Name: subtype-specific optical action potential recordings in human induced pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes
Uploaded: 2018-09-27T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes at JoVE.com

यह काम जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (एसआई 1747/1-1), और Kröner-Fresenius-Stiftung, और ड्यूश Stiftung फर Herzforschung से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।

1. इमेजिंग के लिए iPSC-व्युत्पन्न Cardiomyocytes की तैयारी
नोट: iPSC संस्कृति और हृदय विभेद के लिए तरीके12,13,14 से पहले प्रकाशित किया गया है और यहां विस्तार से चर्चा नहीं कर रहे...

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	<li>Sinnecker, D., Laugwitz, K. L., Moretti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+development+and+toxicity+testing.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug development and toxicity testing.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 143 (2), 246-252 (2014).</li><li>Goedel, A., My, I., Sinnecker, D., Moretti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+and+Challenges+of+Pluripotent+Stem+Cells+in+Cardiac+Arrhythmia+Research.">Perspectives and Challenges of Pluripotent Stem Cells in Cardiac Arrhythmia Research.</a> Current Cardiology Reports. 19 (3), 23 (2017).</li><li>Rocchetti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+arrhythmogenic+mechanisms+of+long-QT+syndrome+CALM1-F142L+mutation+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Elucidating arrhythmogenic mechanisms of long-QT syndrome CALM1-F142L mutation in patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cardiovascular Research. 113 (5), 531-541 (2017).</li><li>Sinnecker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+long-QT+syndromes+with+iPS+cells.">Modeling long-QT syndromes with iPS cells.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 6 (1), 31-36 (2013).</li><li>Talkhabi, M., Aghdami, N., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiomyocyte+generation+from+pluripotent+stem+cells:+A+state-of-art.">Human cardiomyocyte generation from pluripotent stem cells: A state-of-art.</a> Life Sciences. , 98-113 (2016).</li><li>Ben-Ari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+electrophysiological+characteristics+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).</li><li>Den Hartogh, S. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+FRET+dynamic+range+with+bright+green+and+red+fluorescent+proteins.">Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Bhattacharya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes+and+characterization+by+flow+cytometry.">High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).</li><li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+production.">Lentivirus production.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1499 (2009).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Jung, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dantrolene+rescues+arrhythmogenic+RYR2+defect+in+a+patient-specific+stem+cell+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> EMBO Molecular Medicine. 4 (3), 180-191 (2012).</li><li>Lemoine, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+cardiomyocytes+cultured+in+3D+engineered+heart+tissue+show+physiological+upstroke+velocity+and+sodium+current+density.">Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density.</a> Scientific Reports. 7, 5464 (2017).</li><li>Dorn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+nkx2-5+transcriptional+repression+of+isl1+controls+cardiomyocyte+subtype+identity.">Direct nkx2-5 transcriptional repression of isl1 controls cardiomyocyte subtype identity.</a> Stem Cells. 33 (4), 1113-1129 (2015).</li><li>Kaestner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+Encoded+Voltage+Indicators+in+Circulation+Research.">Genetically Encoded Voltage Indicators in Circulation Research.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (9), 21626-21642 (2015).</li></ol>

विधि यहां वर्णित एक विशिष्ट उप प्रकार से ए पी एस के एक ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग (यानी, वेंट्रिकुलर कोशिकाओं की तरह) मानव iPSCs से उत्पंन सीएमएस के सक्षम बनाता है । मानव iPSC-सीएमएस एक उभरते उपकरण के लिए जैविक और च...

