Name: subtype-specific optical action potential recordings in human induced pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes
Uploaded: 2018-09-27T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da German Research Foundation (Si 1747/1-1), l'altro Kröner-Fresenius-Stiftung e la Deutsche Stiftung für Herzforschung.

1. preparazione di cardiomiociti derivati iPSC per l'Imaging
Nota: Metodi per la differenziazione di cultura e cardiaco iPSC sono apparse prima12,13,14 e non sono discussi qui in dettaglio. La purificazione di iPSC-CMs di microdissection manuale, separazione magnetica delle cellule o selezione di lattato è raccomandata, a seconda del protocollo di differenziazione utilizzato. Per il seguente protocollo...

<ol>
	<li>Sinnecker, D., Laugwitz, K. L., Moretti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+development+and+toxicity+testing.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug development and toxicity testing.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 143 (2), 246-252 (2014).</li><li>Goedel, A., My, I., Sinnecker, D., Moretti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+and+Challenges+of+Pluripotent+Stem+Cells+in+Cardiac+Arrhythmia+Research.">Perspectives and Challenges of Pluripotent Stem Cells in Cardiac Arrhythmia Research.</a> Current Cardiology Reports. 19 (3), 23 (2017).</li><li>Rocchetti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+arrhythmogenic+mechanisms+of+long-QT+syndrome+CALM1-F142L+mutation+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Elucidating arrhythmogenic mechanisms of long-QT syndrome CALM1-F142L mutation in patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cardiovascular Research. 113 (5), 531-541 (2017).</li><li>Sinnecker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+long-QT+syndromes+with+iPS+cells.">Modeling long-QT syndromes with iPS cells.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 6 (1), 31-36 (2013).</li><li>Talkhabi, M., Aghdami, N., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiomyocyte+generation+from+pluripotent+stem+cells:+A+state-of-art.">Human cardiomyocyte generation from pluripotent stem cells: A state-of-art.</a> Life Sciences. , 98-113 (2016).</li><li>Ben-Ari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+electrophysiological+characteristics+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).</li><li>Den Hartogh, S. C., Passier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+Review:+Fluorescent+Reporters+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells:+Contributions+to+Cardiac+Differentiation+and+Their+Applications+in+Cardiac+Disease+and+Toxicity.">Concise Review: Fluorescent Reporters in Human Pluripotent Stem Cells: Contributions to Cardiac Differentiation and Their Applications in Cardiac Disease and Toxicity.</a> Stem Cells. 34 (1), 13-26 (2016).</li><li>Schweizer, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-specific+differentiation+of+cardiac+pacemaker+cell+clusters+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Subtype-specific differentiation of cardiac pacemaker cell clusters from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 229 (2017).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-specific+promoter-driven+action+potential+imaging+for+precise+disease+modelling+and+drug+testing+in+hiPSC-derived+cardiomyocytes.">Subtype-specific promoter-driven action potential imaging for precise disease modelling and drug testing in hiPSC-derived cardiomyocytes.</a> European Heart Journal. 38 (4), 292-301 (2017).</li><li>Lam, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+FRET+dynamic+range+with+bright+green+and+red+fluorescent+proteins.">Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Bhattacharya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes+and+characterization+by+flow+cytometry.">High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).</li><li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+production.">Lentivirus production.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1499 (2009).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Jung, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dantrolene+rescues+arrhythmogenic+RYR2+defect+in+a+patient-specific+stem+cell+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> EMBO Molecular Medicine. 4 (3), 180-191 (2012).</li><li>Lemoine, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+cardiomyocytes+cultured+in+3D+engineered+heart+tissue+show+physiological+upstroke+velocity+and+sodium+current+density.">Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density.</a> Scientific Reports. 7, 5464 (2017).</li><li>Dorn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+nkx2-5+transcriptional+repression+of+isl1+controls+cardiomyocyte+subtype+identity.">Direct nkx2-5 transcriptional repression of isl1 controls cardiomyocyte subtype identity.</a> Stem Cells. 33 (4), 1113-1129 (2015).</li><li>Kaestner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+Encoded+Voltage+Indicators+in+Circulation+Research.">Genetically Encoded Voltage Indicators in Circulation Research.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (9), 21626-21642 (2015).</li></ol>

Il metodo qui descritto consente una registrazione ottica di APs da un sottotipo specifico (cioè, ventricolare-come le cellule) di CMs generato da iPSCs umane. Umano iPSC-CMs sono uno strumento emergente per affrontare una grande varietà di problemi biologici e medici, e la differenziazione di diversi sottotipi di CM è un'importante fonte di variabilità sperimentale. Utilizzando elementi specifici promotore, l'espressione di un GEVI è specificamente realizzato in CMs che rappresenta il sottotipo di interess...

