutation+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Elucidating arrhythmogenic mechanisms of long-QT syndrome CALM1-F142L mutation in patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cardiovascular Research. 113 (5), 531-541 (2017).</li><li>Sinnecker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+long-QT+syndromes+with+iPS+cells.">Modeling long-QT syndromes with iPS cells.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 6 (1), 31-36 (2013).</li><li>Talkhabi, M., Aghdami, N., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiomyocyte+generation+from+pluripotent+stem+cells:+A+state-of-art.">Human cardiomyocyte generation from pluripotent stem cells: A state-of-art.</a> Life Sciences. , 98-113 (2016).</li><li>Ben-Ari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+electrophysiological+characteristics+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).</li><li>Den Hartogh, S. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Bhattacharya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes+and+characterization+by+flow+cytometry.">High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).</li><li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+production.">Lentivirus production.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1499 (2009).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Jung, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dantrolene+rescues+arrhythmogenic+RYR2+defect+in+a+patient-specific+stem+cell+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> EMBO Molecular Medicine. 4 (3), 180-191 (2012).</li><li>Lemoine, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+cardiomyocytes+cultured+in+3D+engineered+heart+tissue+show+physiological+upstroke+velocity+and+sodium+current+density.">Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density.</a> Scientific Reports. 7, 5464 (2017).</li><li>Dorn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+nkx2-5+transcriptional+repression+of+isl1+controls+cardiomyocyte+subtype+identity.">Direct nkx2-5 transcriptional repression of isl1 controls cardiomyocyte subtype identity.</a> Stem Cells. 33 (4), 1113-1129 (2015).</li><li>Kaestner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+Encoded+Voltage+Indicators+in+Circulation+Research.">Genetically Encoded Voltage Indicators in Circulation Research.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (9), 21626-21642 (2015).</li></ol>

Die hier beschriebene Methode ermöglicht eine optische Aufnahme von APs aus ein bestimmten Subtyp (z.B. ventrikuläre-wie Zellen) des CMs generiert aus menschlichen iPSCs. Menschlichen iPSC-CMs sind eine aufstrebende Werkzeug, eine Vielzahl von biologischen und medizinischen Probleme anzugehen, und die Differenzierung zu CM-Subtypen ist eine wichtige Quelle für experimentelle Variabilität. Mithilfe von spezifischen Promotor Elemente wird der Ausdruck einer GEVI speziell im CMs repräsentieren den Untertyp des...