Cardiomyocytes (सीएमएस) प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं से व्युत्पंन (iPSCs) हृदय रोग के आणविक तंत्र काटना करने के लिए एक उभरते हुए उपकरण हैं, उपंयास उपचार की जांच करने के लिए, और प्रतिकूल कार्डियक दवा प्रभाव के लिए स्क्रीन1,2 ,3. शुरू से ही सही, channelopathies जैसे arrhythmogenic रोगों इस अनुसंधान क्षेत्र का एक महत्वपूर्ण ध्यान दिया गया है4. नतीजतन, इस तरह के ताल विकारों या कार्रवाई संभावित (एपी) morphologies में परिवर्तन के रूप में सीएमएस के विद्युत phenotypes की जांच करने के लिए तरीके, इस प्रौद्योगिकी के दिल में हैं ।
iPSC के आवेदन में एक महत्वपूर्ण विचार-सीएमएस है कि वर्तमान हृदय भेदभाव प्रोटोकॉल कोशिकाओं की एक समरूप जनसंख्या में परिणाम नहीं है । इसके बजाय, वे नहीं बल्कि परिपक्वता के विभिंन स्तरों पर साइनस नोड, अलिंद, और वेंट्रिकुलर सीएमएस जैसी कोशिकाओं का मिश्रण कर रहे है5,6,7,8। इस विविधता प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता के एक प्रासंगिक स्रोत है, खासकर अगर एपी अवधि (APD) के रूप में मानकों की जांच कर रहे हैं, जो आंतरिक रूप से सेमी उपप्रकार के बीच अलग हो सकता है (जैसे, APD अलिंद में वेंट्रिकुलर सेमी की तुलना में कम है) । पारंपरिक दृष्टिकोण इस समस्या का समाधान करने के लिए एक iPSC-सेमी पैच दबाना विधि का उपयोग कर की जांच करने के लिए और प्रत्येक कक्ष के रूप में वर्गीकृत करने के लिए नोडल-, अलिंद-, या वेंट्रिकुलर की तरह, अपनी एपी आकृति विज्ञान9पर आधारित है । इसके बाद किसी भी विश्लेषण के बाद ब्याज की सेमी उपप्रकार का प्रतिनिधित्व कोशिकाओं को प्रतिबंधित किया जा सकता है । इस रणनीति के प्रमुख दोष अपने सीमित प्रवाह और दरिद्रता की कमी है । इसके अलावा, पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के इनवेसिव प्रकृति क्रमिक रूप से विस्तारित समय अवधि में एक ही कोशिकाओं के इमेजिंग की अनुमति नहीं है ।
यहां, हम एक विधि10 iPSC-सीएमएस के विशिष्ट उपप्रकार में ऑप्टिकली छवि ए पी एस के लिए विकसित पर प्रयोगात्मक विवरण प्रदान करते हैं । यह उपप्रकार विविधता की समस्या पर काबू पा और नाटकीय रूप से पारंपरिक तरीकों की तुलना में प्रवाह बढ़ जाती है, iPSC के तेजी से phenotyping-सीएमएस आनुवंशिक वेरिएंट ले जा रहा है या औषधीय एजेंटों को उजागर की अनुमति ।
उप-प्रकार-विशिष्ट ऑप्टिकल इमेजिंग approach का ओवरव्यू
एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग वोल्टेज संकेतक (GEVI), जिसका प्रतिदीप्ति गुण ध्रुवीकरण और कोशिका झिल्ली के ध्रुवीकरण पर बदल, ऑप्टिकली सेमी की झिल्ली की क्षमता में परिवर्तन की छवि के लिए प्रयोग किया जाता है । यहां लागू GEVI वोल्टेज-संवेदन फ्लोरोसेंट प्रोटीन VSFP-सीआर11, जो एक वोल्टेज-संवेदन transmembrane एक जोड़ी से जुड़े डोमेन के होते है एक हरे (तिपतिया घास) और एक लाल (mRuby2) फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आंकड़ा 1a) । दो fluorophores के करीब निकटता के कारण, उत्तेजना ऊर्जा का एक अंश में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन परिणाम के उत्तेजना Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) के माध्यम से लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन को हस्तांतरित किया जा रहा है । इसलिए, हरे और लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आंकड़ा 1a, ऊपरी पैनल) दोनों से एक उत्सर्जन में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के परिणाम उत्तेजना । जब कोशिका के ध्रुवीकरण, वोल्टेज संवेदक के एक संरचनात्मक rearrangement होता है कि दो फ्लोरोसेंट प्रोटीन के एक अभिविन्यास में तब्दील हो, झल्लाहट दक्षता में वृद्धि. इस प्रकार, उत्तेजना ऊर्जा के और भी लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आंकड़ा 1a, निचले पैनल) के लिए हरी से स्थानांतरित कर रहा है । एक परिणाम के रूप में, एक विध्रुवीय कोशिका में, हरी प्रतिदीप्ति उत्सर्जन dimmer है, और लाल प्रतिदीप्ति उत्सर्जन में एक कोशिका की तुलना में उज्जवल है झिल्ली की क्षमता (आंकड़ा 1b) आराम कर रहा है ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig1.jpg"> चित्रा 1: VSFP-सीआर के साथ झिल्ली क्षमता की ऑप्टिकल इमेजिंग । (क) एक योजनाबद्ध वोल्टेज की कार्रवाई के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट प्रोटीन VSFP-सीआर दर्शाया गया है । कोशिका झिल्ली के ध्रुवीकरण पर, वोल्टेज संवेदन transmembrane डोमेन में एक संरचनात्मक पुनर्स्थापन हरे (GFP) और लाल (आरएफपी) फ्लोरोसेंट प्रोटीन के एक अभिविन्यास में तब्दील हो, intramolecular Förster की क्षमता में वृद्धि अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (झल्लाहट). (ख) शेष झिल्ली क्षमता (ऊपरी पैनल) में और विश्लेषित कोशिकाओं (निचले पैनल) में कोशिकाओं में GFP के उत्तेजना पर एक VSFP के उत्सर्जन स्पेक्ट्रा चित्रित कर रहे हैं । विध्रुवीकरण पर वर्णक्रमीय परिवर्तन स्पष्टता के लिए अतिरंजित है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig1large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