Cardiomiociti (CMs) derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) sono uno strumento emergente di sezionare i meccanismi molecolari di malattia cardiaca, per studiare nuove terapie e allo schermo per avverse cardiache effetti1,2 ,3. Fin dall'inizio, malattie aritmogene quali canalopatie sono stati un fuoco importante di questa ricerca zona4. Di conseguenza, metodi per studiare elettrici fenotipi di CMs, quali aritmie o cambiamenti di morfologie di potenziale di azione (AP), sono il cuore di questa tecnologia.
Una considerazione importante nell'applicazione della iPSC-CMs è che non provochino l'attuale protocolli di differenziamento cardiaco in una popolazione omogenea delle cellule. Invece, sono piuttosto una miscela di cellule che assomigliano al nodo seno atriale e ventricolare CMs a diversi livelli di maturazione5,6,7,8. Questa eterogeneità può essere un'importante fonte di variabilità sperimentale, soprattutto se i parametri come la durata di AP (APD) sono studiati, che intrinsecamente differiscono tra sottotipi di CM (ad es., l'APD è più breve in atriale rispetto a CMs ventricolare). L'approccio convenzionale per affrontare questo problema è indagare singolo iPSC-CMs utilizzando il metodo di patch clamp e classificare ogni cella come nodale-, atriale-, o ventricolare-come, in base alle sue AP morfologia9. Qualsiasi analisi successiva possono essere quindi limitato alle cellule che rappresenta il sottotipo di CM di interesse. Il principale svantaggio di questa strategia è la limitata velocità effettiva e la mancanza di scalabilità. Inoltre, la natura invasiva della patch ed elettrofisiologia morsetto non consente l'imaging delle stesse cellule in sequenza a periodi di tempo estesi.
Qui, forniamo dettagli sperimentali su un metodo10 sviluppato per otticamente immagine APs in sottotipi specifici di iPSC-CMs. Questo supera il problema dell'eterogeneità di sottotipo e aumenta notevolmente la velocità di trasmissione rispetto ai metodi convenzionali, permettendo la rapida fenotipizzazione di iPSC-CMs che trasportano varianti genetiche o essere esposti a farmacologico agenti.
Panoramica dell'approccio imaging ottico sottotipo-specifici
Un indicatore di tensione geneticamente codificato (GEVI), cui proprietà di fluorescenza cambi su depolarizzazione e ripolarizzazione della membrana cellulare, viene utilizzato per immagine otticamente cambiamenti del potenziale di membrana di CMs. La GEVI applicato qui è la proteina fluorescente-rilevamento della tensione VSFP-CR11, che consiste di un dominio transmembrana di rilevamento tensione fuso ad un paio di un verde (trifoglio) e una proteina fluorescente rosso (mRuby2) (Figura 1A). A causa della vicinanza di due fluorophores, l'eccitazione della proteina fluorescente verde risultati in una frazione dell'energia di eccitazione viene trasferito alla proteina fluorescente rossa tramite trasferimento di energia per risonanza (FRET). Di conseguenza, l'eccitazione della proteina fluorescente verde si traduce in un'emissione da sia il verde e il rosse proteine fluorescenti (Figura 1A, pannello superiore). Quando la cella depolarizza, si verifica una riorganizzazione strutturale nel sensore di tensione che si traduce in un riorientamento delle due proteine fluorescenti, aumentando l'efficienza FRET. Così, ancora di più l'energia di eccitazione viene trasferito dal verde alla proteina fluorescente rossa (Figura 1A, pannello inferiore). Di conseguenza, in una cella depolarizzata, l'emissione di fluorescenza verde è dimmer, e l'emissione di fluorescenza rossa è più luminoso in una cella a riposo il potenziale di membrana (Figura 1B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig1.jpg"> Figura 1: imaging ottico della membrana potenziale con VSFP-CR. (A), A schema raffigurante l'azione della proteina fluorescente tensione sensibile CHE VSFP-CR è indicato. Al momento la depolarizzazione della membrana cellulare, una riorganizzazione strutturale nel dominio del transmembrane-rilevamento della tensione si traduce in un riorientamento del verde (GFP) e rossa proteina fluorescente (RFP), aumentando l'efficienza del Förster intramolecolare trasferimento di energia per risonanza (FRET). Sono raffigurati gli spettri (B) l'emissione di un VSFP all'eccitazione della GFP in cellule presso il potenziale di membrana di riposo (pannello superiore) e in cellule depolarizzate (pannello inferiore). Il cambiamento spettrale su depolarizzazione è esagerato per chiarezza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Le modifiche dell'efficienza della FRET mirroring le fluttuazioni del potenziale di membrana sono Imaging utilizzando un microscopio a fluorescenza equipaggiato con un'immagine splitter, che separa le emissioni di fluorescenza rossa e verde e li proietta su due zone adiacenti di il chip di una fotocamera sCMOS (Figura 2). Con questo set-up, l'emissione di fluorescenza a due bande di lunghezza d'onda differente possa essere registrato simultaneamente, che permette il calcolo di un rapporto di fluorescenza rosso-verde in modo da riflettere il potenziale in ogni immagine di una serie di time-lapse di membrana.