Kardiomyozyten (CMs) von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) abgeleitet sind eine aufstrebende Werkzeug zu Molekulare Mechanismen von Herzerkrankungen, um neue Therapien zu untersuchen und zu Bildschirm für kardiale Nebenwirkungen Effekte1,2 sezieren ,3. Von Anfang an wurden Arrhythmogenic Krankheiten wie channelopathien ein wichtiger Schwerpunkt der Forschung Bereich4. Infolgedessen sind Methoden zu untersuchen, elektrische Phänotypen von CMs, wie Herzrhythmusstörungen oder Änderungen der Aktionspotential (AP) Morphologien, das Herzstück dieser Technologie.
Ein wichtiger Aspekt bei der Anwendung der iPSC-CMs ist, dass die aktuellen Protokolle der kardialen Differenzierung nicht zu einer homogenen Bevölkerung der Zellen führen. Stattdessen sind sie eher eine Mischung aus Zellen ähnlich Sinusknoten, Vorhofflimmern, und ventrikuläre CMs auf verschiedenen Ebenen der Reifung5,6,7,8. Diese Heterogenität kann eine relevante Quelle der experimentellen Variabilität, vor allem, wenn Parameter wie AP-Dauer (APD) untersucht werden, die per se unterscheiden sich zwischen CM Subtypen (z. B.die APD ist kürzer im Vorhofflimmern als in ventrikuläre CMs). Der konventionelle Ansatz zur Lösung dieses Problems ist es, einzelne iPSC-CMs mit der Patch-Clamp-Methode zu untersuchen und um jede Zelle als Knotenpunkt zu klassifizieren-, Vorhofflimmern-, oder ventrikuläre-Like, basierend auf der AP-Morphologie-9. Jede nachfolgende Analyse kann dann auf die Zellen aus der CM-Untertyp von Interesse beschränkt werden. Der größte Nachteil dieser Strategie ist die begrenzten Durchsatz und Mangel an Skalierbarkeit. Darüber hinaus erlaubt die invasive Art der Patch-Clamp-Elektrophysiologie nicht die Bildgebung der gleichen Zellen nacheinander über längere Zeiträume.
Hier bieten wir experimentelle Details auf eine Methode10 entwickelt, um optisch APs Bild in bestimmte Subtypen der iPSC-CMs. Dies überwindet das Problem der Subtyp Heterogenität und dramatisch erhöht den Durchsatz im Vergleich zu herkömmlichen Methoden erlauben die schnelle Phänotypisierung von iPSC-CMs genetische Varianten oder ausgesetzt pharmakologische Agenten.
Überblick über den Subtyp-spezifische optische Bildgebung Ansatz
Ein genetisch codierte Spannungsanzeige (GEVI), deren Fluoreszenzeigenschaften Depolarisation und Repolarisation der Zellmembran zu ändern, wird verwendet, um Änderungen des Membran-Potentials CMS optisch Bild. Die hier angewandte GEVI ist das Spannung-sensing fluoreszierende Protein VSFP-CR11, bestehend aus einer Spannung-sensing transmembrane Domäne verschmolzen zu einem Paar von einer grünen (Klee) und eine rote (mRuby2) fluoreszierendes Protein (Abb. 1A). Aufgrund der Nähe der zwei Fluorophore ergibt sich die Erregung des grün fluoreszierenden Proteins in einem Bruchteil der Anregungsenergie auf das rot fluoreszierende Protein über Förster Resonanz Energietransfer (FRET) übertragen werden. Daher führt die Anregung für das grün fluoreszierende Protein in einer Emission von Grün und rot fluoreszierende Proteine (Abbildung 1A, obere Leiste). Wenn die Zelle erschüttert, tritt eine strukturelle Neuordnung der Spannungssensor, die zu einer Neuausrichtung der beiden fluoreszierende Proteine, Erhöhung der FRET-Effizienz führt. Somit ist noch mehr von der Anregungsenergie vom Grün, das rot fluoreszierende Protein (Abb. 1A, untere Leiste) übertragen. Infolgedessen in einer depolarisiert Zelle grüne Fluoreszenz-Emission ist dunkler, und die rote Fluoreszenz-Emission ist heller als in einer Zelle bei ruhenden Membranpotential (Abbildung 1 b).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig1.jpg"> Abbildung 1: optische Bildgebung des Membranpotentials mit VSFP-CR. (A) A schematische Darstellung der Aktion die Spannung-empfindlichen fluoreszierenden Proteins VSFP-CR gezeigt wird. Auf die Depolarisation der Zellmembran übersetzt eine strukturelle Neuordnung in der Spannung-sensing transmembrane Domäne in eine Neuorientierung des grünen (GFP) und rot (RFP) fluoreszierendes Protein, Steigerung der Effizienz der intramolekularen Förster Resonanz Energietransfer (FRET). (B) die Emission-Spektren von VSFP auf Anregung von der GFP in Zellen an die Membran-Ruhepotential (obere Abdeckung) und depolarisiert Zellen (untere Leiste) werden dargestellt. Die spektrale Änderung nach Depolarisation ist zur Verdeutlichung übertrieben dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Die Veränderungen in der FRET-Effizienz spiegeln die Schwankungen des Membranpotentials sind abgebildet mit einem Fluoreszenzmikroskop ausgerüstet mit einer Bild-Splitter, die roten und grünen Fluoreszenz Emissionen trennt und projiziert sie auf zwei angrenzenden Gebieten der der Chip einer Kamera sCMOS (Abbildung 2). Mit diesem Set-up kann die Fluoreszenz-Emission bei zwei verschiedenen Wellenlängen Bands gleichzeitig ermöglicht die Berechnung des Verhältnisses der rot-grünen Fluoreszenz entsprechend das Membranpotential in jedem Bild eine Zeitraffer-Serie aufgezeichnet werden.