झल्लाहट क्षमता में परिवर्तन झिल्ली क्षमता के उतार चढ़ाव मिरर एक प्रतिदीप्ति एक छवि अलगानेवाला है, जो लाल और हरे प्रतिदीप्ति उत्सर्जन अलग और उंहें दो आसंन क्षेत्रों पर परियोजनाओं के साथ सुसज्जित माइक्रोस्कोप का उपयोग कर imaged रहे है एक sCMOS कैमरा (चित्रा 2) की चिप । इस सेट अप के साथ, दो अलग तरंग दैर्ध्य बैंड पर प्रतिदीप्ति उत्सर्जन एक साथ दर्ज किया जा सकता है, जो एक समय चूक श्रृंखला के हर छवि में झिल्ली की क्षमता को प्रतिबिंबित करने के लिए लाल-से-हरे प्रतिदीप्ति के अनुपात की गणना की अनुमति देता है ।
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig2.jpg"> चित्र 2: इमेजिंग सिस्टम का कॉंफ़िगरेशन । इमेजिंग प्रणाली के प्रमुख घटकों को वोल्टेज के वर्णक्रमीय परिवर्तन के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट प्रोटीन एक उच्च लौकिक संकल्प पर झिल्ली संभावित परिवर्तन मिरर चित्रण किया जाता है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig2large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
सीएमएस में VSFP-सीआर की अभिव्यक्ति lentiviral transduction ने हासिल की है. करने के लिए प्रत्यक्ष अभिव्यक्ति के लिए मुख्यमंत्री के उपप्रकार के हित, lentivirus एक प्रवर्तक तत्व ( MLC2v बढ़ाने) है कि विशेष रूप से वेंट्रिकुलर में प्रतिलेखन ड्राइव-iPSC की तरह-सीएमएस10शामिल हैं । जब iPSC-सीएमएस कि अलिंद की तरह, नोडल की तरह है, और वेंट्रिकुलर की तरह कोशिकाओं के मिश्रण का प्रतिनिधित्व इस lentivirus के साथ transduced हैं, VSFP-सीआर केवल वेंट्रिकुलर की तरह कोशिकाओं में व्यक्त की है । ऑप्टिकल कार्रवाई संभावित इमेजिंग के बाद से इस फ्लोरोसेंट संवेदक पर निर्भर करता है, दर्ज की गई कार्रवाई की क्षमता विशेष रूप से ब्याज की मुख्यमंत्री उपप्रकार का प्रतिनिधित्व (चित्रा 3) ।
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig3.jpg"> चित्र 3: उप-प्रकार-विशिष्ट झिल्ली संभावित इमेजिंग के लिए प्रवर्तक-चालित VSFP व्यंजक । (क) इस योजनाबद्ध कैसे cardiomyocyte उपप्रकार-विशिष्ट ऑप्टिकल कार्रवाई संभावित रिकॉर्डिंग प्राप्त कर रहे है दिखाता है । (ख) iPSC-सीएमएस वेंट्रिकुलर-विशिष्ट MLC2v-बढ़ाने के नियंत्रण में एक VSFP के साथ संक्रमित दिखाया गया है । वोल्टेज सेंसर की अभिव्यक्ति वेंट्रिकुलर में ही मनाया जाता है-GFP चैनल में सीएमएस की तरह (बाएँ पैनल). चरण कंट्रास्ट (मध्य पैनल) और ओवरले इमेज (दायां पैनल) भी दिए गए हैं । सफ़ेद डॉटेड रेखाएं कक्ष सीमाएं चिह्नित करतीं हैं । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig3large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#223;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21331046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS(Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16141079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax-I Supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050061</td>
			<td>alternative L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin bovine plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>Worthington Biochem</td>
			<td>LS004174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine Bromide (Polybrene)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9268</td>
			<td>enhancing lentiviral infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 cm glass-bottom microdishes</td>
			<td>MatTek corporation, Ashland, MA, USA</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stand</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DMI6000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope objective</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td colspan="2">HCX PL APO 63x/1.4-0.6 Oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor Technology, Belfast, UK</td>
			<td>Zyla V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope filter cube: excitation filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA</td>
			<td>ET480/40X</td>
			<td>bandpass 480/40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope filter cube: dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA</td>
			<td>T505lpxr</td>
			<td>longpass 505 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter</td>
			<td>&#160;Cairn Research, Faversham, UK</td>
			<td>OptoSplit II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter filter cube: dichroic mirror</td>
			<td>AHF Analysentechnik GmbH, T&#252;bigen, Germany</td>
			<td>568LPXR</td>
			<td>longpass 568 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter filter cube: emission filter 1 (GFP emission)</td>
			<td>AHF Analysentechnik GmbH, T&#252;bigen, Germany</td>
			<td>520/28 BrightLine HC</td>
			<td>bandpass 520/28 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter filter cube: emission filter 2 (RFP emission)</td>
			<td>AHF Analysentechnik GmbH, T&#252;bigen, Germany</td>
			<td>630/75 ET Bandpass</td>
			<td>bandpass 630/75 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacing inset</td>
			<td>Warner Instruments, Hamden, CT, USA</td>
			<td>RC-37FS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subtype-specific optical action potential recordings in human induced pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes

Cardiomyocytes मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल से उत्पंन (iPSC-सीएमएस) हृदय अनुसंधान में एक उभरते उपकरण हैं । बजाय कोशिकाओं के एक समरूप जनसंख्या जा रहा है, iPSC-सीएमएस वर्तमान भिंनता प्रोटोकॉल द्वारा उत्पंन वेंट्रिकुलर के साथ कोशिकाओं का मिश्रण प्रतिनिधित्व करते हैं, अलिंद-, और phenotypes, जो phenotypic विश्लेषण पेचीदा की तरह नोडल । यहां, एक विधि से ऑप्टिकली रिकॉर्ड कार्रवाई संभावित वेंट्रिकुलर से विशेष रूप से iPSC-सीएमएस की तरह प्रस्तुत किया है । यह एक निर्माण जिसमें एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग वोल्टेज सूचक एक वेंट्रिकुलर-विशिष्ट प्रमोटर तत्व के नियंत्रण में है के साथ lentiviral transduction द्वारा हासिल की है । जब iPSC-सीएमएस इस निर्माण के साथ transduced रहे हैं, वोल्टेज संवेदक विशेष रूप से वेंट्रिकुलर की तरह कोशिकाओं में व्यक्त की है, उपप्रकार-विशिष्ट ऑप्टिकल झिल्ली क्षमता समय चूक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर रिकॉर्डिंग को सक्षम करने से ।

