Name: subtype-specific optical action potential recordings in human induced pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes
Uploaded: 2018-09-27T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes at JoVE.com

이 작품은 독일 연구 재단 (Si 1747/1-1), 다른 Kröner-Fresenius-재단, 그리고 도이치 재단에 Herzforschung에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

1. 이미징 iPSC 파생 Cardiomyocytes의 준비
참고: iPSC 문화와 심장 차별화 방법12,,1314 전에 게시 된 고 여기 자세하게에서 논의 하지 않습니다. 수동 서, 자석 세포 별거, 또는 젖 산 선택 iPSC-CMs의 정화 것이 좋습니다, 분화 프로토콜 사용에 따라. 다음 프로토콜에 대 한 지역, 생성 된 구타에서 microdissected explants 단?...

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	<li>Sinnecker, D., Laugwitz, K. L., Moretti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+development+and+toxicity+testing.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug development and toxicity testing.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 143 (2), 246-252 (2014).</li><li>Goedel, A., My, I., Sinnecker, D., Moretti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+and+Challenges+of+Pluripotent+Stem+Cells+in+Cardiac+Arrhythmia+Research.">Perspectives and Challenges of Pluripotent Stem Cells in Cardiac Arrhythmia Research.</a> Current Cardiology Reports. 19 (3), 23 (2017).</li><li>Rocchetti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+arrhythmogenic+mechanisms+of+long-QT+syndrome+CALM1-F142L+mutation+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Elucidating arrhythmogenic mechanisms of long-QT syndrome CALM1-F142L mutation in patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cardiovascular Research. 113 (5), 531-541 (2017).</li><li>Sinnecker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+long-QT+syndromes+with+iPS+cells.">Modeling long-QT syndromes with iPS cells.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 6 (1), 31-36 (2013).</li><li>Talkhabi, M., Aghdami, N., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiomyocyte+generation+from+pluripotent+stem+cells:+A+state-of-art.">Human cardiomyocyte generation from pluripotent stem cells: A state-of-art.</a> Life Sciences. , 98-113 (2016).</li><li>Ben-Ari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+electrophysiological+characteristics+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).</li><li>Den Hartogh, S. C., Passier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+Review:+Fluorescent+Reporters+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells:+Contributions+to+Cardiac+Differentiation+and+Their+Applications+in+Cardiac+Disease+and+Toxicity.">Concise Review: Fluorescent Reporters in Human Pluripotent Stem Cells: Contributions to Cardiac Differentiation and Their Applications in Cardiac Disease and Toxicity.</a> Stem Cells. 34 (1), 13-26 (2016).</li><li>Schweizer, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-specific+differentiation+of+cardiac+pacemaker+cell+clusters+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Subtype-specific differentiation of cardiac pacemaker cell clusters from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 229 (2017).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-specific+promoter-driven+action+potential+imaging+for+precise+disease+modelling+and+drug+testing+in+hiPSC-derived+cardiomyocytes.">Subtype-specific promoter-driven action potential imaging for precise disease modelling and drug testing in hiPSC-derived cardiomyocytes.</a> European Heart Journal. 38 (4), 292-301 (2017).</li><li>Lam, A. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Bhattacharya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes+and+characterization+by+flow+cytometry.">High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).</li><li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+production.">Lentivirus production.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1499 (2009).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Jung, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dantrolene+rescues+arrhythmogenic+RYR2+defect+in+a+patient-specific+stem+cell+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> EMBO Molecular Medicine. 4 (3), 180-191 (2012).</li><li>Lemoine, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+cardiomyocytes+cultured+in+3D+engineered+heart+tissue+show+physiological+upstroke+velocity+and+sodium+current+density.">Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density.</a> Scientific Reports. 7, 5464 (2017).</li><li>Dorn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+nkx2-5+transcriptional+repression+of+isl1+controls+cardiomyocyte+subtype+identity.">Direct nkx2-5 transcriptional repression of isl1 controls cardiomyocyte subtype identity.</a> Stem Cells. 33 (4), 1113-1129 (2015).</li><li>Kaestner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+Encoded+Voltage+Indicators+in+Circulation+Research.">Genetically Encoded Voltage Indicators in Circulation Research.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (9), 21626-21642 (2015).</li></ol>