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig2.jpg"> Abbildung 2: Konfiguration des das Abbildungssystem. Die Hauptkomponenten des imaging-System verwendet, um Bild, das die spektrale Veränderungen der Spannung-empfindlichen fluoreszierenden Proteins spiegeln die Membran mögliche Veränderungen mit einer hohen zeitlichen Auflösung dargestellt werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Der Ausdruck der VSFP-CR im CMs wird durch Lentivirale Transduktion erreicht. Interessenbekundung für die CM-Subtyp direkt, enthält die Lentivirus ein Promotor-Element ( MLC2v -Enhancer), das speziell Transkription in ventrikuläre wie iPSC-CMs10fährt. Wenn das iPSC-CMs, die eine Mischung von Vorhofflimmern-ähnliche, nodal-ähnliche und ventrikuläre-wie Zellen darstellen mit diesem Lentivirus ausgestrahlt werden, wird VSFP-CR nur in den linksventrikulären-ähnliche Zellen ausgedrückt. Da die optische Aktionspotential Bildgebung von fluoreszierenden Sensor abhängt, vertreten die aufgezeichneten Aktionspotentiale ausschließlich den CM-Untertyp von Interesse (Abbildung 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig3.jpg"> Abbildung 3: Projektträger-gesteuerte VSFP Ausdruck für potenzielle Bildgebung Subtyp-spezifischen Membran. (ein) dieses Schema zeigt, wie Cardiomyocyte Subtyp-spezifische optische Aktionspotential Aufnahmen erreicht werden. (b) iPSC-CMs mit einem VSFP unter der Kontrolle der ventrikulären-spezifische MLC2v-Enhancer infiziert werden angezeigt. Der Ausdruck von der Spannungssensor ist nur in ventrikuläre-ähnlichen CMs in der GFP-Kanal (links) beobachtet. Die Phasenkontrast (Mitte Platte) und Overlay-Bild (Rechte Abbildung) sind ebenfalls vorhanden. Die weiße gepunktete Linien markieren Zellgrenzen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#223;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21331046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS(Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16141079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax-I Supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050061</td>
			<td>alternative L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin bovine plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>Worthington Biochem</td>
			<td>LS004174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine Bromide (Polybrene)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9268</td>
			<td>enhancing lentiviral infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 cm glass-bottom microdishes</td>
			<td>MatTek corporation, Ashland, MA, USA</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stand</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DMI6000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope objective</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td colspan="2">HCX PL APO 63x/1.4-0.6 Oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor Technology, Belfast, UK</td>
			<td>Zyla V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope filter cube: excitation filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA</td>
			<td>ET480/40X</td>
			<td>bandpass 480/40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope filter cube: dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA</td>
			<td>T505lpxr</td>
			<td>longpass 505 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter</td>
			<td>&#160;Cairn Research, Faversham, UK</td>
			<td>OptoSplit II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter filter cube: dichroic mirror</td>
			<td>AHF Analysentechnik GmbH, T&#252;bigen, Germany</td>
			<td>568LPXR</td>
			<td>longpass 568 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter filter cube: emission filter 1 (GFP emission)</td>
			<td>AHF Analysentechnik GmbH, T&#252;bigen, Germany</td>
			<td>520/28 BrightLine HC</td>
			<td>bandpass 520/28 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter filter cube: emission filter 2 (RFP emission)</td>
			<td>AHF Analysentechnik GmbH, T&#252;bigen, Germany</td>
			<td>630/75 ET Bandpass</td>
			<td>bandpass 630/75 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacing inset</td>
			<td>Warner Instruments, Hamden, CT, USA</td>
			<td>RC-37FS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subtype-specific optical action potential recordings in human induced pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes

Kardiomyozyten generiert aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC-CMs) sind ein aufstrebenden Werkzeug in der Herz-Kreislauf-Forschung. Anstatt eine homogene Population von Zellen, repräsentieren die iPSC-CMs von aktuellen Differenzierung Protokolle erzeugt eine Mischung aus Zellen mit ventrikulären-, Vorhofflimmern-, und nodal-ähnlichen Phänotypen, die phänotypische Analysen erschwert. Hier ist eine Methode, um optisch Rekord Aktionspotentiale speziell von ventrikulären-wie iPSC-CMs präsentiert. Erreicht wird dies durch Lentivirale Transduktion mit einem Konstrukt, in dem ein genetisch codierte Spannungsanzeige unter der Kontrolle eines ventrikulären-spezifischen Promotor-Elements ist. Beim iPSC-CMs mit diesem Konstrukt ausgestrahlt werden, drückt sich die Spannungssensor ausschließlich in ventrikuläre-ähnlichen Zellen, Subtyp-spezifische optische Membran möglichen Aufnahmen mit Zeitraffer-Fluoreszenz-Mikroskopie ermöglicht.

In Abbildung 4aist eine repräsentative einzelne iPSC-CM mit den weißen gestrichelten Linien markieren den ROI bei der bildgebenden Analyse in die RFP (linke Seite) und der GFP (Rechte Seite) Kanal gezogen dargestellt. Das Signal aus dem RFP-Kanal zeigt eine regelmäßige Erhöhung in Fluoreszenz Intensität während jedes Aktionspotential (Abbildung 4 b, obere Leiste). Wie in der Einleitung beschrieben, ist dies auf eine zunehm...

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Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes

Hier präsentieren wir eine Methode, um optisch Bild Aktionspotentiale, insbesondere ventrikuläre erinnernden induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Kardiomyozyten. Die Methode basiert auf der Projektträger-gesteuerte Ausdruck eines Spannung-empfindlichen fluoreszierenden Proteins.

Subtyp-spezifische optische Aktionspotential Aufnahmen in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet ventrikuläre Kardiomyozyten

Cardiomyocytes generated from human induced pluripotent stem cells (iPSC-CMs) are an emerging tool in cardiovascular research. Rather than being a ...