चित्रा 4aमें, एक प्रतिनिधि एकल iPSC-मुख्यमंत्री आरएफपी (बाईं ओर) और GFP (दाईं ओर) चैनल में इमेजिंग विश्लेषण के दौरान खींचा रॉय अंकन सफेद बिंदीदार लाइनों के साथ चित्रित किया है. आरएफपी च?...

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Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes

यहां हम ऑप्टिकली छवि कार्रवाई क्षमता के लिए एक विधि वर्तमान, वेंट्रिकुलर में विशेष रूप से प्रेरित pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पंन cardiomyocytes की तरह । विधि प्रमोटर-एक वोल्टेज के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति संचालित पर आधारित है ।

मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल में उप प्रकार-विशिष्ट ऑप्टिकल कार्रवाई संभावित रिकॉर्डिंग-व्युत्पंन वेंट्रिकुलर Cardiomyocytes

Cardiomyocytes generated from human induced pluripotent stem cells (iPSC-CMs) are an emerging tool in cardiovascular research. Rather than being a ...

प्रेरित Pluripotent स्टेम या आईपीएस कोशिकाओं से उत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स तेजी से हृदय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के क्षेत्र में जैविक सवालों की एक किस्म का जवाब देने के लिए उपयोग किया जाता है । इस तकनीक के मुख्य फायदे यह हैं कि यह थ्रूपुट में नाटकीय वृद्धि के साथ-साथ एक वेंट्रिकुलर विशिष्ट प्रमोटर तत्व का उपयोग करके मायोसाइट्स जैसे वेंट्रिकुलर में उपप्रकार विशिष्ट कार्रवाई संभावित रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है। लेंटीवायरल ट्रांसडक्शन के माध्यम से आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड वोल्टेज सेंसर की शुरूआत मानव-प्रेरित प्लेरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसिटस एक्शन क्षमता की ऑप्टिकल इमेजिंग की अनुमति देती है।एक से एक अनुपात में कार्डियोमायोसाइट रखरखाव माध्यम के साथ लेंटीवायरस युक्त सेल संस्कृति सुपरनेट को मिलाकर शुरू करें। संक्रमण दक्षता बढ़ाने के लिए, 8 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता पर हेक्साइमेथेरिन ब्रोमाइड जोड़ें। और आईपीएस सेल से व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स कल्चर डिश में कार्डियोमायोसाइट मेंटेनेंस मीडियम को इंफेक्शन मीडियम से बदलें।37 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे के लिए संक्रमित कार्डियोमायोसाइट्स संस्कृति, और ताजा कार्डियोमायोसाइट रखरखाव माध्यम के साथ संक्रमण माध्यम की जगह। इमेजिंग से पहले, टाइरोड के समाधान के साथ सेल संस्कृति माध्यम का आदान-प्रदान करें, कैल्शियम के साथ पूरक। फिर कार्डियोमायोसाइट्स को एक इमेजिंग कक्ष में एक उल्टे एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के मंच पर रखें जो एक छवि स्प्लिटर से लैस है।यदि विद्युत पेसिंग की आवश्यकता है, तो इमेजिंग कक्ष में पेसिंग इलेक्ट्रोड स्थापित करें और इलेक्ट्रोड को एक उत्तेजना जनरेटर से कनेक्ट करें। कोशिकाओं को ध्यान में लाएं, और देखने के क्षेत्र के केंद्र में आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड वोल्टेज संकेतक व्यक्त करने वाली कोशिका का पता लगाएं। ऑप्टिकल पथ सेट करें ताकि उत्सर्जित प्रकाश छवि स्प्लिटर में रूट किया जा सके और माइक्रोस्कोप में फ़िल्टर क्यूब को इमेज स्प्लिटर में फिल्टर के साथ संयुक्त करने के लिए स्विच करें।कैमरे को नियंत्रित करने वाले सॉफ्टवेयर में, अधिग्रहण सेटिंग सेट करें ताकि हाई-स्पीड इमेजिंग संभव हो, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार इमेज स्प्लिटर सेट करें। दो अलग-अलग उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य बैंड का प्रतिनिधित्व करने वाली दो छवियां एक दूसरे से सटी होनी चाहिए, प्रत्येक छवि के एक आधे हिस्से पर कब्जा कर रही हैं। कैमरे द्वारा उत्पादित छवि के फोकस को आवश्यक रूप से देखें और समायोजित करें।