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig2.jpg"> Figura 2: configurazione del sistema di imaging. I componenti principali del sistema di imaging utilizzata per immagine sono raffigurati i cambiamenti spettrali della proteina fluorescente tensione-sensibili del mirroring i cambiamenti di potenziale di membrana ad alta risoluzione temporale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
L'espressione di VSFP-CR in CMs è raggiunto attraverso la trasduzione lentivirale. Per indirizzare l'espressione per il sottotipo di CM di interesse, il lentivirus contiene un elemento di promotore (il rinforzatore di MLC2v ) che spinge in particolare trascrizione in ventricolare-come iPSC-CMs10. Quando l'iPSC-CMs che rappresentano una miscela di cellule simil-atriale, nodale-come e ventricolare-come vengono trasdotti con questo lentivirus, VSFP-CR è espressa solo nelle cellule simil-ventricolare. Poiché l'imaging ottico potenziale d'azione dipende da questo sensore fluorescente, i potenziali di azione registrati rappresentano esclusivamente il sottotipo di CM di interesse (Figura 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig3.jpg"> Figura 3: espressione del promotore-driven VSFP per l'imaging di potenziali di membrana sottotipo-specifici. (un) questo schema Mostra come sono realizzate le registrazioni di potenziale di azione ottica sottotipo-specifici del cardiomyocyte. (b) iPSC-CMs infettato da un VSFP sotto il controllo della ventricolare specifiche MLC2v-enhancer sono mostrati. L'espressione nel sensore di tensione è osservata solo in ventricolare-come CMs nel canale GFP (pannello di sinistra). A vostra disposizione anche il contrasto di fase (pannello centrale) e l'immagine di sovrapposizione (pannello di destra). Le linee bianche tratteggiate segnano confini delle cellule. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#223;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21331046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS(Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16141079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax-I Supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050061</td>
			<td>alternative L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin bovine plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>Worthington Biochem</td>
			<td>LS004174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine Bromide (Polybrene)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9268</td>
			<td>enhancing lentiviral infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 cm glass-bottom microdishes</td>
			<td>MatTek corporation, Ashland, MA, USA</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stand</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DMI6000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope objective</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td colspan="2">HCX PL APO 63x/1.4-0.6 Oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor Technology, Belfast, UK</td>
			<td>Zyla V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope filter cube: excitation filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA</td>
			<td>ET480/40X</td>
			<td>bandpass 480/40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope filter cube: dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA</td>
			<td>T505lpxr</td>
			<td>longpass 505 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter</td>
			<td>&#160;Cairn Research, Faversham, UK</td>
			<td>OptoSplit II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter filter cube: dichroic mirror</td>
			<td>AHF Analysentechnik GmbH, T&#252;bigen, Germany</td>
			<td>568LPXR</td>
			<td>longpass 568 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter filter cube: emission filter 1 (GFP emission)</td>
			<td>AHF Analysentechnik GmbH, T&#252;bigen, Germany</td>
			<td>520/28 BrightLine HC</td>
			<td>bandpass 520/28 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter filter cube: emission filter 2 (RFP emission)</td>
			<td>AHF Analysentechnik GmbH, T&#252;bigen, Germany</td>
			<td>630/75 ET Bandpass</td>
			<td>bandpass 630/75 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacing inset</td>
			<td>Warner Instruments, Hamden, CT, USA</td>
			<td>RC-37FS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subtype-specific optical action potential recordings in human induced pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes

Cardiomiociti generati dalle cellule staminali umane pluripotenti indotte (iPSC-CMs) sono uno strumento emergente nella ricerca cardiovascolare. Piuttosto che essere una popolazione omogenea delle cellule, l'iPSC-CMs generati da protocolli correnti di differenziazione rappresentano una miscela delle cellule con ventricolare-, atriale-e fenotipi nodale-like, che complica l'analisi fenotipiche. Qui, un metodo per registrare otticamente i potenziali di azione in particolare da ventricolare-come iPSC-CMs è presentato. Questo si ottiene attraverso la trasduzione lentivirale con un costrutto in cui un indicatore di tensione geneticamente codificato è sotto il controllo di un elemento promotore ventricolare-specifico. Quando iPSC-CMs vengono trasdotti con questo costrutto, il sensore di tensione è espresso esclusivamente in ventricolare-come le cellule, che permette registrazioni potenziali di membrana ottico sottotipo-specifici utilizzando la microscopia a fluorescenza time-lapse.

In Figura 4a, un singolo rappresentante iPSC-CM è raffigurato con le linee bianche tratteggiate marcatura il ROI disegnato durante l'analisi di imaging RFP (lato sinistro) e il canale GFP (lato destro). Il segnale dal canale RFP Mostra un aumento periodico intensità fluorescente durante ogni potenziale di azione (Figura 4b, pannello superiore). Come descritto nell'introduzione, questo è a causa di un crescente apprensione caus...

Watch this Scientific Journal Video about Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes at JoVE.com

Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes

Qui presentiamo un metodo per immagine otticamente i potenziali di azione, in particolare in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte ventricolare-come. Il metodo si basa sull'espressione di una proteina fluorescente tensione sensibile promotore-driven.

Registrazioni di potenziale di azione ottica sottotipo-specifici in essere umano indotto Cardiomyocytes ventricolari derivati da cellule staminali di Pluripotent

Cardiomyocytes generated from human induced pluripotent stem cells (iPSC-CMs) are an emerging tool in cardiovascular research. Rather than being a ...