Kardiomyozyten, die aus induzierten Pluripotenten Stamm- oder IPS-Zellen erzeugt werden, werden zunehmend verwendet, um eine Vielzahl biologischer Fragen auf dem Gebiet der Herzelektrophysiologie zu beantworten. Die Hauptvorteile dieser Technologie sind, dass sie eine dramatische Erhöhung des Durchsatzes sowie subtypspezifische Wirkungspotentialaufnahmen in ventrikulären wie Myozyten ermöglicht, mit einem ventrikulären spezifischen Promotorelement. Die Einführung genetisch kodierter Spannungssensoren durch lentivirale Transduktion ermöglicht die optische Bildgebung von vom Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleiteten Kardiomyozyten Wirkungspotentiale.Beginnen Sie mit dem Mischen von Lentivirus-haltigen Zellkultur-Überstand mit Kardiomyozyten-Erhaltungsmedium, in einem Verhältnis von eins zu eins. Fügen Sie Hexadimetherinbromid in einer Endkonzentration von 8 Mikrogramm pro Milliliter hinzu, um die Infektionseffizienz zu verbessern. Und ersetzen Sie das Kardiomyozyten-Pflegemedium in der IPS-Zell-abgeleiteten Kulturschale von Cardiomyozyten durch das Infektionsmedium.Kultur die infizierten Kardiomyozyten für 12 Stunden bei 37 Grad Celsius, und ersetzen Sie die Infektion Medium mit frischen Kardiomyozyten Erhaltungsmedium. Vor der Bildgebung, tauschen Sie das Zellkulturmedium mit Tyrodes Lösung, ergänzt mit Kalzium. Legen Sie dann die Kardiomyozyten in eine Bildkammer auf der Bühne eines invertierten Epifluoreszenzmikroskops, das mit einem Bildsplitter ausgestattet ist.Wenn elektrisches Tempo erforderlich ist, installieren Sie Tempoelektroden in der Bildgebungskammer und schließen Sie die Elektroden an einen Stimulusgenerator an. Bringen Sie die Zellen in den Fokus, und lokalisieren Sie eine Zelle, die die genetisch kodierte Spannungsanzeige in der Mitte des Betrachtungsfeldes ausdrückt. Stellen Sie den optischen Pfad so ein, dass das emittierte Licht an den Bildteiler geleitet wird, und schalten Sie den Filterwürfel im Mikroskop auf den Filter, der mit den Filtern im Bildteiler kombiniert werden soll.Stellen Sie in der Software, die die Kamera steuert, die Erfassungseinstellung so ein, dass eine Hochgeschwindigkeits-Bildgebung möglich ist, und richten Sie den Bildteiler gemäß den Anweisungen des Herstellers ein. Die beiden Bilder, die die beiden verschiedenen Emissionswellenlängenbänder darstellen, sollten nebeneinander liegen und jeweils die Hälfte des Bildes einnehmen. Überprüfen und passen Sie den Fokus des von der Kamera erzeugten Bildes bei Bedarf an.Und stellen Sie die Helligkeit des Beleuchtungslichts so ein, dass eine Pixelsättigung vermieden wird. Stellen Sie die Erfassung der Zeitreihe ein, und verdunkelen Sie das Licht im Raum, um zu vermeiden, dass Streulicht die Messung beeinflusst. Öffnen Sie dann den Anregungslichtauslöser und beginnen Sie mit der Erfassung der Bildserie, um das elektrische Tempo zum entsprechenden Zeitpunkt zu starten, wie es experimentell angemessen ist.Wenn die Erfassung abgeschlossen ist, schließen Sie den Anregungslichtverschluss nach Bedarf und speichern Sie die Aufnahme auf der Festplatte. Wenn Sie dann die Aufnahmeeinstellung unverändert lassen, zeichnen Sie den Hintergrund über einen Bereich des Coverslips ohne Zellen auf. Für die Analyse der optischen Membranpotentialaufzeichnungen öffnen Sie den tiff-Stack mit den Zellen in ImageJ, und verwenden Sie das Freihandauswahlwerkzeug, um einen Bereich von Interesse über eine fluoreszierende Kardiomyozyte im roten Kanal zu zeichnen, wobei darauf zu achten ist, dass der Bereich groß genug ist, dass sich die Zelle während der Kontraktion nicht aus der Region entfernt.Wählen Sie als Nächstes Analysieren, Tools, Region of Interest Manager und Add T aus, um die Region als Region of Interest 1 hinzuzufügen. Ziehen Sie den Interessenbereich über dieselbe Zelle im grünen Kanal, und fügen Sie diesen Bereich als Region of Interest 2 hinzu. Deaktivieren Sie im Menü "Messungen analysieren und festlegen" alle Optionen mit Ausnahme des mittleren Grauwertes.Klicken Sie im Bereich "Region of Interest Manager" auf Mehr und Mehrfachmessung, um die Optionen Alle Slices und eine Zeile pro Slice messen auszuwählen, und klicken Sie