Name: subtype-specific optical action potential recordings in human induced pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes
Uploaded: 2018-09-27T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים קרן מחקר גרמני (סי 1747/1-1), Kröner-Fresenius-Stiftung אחר, את לדנציג Stiftung דויטשה Herzforschung.

1. הכנת Cardiomyocytes נגזר iPSC עבור הדמיה
הערה: שיטות התמיינות והתרבות הלב iPSC פורסמו לפני12,13,14 , לא דנו כאן בפירוט. הטיהור של iPSC-CMs על-ידי בחירה לקטאט microdissection ידנית, ההפרדה תא מגנטי או מומלץ, בהתאם פרוטוקול בידול שמשמש. עבור פרוטוקול ה?...

<ol>
	<li>Sinnecker, D., Laugwitz, K. L., Moretti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+development+and+toxicity+testing.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug development and toxicity testing.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 143 (2), 246-252 (2014).</li><li>Goedel, A., My, I., Sinnecker, D., Moretti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+and+Challenges+of+Pluripotent+Stem+Cells+in+Cardiac+Arrhythmia+Research.">Perspectives and Challenges of Pluripotent Stem Cells in Cardiac Arrhythmia Research.</a> Current Cardiology Reports. 19 (3), 23 (2017).</li><li>Rocchetti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+arrhythmogenic+mechanisms+of+long-QT+syndrome+CALM1-F142L+mutation+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Elucidating arrhythmogenic mechanisms of long-QT syndrome CALM1-F142L mutation in patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cardiovascular Research. 113 (5), 531-541 (2017).</li><li>Sinnecker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+long-QT+syndromes+with+iPS+cells.">Modeling long-QT syndromes with iPS cells.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 6 (1), 31-36 (2013).</li><li>Talkhabi, M., Aghdami, N., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiomyocyte+generation+from+pluripotent+stem+cells:+A+state-of-art.">Human cardiomyocyte generation from pluripotent stem cells: A state-of-art.</a> Life Sciences. , 98-113 (2016).</li><li>Ben-Ari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+electrophysiological+characteristics+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).</li><li>Den Hartogh, S. C., Passier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+Review:+Fluorescent+Reporters+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells:+Contributions+to+Cardiac+Differentiation+and+Their+Applications+in+Cardiac+Disease+and+Toxicity.">Concise Review: Fluorescent Reporters in Human Pluripotent Stem Cells: Contributions to Cardiac Differentiation and Their Applications in Cardiac Disease and Toxicity.</a> Stem Cells. 34 (1), 13-26 (2016).</li><li>Schweizer, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-specific+differentiation+of+cardiac+pacemaker+cell+clusters+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Subtype-specific differentiation of cardiac pacemaker cell clusters from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 229 (2017).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-specific+promoter-driven+action+potential+imaging+for+precise+disease+modelling+and+drug+testing+in+hiPSC-derived+cardiomyocytes.">Subtype-specific promoter-driven action potential imaging for precise disease modelling and drug testing in hiPSC-derived cardiomyocytes.</a> European Heart Journal. 38 (4), 292-301 (2017).</li><li>Lam, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+FRET+dynamic+range+with+bright+green+and+red+fluorescent+proteins.">Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Bhattacharya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes+and+characterization+by+flow+cytometry.">High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).</li><li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+production.">Lentivirus production.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1499 (2009).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Jung, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dantrolene+rescues+arrhythmogenic+RYR2+defect+in+a+patient-specific+stem+cell+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> EMBO Molecular Medicine. 4 (3), 180-191 (2012).</li><li>Lemoine, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+cardiomyocytes+cultured+in+3D+engineered+heart+tissue+show+physiological+upstroke+velocity+and+sodium+current+density.">Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density.</a> Scientific Reports. 7, 5464 (2017).</li><li>Dorn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+nkx2-5+transcriptional+repression+of+isl1+controls+cardiomyocyte+subtype+identity.">Direct nkx2-5 transcriptional repression of isl1 controls cardiomyocyte subtype identity.</a> Stem Cells. 33 (4), 1113-1129 (2015).</li><li>Kaestner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+Encoded+Voltage+Indicators+in+Circulation+Research.">Genetically Encoded Voltage Indicators in Circulation Research.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (9), 21626-21642 (2015).</li></ol>

השיטה המתוארת כאן מאפשר הקלטת אופטי של APs מ תת סוג מסוים (כלומר, תאים דמויי חדרית) של CMs המופקים iPSCs האנושית. IPSC אנושי-CMs הינם כלי המתעוררים כדי לטפל במגוון עצום של בעיות ביולוגי ורפואי, הבידול כדי תתי סוגים שונים של ס מ הוא מקור חשוב של השתנות ניסיוני. באמצעות אלמנטים ספציפיים יזם, הביטוי ...