여기 설명 하는 방법을 인간의 Ipsc에서 생성 하는 CMs의 특정 하위 (즉, 같은 심 실 세포)에서 Ap의 광학 기록 수 있습니다. 인간의 iPSC-CMs는 거 대 한 다양 한 생물학과 의료 문제를 해결 하기 위해 새로운 도구 이며 다른 CM 하위 형식에 차별화 실험적인 다양성의 중요 한 소스. 특정 발기인 요소를 사용 하 여는 GEVI의 식 CMs에 관심, 하위를 나타내는 있는 광학 이미지 다음에 구체적으로 달성 된...

유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)에서 파생 된 Cardiomyocytes (CMs)는 불리 한 심장 약물 효과1,2 에 대 한 분자 메커니즘의 심장 질환, 비 발한 요법을 조사 하 고 화면을 해 부하는 신흥 도구 3. 바로 처음부터, channelopathies 같은 arrhythmogenic 질병이 연구4의 중요 한 초점 되었습니다. 따라서, 부정맥 또는 활동 전위 (AP) 형태학 변화 같은 CMs의 전기 고기를 조사 하는 방법이이 기술의 마음에 있습니다.
IPSC CMs의 응용 프로그램에서 중요 한 고려 사항이입니다 셀의 균질 성 인구 현재 심장 차별화 프로토콜 발생 하지 않습니다. 대신, 그들은 오히려 셀 닮은 공동 노드, 심 방, 심 실 CMs 성숙5,6,,78의 서로 다른 수준에서의 혼합물. 이 관련 소스 수 실험 가변성의 AP 기간 (APD) 같은 매개 변수를 조사 하는 경우에 특히는 본질적으로 다릅니다 CM 하위 (예를 들어, APD는 짧은 심 실 CMs에 보다 심 방). 이 문제를 해결 하기 위해 기존의 접근 방법과 패치 클램프 메서드를 사용 하 여 단일 iPSC-CMs를 조사 하 고 각 셀에 꾸벅꾸벅 졸 기를 분류 하는-, 심 방-, 또는 심 실 같은, 그것의 AP 형태9에 따라. 모든 후속 분석 관심의 CM 하위 나타내는 셀에 다음 제한 될 수 있습니다. 이 전략의 주요 결점은 그것의 한정 된 처리량과 확장성의 부족. 또한, 패치 클램프 전기 생리학의 침략 적인 본질 순차적으로 확장 된 기간 동안 동일한 셀의 이미지를 허용 하지 않습니다.
여기, 우리는 방법10 광학 iPSC CMs의 특정 하위에 Ap의 이미지를 개발에 실험 정보를 제공 합니다. 이 하위가 문제를 극복 하 고 극적으로 iPSC-CMs 유전 이체를 운반 하거나 약물에 노출 된 에이전트의 급속 한 형질을 허용 하는 기존의 방법에 비해 처리량을 증가 시킵니다.
하위 형식 관련 광학 이미징 접근 방법의 개요
도발은와 세포 막의 repolarization 형광 속성 변경, 유전자 인코딩 전압 표시기 (GEVI), CMs의 막 잠재력의 변화를 광학 이미지에 사용 됩니다. 여기에 적용 하는 GEVI은 전압 감지 형광 단백질 VSFP CR11, 전압 감지 막 횡단 도메인 융합 그린 (클로버)와 레드 (mRuby2) 형광 성 단백질 (그림 1A)의 쌍을 이루어져 있는. 두 fluorophores의 근접 때문에 녹색 형광 단백질의 여기 여기 에너지는 빨간색 형광 단백질을 통해 포스터 공명 에너지 전달 (무서 워)에 전송 되 고의 결과. 따라서, 녹색 형광 단백질의 여기 모두 녹색과 적색 형광 단백질 (그림 1A, 상단 패널)에서 방출에 발생합니다. 셀 depolarizes, 전압 센서의 구조 재편 무서 워 효율성 두 가지 형광 단백질의 재교육으로 변환 하는 발생 합니다. 따라서, 여기 에너지의 더 많은 전송 됩니다 녹색에서 빨간색 형광 단백질 (그림 1A, 하단 패널). 그 결과, depolarized 셀에 녹색 형광 방출 주차, 이며 휴식 막 잠재적인 (그림 1B)에 셀에 빨간색 형광 방출은 보다 밝은.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig1.jpg"> 그림 1: VSFP cr.와 막의 광학 영상 VSFP CR 표시 전압에 민감한 형광 단백질의 행동을 묘사 하는 (A) A 회로도 세포 막의 도발은 시 전압 감지 막 횡단 도메인 구조 재편 (GFP) 녹색과 빨간색 (RFP) 형광 단백질, intramolecular 포스터의 효율성 증가의 재교육으로 변환 공명 에너지 전달 (무서 워) 휴식 막 잠재력 (위 패널)에서 셀에 및 depolarized 셀 (하단 패널)에 GFP의 구동 시 VSFP의 (B) 방출 스펙트럼 묘사 된다. 도발은 시 스펙트럼 변화 명확성을 위해 과장 이다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
막 잠재력의 변동 미러링 무서 워 효율에서 변화는 빨간색과 녹색 형광 방출 분리 하 고 그들의 2 개의 인접 한 지역에 프로젝트는 이미지 스플리터 장착 형광 현미경을 사용 하 여 몇 군데 sCMOS 카메라 (그림 2)의 칩 했다. 이 설정으로 2 개의 다른 파장 악대에서 형광 방출 기록 될 수 동시에, 빨강-녹색 형광 막 잠재적인 시간 경과 시리즈의 모든 이미지에 맞게 비율의 계산을 허용 하.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig2.jpg"> 그림 2: 이미징 시스템의 구성. 이미징 시스템의 주요 구성 요소는 높은 시간 해상도에서 막 잠재적인 변화를 미러링 전압에 민감한 형광 단백질의 스펙트럼 변화를 묘사 하는 이미지를 사용. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