auf OK. Es wird ein Fenster geöffnet, das eine Kalkulationstabelle mit den drei Zeilen enthält. Verwenden Sie Datei und Speichern unter, um die Kalkulationstabelle in einer durch Kommas getrennten Wertdatei zu speichern. Schließen Sie das Fenster mit dem Bildstapel und dem Tabellenkalkulationsfenster, ohne das Fenster "Bereichs-des Interessen-Managers" zu schließen, und öffnen Sie den tiff-Stack mit der Hintergrundmessung.Klicken Sie im Bereich "Region of Interest Manager" auf "Mehr und Mehrfachmessung", um die Optionen Alle Slices und eine Zeile pro Slice messen auszuwählen, und klicken Sie auf OK. Speichern Sie dann die Hintergrunddaten in einer separaten csv-Datei. Hier wird eine repräsentative einzelne IPS-Zell-abgeleitete Kardiomyozyten mit den weißen gepunkteten Linien dargestellt, die die Interessenbereiche markieren, die während der bildgebenden Analyse in den RFP- und GFP-Kanälen gezeichnet werden. Das Signal aus dem RFP-Kanal zeigt eine periodische Erhöhung der Fluoreszenzintensität während jedes Aktionspotentials aufgrund einer zunehmenden erzwungenen oder Resonanzenergieübertragung, die durch Veränderungen des Membranpotentials verursacht wird.Entsprechend zeigt das GFP-Signal eine periodische Abnahme der fluoreszierenden Intensität. Das RFP/GFP-Verhältnis ist das biologische Signal, das in nachgeschalteten Analysen verwendet wird, wie z.B. Aktionspotentialdauer 50 und 90 Messungen. Bei dieser Methode zeigten beispielsweise 30 Tage alte ventrikuläre wie IPS-Zellabgeleitete Kardiomyozyten, die bei 0,5 Hertz platziert wurden, eine mittlere Aktionspotentialdauer von 50 von 439 Millisekunden und eine mittlere Aktionspotentialdauer von 90 von 520 Millisekunden.Die elektrische Stimulation der IPS-Zell-abgeleiteten Kardiomyozyten bei steigenden Stimulationsraten alle fünf Schläge zeigte eine fortschreitende Verkürzung der Aktionspotentiale, wenn die Schlagrate zunahm. Darüber hinaus führte die Behandlung der spontan schlagenden IPS-Zell-abgeleiteten Kardiomyozyten mit Isoproternol, einem nichtselektiven Beta-Adreno-Rezeptor-Agonisten, zu einer prompten Erhöhung der Schlagrate, die mit zunehmenden Dosen des Agonisten weiter erhöht werden konnte. Während diese Methode einen überlegenen Durchsatz im Vergleich zu klassischen elektrophysiologischen Messungen bietet, muss man sich seiner Grenzen bewusst sein, einschließlich einer zeitlichen Auflösung, die durch die intrinsischen kinetischen Eigenschaften des Fluoreszenzspannungssensors begrenzt wird.

Research

JoVE Journal

Biology

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Transfektion und Nucleofecting menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Forschung

Biologie

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effiziente Ableitung von Human Cardiac Vorstufen und Kardiomyozyten aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Selektieren und Isolieren Colonies of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus adulten Fibroblasten Umprogrammierte

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Reprogrammierung menschlichen Körperzellen in induzierte pluripotente Stammzellen (IPSCs) mit retroviralen Vektoren mit GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

Isolierung und Kv Kanal Recordings in Murine atriale und ventrikuläre Kardiomyozyten

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Human Cardiomyocytes: Eine Differenzierung Protokoll von Feeder-freien menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Effiziente Erzeugung Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Sendai-Virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

High Efficiency Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen zu Kardiomyozyten und Charakterisierung mittels Durchflusszytometrie

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

Isolierung menschlicher ventrikulärer Kardiomyozyten aus Vibratome-Cut Myokardscheiben

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

Automatisierte Produktion von humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten kortikalen und dopaminergen Neuronen mit integrierter Live-Zell-Überwachung

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...