Cardiomyocytes (CMs) שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרה (iPSCs) הינם כלי המתעוררים לנתח את המנגנונים המולקולריים של מחלת לב, לחקור, טיפולים, למסך1,תופעות לוואי לב2 ,3. כבר מן ההתחלה, מחלות arrhythmogenic כמו channelopathies היה מוקד חשוב של אזור זה מחקר4. כתוצאה מכך, שיטות לחקור פנוטיפים חשמלי של מערכת ניהול תוכן, כגון הפרעות בקצב הלב או שינויי פוטנציאל הפעולה (AP) מורפולוגיות, הן בלב של טכנולוגיה זו.
שיקול חשוב ביישום של iPSC-CMs היא כי הפרוטוקולים בידול הלב הנוכחי התוצאה אינה אוכלוסיה הומוגנית של תאים. במקום זאת, הם אינם אלא תערובת של תאים דמוי צומת סינוס, פרוזדורים, CMs חדרית ברמות שונות של ההבשלה5,6,7,8. הטרוגניות זו יכולים להיות מקור רלוונטי ההשתנות ניסיוני, במיוחד אם פרמטרים כגון משך AP (APD) נחקרות, אשר ממהותם שונים בין תת ס מ (למשלAPD היא קצרה ב פרפור מאשר ב- CMs חדרית). הגישה המקובלת כדי לטפל בבעיה זו היא לחקור יחיד iPSC-CMs בשיטת מלחציים תיקון כדי לסווג כל תא כמו קטרי-, פרפור-, או דמוי חדרית, המבוססת על מורפולוגיה שלה AP9. כל ניתוח מאוחר יותר יכולה להיות מוגבלת ואז על התאים המייצג את סוג המשנה של ס מ של ריבית. החיסרון העיקרי של האסטרטגיה הזו היא שלה תפוקה מוגבלת וחוסר יכולת הרחבה. יתר על כן, העיקרון החודרני של תיקון קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה אינו מאפשר את ההדמיה של אותם תאים ברצף במשך פרקי זמן ארוכים.
כאן, אנו מספקים פרטים ניסיוני שיטת10 שפותחו כדי שטיחות תמונה APs תתי סוגים ספציפיים של iPSC-CMs. זה מתגבר על הבעיה של סוג של הטרוגניות, מגדיל באופן דרמטי את התפוקה לעומת שיטות קונבנציונליות, ומאפשר את phenotyping המהירה של iPSC-CMs נושא וריאציות גנטיות או כסוכנים חשופים תרופתי.
סקירה של הגישה דימות אופטי תת-סוג ספציפי
מחוון בקידוד גנטית מתח (GEVI), אשר המאפיינים פלורסצנטיות לשנות דפולריזציה ועל רה-פולריזציה של קרום התא, משמש לשיקוף שטיחות שינויים בפוטנציאל הממברנה של CMs. GEVI להחיל כאן הוא החלבון הניאון חישה מתח VSFP-CR11, אשר מורכב של מתח חישה transmembrane תחום דבוקה זוג ירוקה (תלתן), חלבון פלואורסצנטי אדום (mRuby2) (איור 1 א'). בשל קרבתה של fluorophores שני, עירור של חלבון פלואורסצנטי ירוק תוצאות שבריר האנרגיה עירור מועבר את חלבון פלואורסצנטי אדום דרך העברת האנרגיה של תהודה פורסטר (סריג). לכן, עירור של חלבון פלואורסצנטי ירוק התוצאה פליטה הירוק והן את החלבונים ניאון אדום (איור 1A, החלונית העליונה). כאשר התא depolarizes, מבניים סידורם מחדש של החיישן מתח מתרחשת שמתרגמת ולהתפכחות שני חלבונים פלורסנט, תוך הגדלת היעילות סריג. לפיכך, אפילו יותר של האנרגיה עירור מועבר מן הירוק החלבון הניאון אדום (איור 1A, החלונית התחתונה). כתוצאה מכך, בתא depolarized, פליטת קרינה פלואורסצנטית ירוק מעומעמת, הפליטה פלואורסצנטי אדום בהיר יותר בתא כלא נח קרומית אפשרית (איור 1B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig1.jpg"> איור 1: דימות אופטי של קרומית אפשרית עם VSFP-CR. (א) A מפרטים טכניים המתארים את הפעולה של החלבון הניאון מתח רגיש VSFP-CR מוצג. על דפולריזציה של קרום התא, מבניים סידורם מחדש בתחום transmembrane חישה מתח מיתרגם ולהתפכחות של ירוק (GFP) ו אדום חלבון פלואורסצנטי (RFP), הגדלת היעילות של פורסטר התפלגות העברת אנרגיה תהודה (סריג). (B) פליטת ספקטרום של VSFP על עירור של ה-GFP בתאים כמה פוטנציאל ממברנה המנוחה (החלונית העליונה), תאים depolarized (החלונית התחתונה) מתוארים. השינוי ספקטרלי על דפולריזציה היא מוגזמת עבור בהירות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
השינויים היעילות סריג שיקוף של התנודות של קרום פוטנציאליים הם צילמו באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות מצויד עם מפצל תמונה, אשר מפריד בין פליטת קרינה פלואורסצנטית אדום וירוק, פרויקטים אותם על גבי שני תחומי סמוכים השבב של מצלמת sCMOS (איור 2). עם הגדרת הזה, פליטת קרינה פלואורסצנטית-שתי להקות גל שונים ניתן לרשום בו זמנית, המאפשר חישוב יחס של קרינה פלואורסצנטית אדום-כדי-ירוק כדי לשקף קרום פוטנציאל כל תמונה של סידרת זמן לשגות.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig2.jpg"> איור 2: קביעת תצורה של מערכת ההדמייה. המרכיבים העיקריים של מערכת ההדמייה נהגו התמונה מתוארים השינויים ספקטרלי של החלבון הניאון מתח רגיש שיקוף השינויים פוטנציאל ממברנה ברזולוציה הטמפורלית גבוהה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