और रोशनी प्रकाश की चमक को समायोजित करें ताकि पिक्सेल संतृप्ति से बचा जा सके। समय श्रृंखला के अधिग्रहण सेट करें, और माप को प्रभावित करने वाले आवारा प्रकाश से बचने के लिए कमरे में प्रकाश को मंद करें। फिर उत्तेजन प्रकाश शटर खोलें और छवि श्रृंखला के अधिग्रहण को शुरू करें, उचित समय बिंदु पर विद्युत पेसिंग शुरू करें, जैसा कि प्रयोगात्मक रूप से उपयुक्त है।जब अधिग्रहण समाप्त हो जाता है, तो आवश्यक रूप से उत्तेजन प्रकाश शटर बंद करें और रिकॉर्डिंग को हार्ड ड्राइव में सहेजें। फिर, रिकॉर्डिंग सेटिंग को अपरिवर्तित छोड़ते हुए, कोशिकाओं के बिना कवरस्लिप के क्षेत्र पर पृष्ठभूमि रिकॉर्ड करें। ऑप्टिकल झिल्ली संभावित रिकॉर्डिंग के विश्लेषण के लिए, इमेजजे में कोशिकाओं वाले झगड़ा स्टैक खोलें, और लाल चैनल में फ्लोरोसेंट कार्डियोमायोसाइट पर रुचि के क्षेत्र को आकर्षित करने के लिए मुक्त हाथ चयन उपकरण का उपयोग करें, ध्यान रखें कि क्षेत्र काफी बड़ा है कि अनुबंध करते समय सेल क्षेत्र से बाहर नहीं जाएगा।इसके बाद, इस क्षेत्र को रुचि 1 के क्षेत्र के रूप में जोड़ने के लिए विश्लेषण, उपकरण, रुचि प्रबंधक के क्षेत्र का चयन करें और जोड़ें टी का चयन करें। ग्रीन चैनल में एक ही सेल पर ब्याज के क्षेत्र खींचें, और ब्याज 2 के क्षेत्र के रूप में इस क्षेत्र को जोड़ें । विश्लेषण और सेट मापन मेनू के तहत, मतलब ग्रे मूल्य को छोड़कर सभी विकल्पों का चयन न करें।ब्याज प्रबंधक के क्षेत्र में, उपाय सभी स्लाइस और स्लाइस विकल्प प्रति एक पंक्ति का चयन करने के लिए अधिक और बहु उपाय पर क्लिक करें और ठीक क्लिक करें । एक खिड़की तीन पंक्तियों के साथ एक स्प्रेडशीट युक्त खुलेगी। एक कॉमा अलग मूल्य फ़ाइल में स्प्रेडशीट को बचाने के लिए फ़ाइल और सेव के रूप में उपयोग करें। ब्याज प्रबंधक खिड़की के क्षेत्र को बंद किए बिना छवि स्टैक और स्प्रेडशीट विंडो के साथ खिड़की बंद करें, और पृष्ठभूमि माप युक्त झगड़ा स्टैक खोलें।ब्याज प्रबंधक के क्षेत्र में, उपाय सभी स्लाइस और स्लाइस विकल्प प्रति एक पंक्ति का चयन करने के लिए अधिक और बहु उपाय पर क्लिक करें और ठीक क्लिक करें । इसके बाद बैकग्राउंड डाटा को अलग सीएसवी फाइल में सेव करें। यहां, एक प्रतिनिधि एकल आईपीएस सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट को आरएफपी और जीएफपी चैनलों में इमेजिंग विश्लेषण के दौरान तैयार किए गए ब्याज के क्षेत्रों को चिह्नित करने वाली सफेद बिंदीदार रेखाओं के साथ चित्रित किया गया है। आरएफपी चैनल से संकेत झिल्ली क्षमता में परिवर्तन के कारण बढ़ती मजबूर या प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण के कारण प्रत्येक कार्रवाई क्षमता के दौरान फ्लोरोसेंट तीव्रता में आवधिक वृद्धि को दर्शाता है ।कॉनकंटली, जीएफपी सिग्नल फ्लोरोसेंट तीव्रता में आवधिक कमी प्रदर्शित करता है। आरएफपी/जीएफपी अनुपात डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों में उपयोग किया जाने वाला जैविक संकेत है, जैसे कि कार्रवाई संभावित अवधि ५० और ९० माप । उदाहरण के लिए, इस विधि का उपयोग करके, 0.5 हर्ट्ज पर रखे गए आईपीएस सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स जैसे 30 दिन पुराने वेंट्रिकुलर ने 439 मिलीसेकंड की औसत कार्रवाई संभावित अवधि 50 और 520 मिलीसेकंड की एक औसत कार्रवाई संभावित अवधि 90 दिखाई।हर पांच बीट्स में उत्तेजना दरों में वृद्धि पर आईपीएस सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स की विद्युत उत्तेजना, पिटाई दर में वृद्धि के रूप में कार्रवाई की क्षमता के एक प्रगतिशील छोटा प्रदर्शन किया । इसके अलावा, आइसोप्रोटॉनोल के साथ अनायास पिटाई करने वाले आईपीएस सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स के उपचार, एक गैर-चयन बीटा एड्रेनो रिसेप्टर एगोनिस्ट, पिटाई दर में तुरंत वृद्धि हुई, जिसे एगोनिस्ट की बढ़ती खुराक के साथ और बढ़ाया जा सकता है। हालांकि यह विधि शास्त्रीय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल मापों की तुलना में बेहतर थ्रूपुट प्रदान करती है, किसी को अपनी सीमाओं के बारे में पता होना चाहिए, जिसमें एक अस्थायी संकल्प भी शामिल है जो फ्लोरोसेंट वोल्टेज सेंसर के आंतरिक गतिज गुणों द्वारा सीमित है।