I cardiomiociti generati da cellule staminali pluripotenti indotte o IPS sono sempre più utilizzati per rispondere a una varietà di domande biologiche nel campo dell'elettrofisiologia cardiaca. I principali vantaggi di questa tecnologia sono che consente un drammatico aumento della produttività e registrazioni potenziali di azione specifiche del sottotipo in ventricolari come miociti, utilizzando un elemento promotore specifico ventricolare. L'introduzione di sensori di tensione geneticamente codificati attraverso la trasduzione lentivirale consente l'imaging ottico di potenziali d'azione cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo.Inizia mescolando il supernatante di coltura cellulare contenente lentivirus con un mezzo di mantenimento dei cardiomiociti, con un rapporto uno a uno. Aggiungere bromuro di esadimetherine a una concentrazione finale di 8 microgrammi per millilitro, per migliorare l'efficienza dell'infezione. E sostituire il mezzo di mantenimento dei cardiomiociti nel piatto di coltura di cardiomiociti derivato dalle cellule IPS, con il mezzo di infezione.Coltura i cardiomiociti infetti per 12 ore a 37 gradi Celsius e sostituire il mezzo di infezione con un mezzo di mantenimento cardiomiocitario fresco. Prima dell'imaging, scambiare il mezzo di coltura cellulare con la soluzione di Tyrode, integrata con calcio. Quindi posizionare i cardiomiociti in una camera di imaging sul palco di un microscopio a epifluorescenza invertito dotato di uno splitter di immagini.Se è necessaria la stimolazione elettrica, installare elettrodi di stimolazione nella camera di imaging e collegare gli elettrodi a un generatore di stimolo. Mettere a fuoco le cellule e individuare una cellula che esprima l'indicatore di tensione geneticamente codificato al centro del campo visivo. Impostare il percorso ottico in modo che la luce emessa venga instradata allo splitter dell'immagine e passare al cubo del filtro al microscopio su quello da combinate con i filtri nello splitter dell'immagine.Nel software che controlla la fotocamera, impostare l'impostazione di acquisizione in modo che sia possibile l'imaging ad alta velocità e impostare lo splitter dell'immagine secondo le istruzioni del produttore. Le due immagini che rappresentano le due diverse bande di lunghezza d'onda di emissione dovrebbero essere adiacenti l'una all'altra, ognuna delle quali occupa la metà dell'immagine. Controllare e regolare la messa a fuoco dell'immagine prodotta dalla fotocamera in base alle esigenze.E regolare la luminosità della luce di illuminazione in modo da evitare la saturazione dei pixel. Impostare l'acquisizione delle serie temporali e ammazzare la luce nella stanza per evitare che la luce vagante influenzi la misurazione. Quindi aprire l'otturatore luminoso di eccitazione e iniziare l'acquisizione della serie di immagini, avviando il ritmo elettrico nel momento appropriato, come sperimentalmente appropriato.Al termine dell'acquisizione, chiudere l'otturatore della luce di eccitazione in base alle esigenze e salvare la registrazione sul disco rigido. Quindi, lasciando invariata l'impostazione di registrazione, registrare lo sfondo su un'area del coverslip senza celle. Per l'analisi delle registrazioni potenziali della membrana ottica, aprire la pila di tiff contenente le cellule in ImageJ e utilizzare lo strumento di selezione a mano libera per disegnare una regione di interesse su un cardiomiocita fluorescente, nel canale rosso, facendo attenzione che l'area sia abbastanza grande da non spostarsi fuori dalla regione mentre si contrae.Selezionare Analizza, Strumenti, Gestione area di interesse e Aggiungi T per aggiungere l'area come area di interesse 1. Trascinare l'area di interesse sulla stessa cella nel canale verde e aggiungere questa area come Area di interesse 2. Nei menu Analizza e imposta misure deselezionate tutte le opzioni ad eccezione del valore grigio medio.In Gestione area di interesse fare clic su Altro e misura multima misura per selezionare le opzioni Misura tutte le sezioni e Una riga per sezione e fare clic su OK. Si aprirà una finestra contenente un foglio di calcolo con le tre righe. Utilizzare File e Salva con nome per salvare il foglio di calcolo in un file di valori separato da virgole. Chiudere la finestra con lo stack di immagini e la finestra del foglio di calcolo senza chiudere la finestra Gestione area di interesse e aprire lo stack di tiff contenente la misurazione in background.In Gestione area di interesse fare clic sulle opzioni Altro e Misura multima misura per selezionare le opzioni Misura tutte le sezioni e Una riga per sezione e fare clic su OK. Quindi salvare i dati in background in un file CSV separato. Qui, viene raffigurato un singolo cardiomiocita derivato dalle cellule IPS rappresentativo con le linee tratteggiate bianche che segnano le regioni di interesse, disegnate durante l'analisi di imaging nei canali RFP e GFP. Il segnale proveniente dal canale RFP mostra un aumento periodico dell'intensità fluorescente durante ogni potenziale d'azione a causa di un crescente trasferimento forzato o di energia di risonanza causato da cambiamenti nel potenziale della membrana.Concordemente, il segnale GFP mostra una diminuzione periodica dell'intensità fluorescente. Il rapporto RFP/GFP è il segnale biologico utilizzato nelle analisi a valle, come la durata potenziale d'azione 50 e 90 misurazioni. Ad esempio, utilizzando questo metodo, i cardiomiociti derivati dalle cellule IPS di 30 giorni, posizionati a 0,5 Hertz, hanno mostrato una durata potenziale di azione media di 50 di 439 millisecondi e una durata potenziale di azione media 90 di 520 millisecondi.La stimolazione elettrica dei cardiomiociti derivati dalle cellule IPS ad aumentare i tassi di stimolazione ogni cinque battiti, ha dimostrato un progressivo accorciamento dei potenziali d'azione con l'aumento del tasso di battitura. Inoltre, il trattamento dei cardiomiociti derivati dalle cellule IPS che battono spontaneamente con isoproternolo, un agonista nonselective del recettore beta adreno, ha portato a un rapido aumento del tasso di battimento, che potrebbe essere ulteriormente aumentato con l'aumento delle dosi dell'agonista. Mentre questo metodo fornisce una produttività superiore rispetto alle misurazioni elettrofisiologiche classiche, bisogna essere consapevoli dei suoi limiti, inclusa una risoluzione temporale limitata dalle proprietà cinetiche intrinseche del sensore di tensione fluorescente.

Research

JoVE Journal

Biology

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Trasfettando e Nucleofecting umani cellule staminali pluripotenti indotte

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Ricerca

Biologia

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Derivazione efficiente dei diritti dell&#39;uomo e precursori cardiaci e cardiomiociti pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Selezione e isolamento di colonie di cellule pluripotenti indotte umane staminali riprogrammato da fibroblasti adulti

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Riprogrammare cellule somatiche umane in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) Utilizzo vettore retrovirale con GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

Isolamento e registrazioni dei canali Kv in cardiomiociti murini atriale e ventricolare

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generazione di cardiomiociti umani: Un protocollo di differenziazione da alimentatore-Free umani cellule staminali pluripotenti indotte

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Efficiente generazione indotta umane pluripotenti cellule staminali da cellule somatiche umane con Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

Alta efficienza differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane di cardiomiociti e Caratterizzazione mediante citometria di flusso

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

Isolamento dei cardiomiociti ventricolari umani dalle fette miocardici Vibratome-Cut

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

Produzione automatizzata di neuroni corticali e dopaminergici pluripotenti indotti dall'uomo con monitoraggio integrato delle cellule vive

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...