הביטוי של VSFP-CR ב- CMs מושגת על ידי התמרה חושית lentiviral. ישיר ביטוי המשנה ס מ של עניין, lentivirus מכיל רכיב יזם (משפר MLC2v ) שמניע במיוחד שעתוק חדרית דמוי iPSC-CMs10. כאשר iPSC-CMs המייצגים תערובת של תאים כמו פרפור דמוי קטרי, דמוי-חדרית הן transduced עם lentivirus הזה, VSFP-CR מבוטאת רק בתאים דמויי חדרית. מאז ההדמיה פוטנציאל הפעולה אופטי תלוי חיישן פלורסנט, פוטנציאל הפעולה המוקלטת לייצג באופן בלעדי המשנה ס"מ עניין (איור 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig3.jpg"> איור 3: ביטוי VSFP מונחה יזם עבור הדמיה פוטנציאל ממברנה סוג ספציפי. () הסכמות מציגה איך ניתן להשיג cardiomyocyte ספציפית סוג של פוטנציאל הפעולה אופטי הקלטות. iPSC (b)-נגוע VSFP תחת השליטה של MLC2v-משפר חדרית ספציפיים CMs מוצגים. הביטוי של החיישן מתח הוא ציין רק ב- CMs חדרית כמו בערוץ ה-GFP (החלונית הימנית). שלב ניגודיות (לוח האמצעי) ואת שכבת-על התמונה (לוח נכון) הינם גם מסופקים. הקווים המנוקדים לבן לסמן גבולות התא. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#223;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21331046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS(Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16141079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax-I Supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050061</td>
			<td>alternative L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin bovine plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>Worthington Biochem</td>
			<td>LS004174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine Bromide (Polybrene)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9268</td>
			<td>enhancing lentiviral infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 cm glass-bottom microdishes</td>
			<td>MatTek corporation, Ashland, MA, USA</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stand</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DMI6000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope objective</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td colspan="2">HCX PL APO 63x/1.4-0.6 Oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor Technology, Belfast, UK</td>
			<td>Zyla V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope filter cube: excitation filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA</td>
			<td>ET480/40X</td>
			<td>bandpass 480/40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope filter cube: dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA</td>
			<td>T505lpxr</td>
			<td>longpass 505 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter</td>
			<td>&#160;Cairn Research, Faversham, UK</td>
			<td>OptoSplit II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter filter cube: dichroic mirror</td>
			<td>AHF Analysentechnik GmbH, T&#252;bigen, Germany</td>
			<td>568LPXR</td>
			<td>longpass 568 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter filter cube: emission filter 1 (GFP emission)</td>
			<td>AHF Analysentechnik GmbH, T&#252;bigen, Germany</td>
			<td>520/28 BrightLine HC</td>
			<td>bandpass 520/28 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter filter cube: emission filter 2 (RFP emission)</td>
			<td>AHF Analysentechnik GmbH, T&#252;bigen, Germany</td>
			<td>630/75 ET Bandpass</td>
			<td>bandpass 630/75 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacing inset</td>
			<td>Warner Instruments, Hamden, CT, USA</td>
			<td>RC-37FS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subtype-specific optical action potential recordings in human induced pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes

Cardiomyocytes שנוצר מתאי גזע pluripotent המושרה אנושי (iPSC-CMs) הינם כלי המתעוררים במחקר לב וכלי דם. במקום להיות אוכלוסיה הומוגנית של תאים, iPSC-CMs שנוצרו על-ידי פרוטוקולים בידול הנוכחית מייצגת תערובת של תאים עם חדרית-, פרפור-, ו פנוטיפים דמוי קטרי, אשר מסבך פנוטיפי ניתוחים. כאן, מוצגת שיטה אופטית שיא פוטנציאל פעולה במיוחד מ חדרית דמוי iPSC-CMs. זו מושגת על ידי התמרה חושית lentiviral עם מבנה שבו הוא מחוון בקידוד גנטית מתח תחת השליטה של רכיב ספציפי חדרית יזם. כאשר iPSC-CMs הינם transduced עם המבנה הזה, חיישן מתח מתבטא אך ורק בתאים דמויי חדרית, המאפשר הקלטות פוטנציאל ממברנה אופטי תת-סוג ספציפי באמצעות מיקרוסקופ זריחה זמן לשגות.

ב- איור 4a, מתואר נציג יחיד iPSC ס מ עם הקווים המנוקדים לבן סימון רועי במהלך הניתוח ההדמיה ב- RFP (בצד שמאל) וערוץ GFP (צד ימין). האות מערוץ RFP מציג עלייה תקופתיים פלורסנט בעוצמה במהלך כל פוטנציאל הפעולה (איור 4b, החלונית העליונה). כפי שתואר במבוא, זאת ?...

Watch this Scientific Journal Video about Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes at JoVE.com

Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes

כאן אנו מציגים שיטה אופטית התמונה פוטנציאל פעולה, במיוחד cardiomyocytes נגזר תאי גזע pluripotent המושרה דמוי חדרית. השיטה מבוססת על הביטוי מונחה המקדם של חלבון פלואורסצנטי רגיש מתח.

סוג משנה ספציפי פוטנציאל הפעולה אופטי הקלטות-אנוש המושרה Cardiomyocytes חדרית נגזר תאי גזע Pluripotent

Cardiomyocytes generated from human induced pluripotent stem cells (iPSC-CMs) are an emerging tool in cardiovascular research. Rather than being a ...