Research

JoVE Journal

Biology

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल Transfecting और Nucleofecting

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

लघु अणु प्रेरण के साथ pluripotent मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से मानव कार्डिएक व्यापारियों और cardiomyocytes के कुशल व्युत्पत्ति

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल का चयन और अलग कालोनियों वयस्क Fibroblasts से reprogrammed किया

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (IPSCs) GFP साथ रेट्रोवायरल वैक्टर का उपयोग में दैहिक कोशिकाओं reprogramming

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

और murine अलिंद और Ventricular cardiomyocytes में अलगाव केवी चैनल रिकॉर्डिंग

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

मानव cardiomyocytes की पीढ़ी: फीडर से मुक्त मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल से एक भेदभाव प्रोटोकॉल

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

सेंडाइ वायरस के साथ मानव दैहिक कोशिकाओं से कुशल उत्पादन मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

फ्लो द्वारा उच्च क्षमता cardiomyocytes को मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव और विशेषता

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

वाइब्रेटोम-कट मायोकार्डियल स्लाइस से ह्यूमन वेंट्रिकुलर कार्डियोमायोसाइट्स का अलगाव

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

एकीकृत लाइव-सेल मॉनिटरिंग के साथ मानव प्रेरित प्लेरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कॉर्टिकल और डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन्स का स्वचालित उत्पादन

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...