קרדיומיוציטים המופקים מגבעול פלוריפוטנטי המושרה או תאי IPS משמשים יותר ויותר כדי לענות על מגוון רחב של שאלות ביולוגיות בתחום האלקטרופיזיולוגיה הלבבית. היתרונות העיקריים של טכנולוגיה זו הם שהיא מאפשרת עלייה דרמטית בתפוקה, כמו גם הקלטות ספציפיות לפעולה תת-סוג בחדרי חדרים כמו מיוציטים, באמצעות אלמנט מקדם ספציפי חדרית. כניסתם של חיישני מתח מקודדים גנטית באמצעות התמרה lentiviral מאפשר הדמיה אופטית של תאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי האדם נגזרים קרדיומיוציטים פוטנציאל פעולה.התחל על ידי ערבוב lentivirus המכיל תרבות תאים על טבעי עם אמצעי תחזוקה cardiomyocyte, ביחס אחד לאחד. הוסף ברומיד hexadimetherine בריכוז סופי של 8 מיקרוגרם למיליליטר, כדי לשפר את יעילות הזיהום. ולהחליף את אמצעי התחזוקה cardiomyocyte בצלחת תרבות cardiomyocytes נגזר תא IPS, עם מדיום זיהום.תרבות קרדיומיוציטים נגועים במשך 12 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, ולהחליף את מדיום הזיהום עם אמצעי תחזוקה קרדיומיוציטים טריים. לפני הדמיה, להחליף את מדיום תרבות התא עם הפתרון של טירודה, בתוספת סידן. לאחר מכן מניחים את הקרדיומיוציטים בתא הדמיה על הבמה של מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי הפוך המצויד במפצל תמונה.אם נדרש צעידה חשמלית, התקינו אלקטרודות צועדות בתא ההדמיה וחברו את האלקטרודות לגנרטור גירוי. הכניסו את התאים לפוקוס, ואתרו תא המבטא את מחוון המתח המקודד גנטית במרכז שדה הצפייה. הגדר את הנתיב האופטי כך שהאור הנפלט ינותב למפצל התמונה והחלק את קוביית המסנן במיקרוסקופ לנתיב שישולב עם המסננים במפצל התמונה.בתוכנה השולטת במצלמה, הגדר את הגדרת הרכישה כך שניתן יהיה לבצע הדמיה במהירות גבוהה, והגדר את מפצל התמונה בהתאם להוראות היצרן. שתי התמונות המייצגות את שתי רצועות אורך הגל השונות של הפליטה צריכות להיות סמוכות זו לזה, כאשר כל אחת מהן תופסת מחצית אחת של התמונה. בדוק והתאם את מוקד התמונה המיוצרת על-ידי המצלמה לפי הצורך.והתאימו את בהירות אור התאורה כך שתמנעו את רוויית הפיקסלים. הגדר את רכישת סדרת הזמן ועמעם את האור בחדר כדי למנוע אור תועה המשפיע על המדידה. לאחר מכן פתח את תריס אור העירור והתחל ברכישת סדרת התמונות, החל את ההליכה החשמלית בנקודת הזמן המתאימה, בהתאם לצורך ניסיוני.לאחר סיום הרכישה, סגור את תריס אור העירור לפי הצורך ושמור את ההקלטה בכונן הקשיח. לאחר מכן, השארת הגדרת ההקלטה ללא שינוי, הקלט את הרקע מעל אזור של הכיסוי ללא תאים. לניתוח ההקלטות הפוטנציאליות של הממברנה האופטית, פתחו את ערימת ה-tiff המכילה את התאים ב- ImageJ, ולהשתמש בכלי הבחירה ביד חופשית כדי לצייר אזור מעניין על פני קרדיומיוציט פלואורסצנטי, בערוץ האדום, תוך טיפול כך שהאזור גדול מספיק כדי שהתא לא יזוז מהאזור תוך כדי התכווצות.לאחר מכן, בחרו 'נתח', 'כלים', 'מנהל אזור העניין' ובחרו 'הוסף T', כדי להוסיף את האזור כאזור עניין 1. גרור את אזור העניין מעל אותו תא בערוץ הירוק והוסף אזור זה כאזור עניין 2. בתפריטים 'נתח' ו'קבע מידות', בטלו את הבחירה בכל האפשרויות פרט לערך האפור הממוצע.במנהל אזורי העניין, לחצו על 'עוד' ו'מידה מרובה' לבחירת האפשרויות 'למדוד את כל הפרוסות' ו'שורה אחת לפרוסה' ולחצו על הלחצן 'אשר'. ייפתח חלון המכיל גיליון אלקטרוני עם שלוש השורות. השתמש ב'קובץ' ו'שמירה בשם' כדי לשמור את הגיליון האלקטרוני בקובץ ערך מופרד באמצעות פסיקים. סגור את החלון עם מחסנית התמונות וחלון הגיליון האלקטרוני מבלי לסגור את החלון Region of Interest Manager, ופתח את מחסנית ה- tiff המכילה את מדידת הרקע.במנהל אזור העניין, לחצו על האפשרויות 'עוד' ו'מידה מרובה' לבחירת האפשרויות 'מדוד את כל הפרוסות' ו'שורה אחת לפרוסה' ולחצו על הלחצן 'אשר'. לאחר מכן שמור את נתוני הרקע בקובץ csv נפרד. כאן, נציג אחד IPS תא נגזר cardiomyocyte מתואר עם קווים מנוקדים לבנים המסמנים את אזורי העניין, שצוירו במהלך ניתוח ההדמיה בערוצי RFP ו- GFP מוצג. האות מערוץ RFP מדגים עלייה תקופתית בעוצמת הפלואורסצנט במהלך כל פוטנציאל פעולה עקב העברת אנרגיה כפויה או תהודה גוברת הנגרמת על ידי שינויים בפוטנציאל הממברנה.באופן קונקורדנטי, אות GFP מציג ירידה תקופתית בעוצמת הפלואורסצנטיות. יחס RFP/GFP הוא האות הביולוגי המשמש בניתוחים במורד הזרם, כגון משך פעולה פוטנציאלי 50 ו -90 מדידות. לדוגמה, בשיטה זו, חדר בן 30 יום כמו קרדיומיוציטים שמקורם בתאי IPS שהונחו ב- 0.5 הרץ, הראה משך פוטנציאלי פעולה ממוצע של 50 מתוך 439 אלפיות שניה, ומשך פוטנציאלי פעולה ממוצע של 90 מתוך 520 אלפיות שניה.גירוי חשמלי של הקרדיומיוציטים שמקורם בתאי IPS בשיעורי גירוי הולכים וגדלים כל חמש פעימות, הדגים קיצור הדרגתי של פוטנציאל הפעולה ככל ששיעור המכות עלה. יתר על כן, טיפול אגוניסט תאים נגזר IPS באופן ספונטני עם isoproternol, אגוניסט קולטן בטא adreno לא סלקטיבי, הוביל לעלייה מהירה בשיעור המכות, זה יכול להיות מוגבר עוד יותר עם מינונים הולכים וגדלים של אגוניסט. בעוד שיטה זו מספקת תפוקה מעולה בהשוואה למדידות אלקטרופיזיולוגיות קלאסיות, יש להיות מודעים למגבלותיה, כולל רזולוציה זמנית המוגבלת על ידי המאפיינים הקינטיים המהותיים של חיישן המתח הפלואורסצנטי.

Research

JoVE Journal

Biology

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Transfecting וNucleofecting תאי גזע אנושיים pluripotent מושרים

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

גזירת יעיל של מבשרי לב cardiomyocytes האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

בחירה בידוד מושבות של בתאי גזע pluripotent מושרה לתכנות מחדש של Fibroblasts למבוגרים

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

תכנות מחדש האדם תאים סומטיים תוך המושרה בתאי גזע pluripotent (iPSCs) באמצעות וקטור retroviral עם GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

בידוד והקלטות בערוץ KV בcardiomyocytes פרוזדורים וחדרית Murine

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

דור של cardiomyocytes אדם: פרוטוקול בידול מתאי גזע מושרה pluripotent אדם ללא מזין

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

תאי גזע יעיל דור מושרה אדם פלוריפוטנטיים מתאים הסומטיים של אדם עם סנדאי וירוס

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

בידול יעילות גבוה של תאי גזע pluripotent האדם לשריר לב ואפיון על ידי cytometry הזרימה

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

בידוד של קרדיומיוציטים חדריים אנושיים מפרוסות שריר הלב ויסטום-לחתוך

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

ייצור אוטומטי של נוירונים קורטיים קורטיים ודופאמין נגזר תאי גזע המושרה על ידי תאי גזע אנושיים עם ניטור משולב של תאים חיים

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...