VSFP-CR CMs의 식 lentiviral 변환 함으로써 이루어집니다. 관심의 CM 하위 식을 직접 lentivirus는 특히 심 실 같은 iPSC-CMs10전사를 드라이브 하는 발기인 요소 ( MLC2v enhancer)를 포함 합니다. 심 방 같은, 꾸벅꾸벅 졸 기 같은와 같은 심 실 세포의 혼합물을 나타내는 iPSC-CMs는이 lentivirus 함께 불리고, VSFP CR 심 실 같은 셀에만 표시 됩니다. 광학 활동 전위 이미징이 형광 센서에 따라, 이후 기록 된 활동 전위는 독점적으로 관심 (그림 3)의 CM 하위 유형을 나타냅니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig3.jpg"> 그림 3: 하위 형식 관련 막 잠재적인 이미징 발기인 구동 VSFP 식. (한)이이 회로도 cardiomyocyte 하위 형식 관련 광학 활동 전위 기록 달성 하는 방법을 보여 줍니다. (b) iPSC-CMs 심 실 전용 MLC2v-증강의 통제는 VSFP에 감염 표시 됩니다. 전압 센서의 식 GFP 채널 (왼쪽된 패널)에서 심 실 같은 CMs에만 관찰 된다. 오버레이 이미지 (오른쪽 패널) 및 위상 대비 (중간 패널)도 제공 됩니다. 흰색 점선 셀 경계를 표시합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#223;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21331046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS(Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16141079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax-I Supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050061</td>
			<td>alternative L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin bovine plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>Worthington Biochem</td>
			<td>LS004174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine Bromide (Polybrene)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9268</td>
			<td>enhancing lentiviral infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 cm glass-bottom microdishes</td>
			<td>MatTek corporation, Ashland, MA, USA</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stand</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DMI6000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope objective</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td colspan="2">HCX PL APO 63x/1.4-0.6 Oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor Technology, Belfast, UK</td>
			<td>Zyla V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope filter cube: excitation filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA</td>
			<td>ET480/40X</td>
			<td>bandpass 480/40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope filter cube: dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA</td>
			<td>T505lpxr</td>
			<td>longpass 505 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter</td>
			<td>&#160;Cairn Research, Faversham, UK</td>
			<td>OptoSplit II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter filter cube: dichroic mirror</td>
			<td>AHF Analysentechnik GmbH, T&#252;bigen, Germany</td>
			<td>568LPXR</td>
			<td>longpass 568 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter filter cube: emission filter 1 (GFP emission)</td>
			<td>AHF Analysentechnik GmbH, T&#252;bigen, Germany</td>
			<td>520/28 BrightLine HC</td>
			<td>bandpass 520/28 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter filter cube: emission filter 2 (RFP emission)</td>
			<td>AHF Analysentechnik GmbH, T&#252;bigen, Germany</td>
			<td>630/75 ET Bandpass</td>
			<td>bandpass 630/75 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacing inset</td>
			<td>Warner Instruments, Hamden, CT, USA</td>
			<td>RC-37FS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subtype-specific optical action potential recordings in human induced pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes

Cardiomyocytes 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSC-CMs)에서 생성 된 심혈 관 연구에 새로운 도구입니다. 셀의 균질 성 인구 되 고, 보다는 오히려 현재 분화 프로토콜에 의해 생성 된 iPSC CMs 대표 심 실 세포의 혼합-, 심 방-, 및 phenotypic 분석을 복잡 하 게 꾸벅꾸벅 졸 기 같은 고기. 여기, 특히 심 실 같은 iPSC-CMs에서에서 광학 기록 활동 전위 하는 방법을 제시 합니다. 이는 유전자 인코딩 전압 표시기가 심 실 특정 발기인 요소의 제어 구조와 lentiviral 변환에 의해 달성 된다. IPSC-CMs는이 구문으로 불리고 때 하위 특정 광 막 잠재적인 녹음 시간 경과 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 사용 전압 센서 심 실 같은 셀에 독점적으로 표현 된다.

그림 4a에서 대표 단일 iPSC CM RFP (왼쪽)와 GFP (오른쪽) 채널에서 이미징 분석 하는 동안 그린 투자 수익을 표시 하얀 점선으로 그려져 있습니다. RFP 채널에서 신호 (그림 4b, 상단 패널) 각 활동 전위 동안 형광 강도 주기적 증가 보여줍니다. 소개에 설명 된 대로 이것은 잠재적인 막 (그림 1)에 있는 변화에 기?...

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Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes

여기 우리는 특히 심 실 같은 유도 만능 줄기 세포 유래 cardiomyocytes에에서 광학 이미지 활동 전위, 하는 방법을 제시. 메서드를 사용 하면 전압에 민감한 형광 단백질의 발기인 기반 식을 기반으로 합니다.

하위 형식 관련 광학 활동 전위 녹음 인간의 유도 만능 줄기 세포 유래 심 실 Cardiomyocytes

Cardiomyocytes generated from human induced pluripotent stem cells (iPSC-CMs) are an emerging tool in cardiovascular research. Rather than being a ...

유도 만능 줄기 또는 IPS 세포에서 생성된 심근세포는 점점 심장 전기 생리학 분야에서 다양한 생물학적 질문에 대답하기 위해 사용된다. 이 기술의 주요 장점은 심실 특정 프로모터 요소를 사용하여 심근 세포와 같은 심실의 특수 작업 잠재적 기록뿐만 아니라 처리량의 극적인 증가를 허용한다는 것입니다. 렌티바이러스 트랜스듀션을 통해 유전자로 인코딩된 전압 센서의 도입은 인간 유도만능 줄기 세포-유래 심근세포 작용 잠재력을 광학적으로 이미징할 수 있게 해줍니다.렌즈피바이러스함유 세포배양상과 심근세포 유지보수 배지를 1대 1비율로 혼합하여 시작한다. 감염 효율을 향상시키기 위해 밀리리터 당 8 마이크로 그램의 최종 농도에서 헥사디메헤린 브로마이드를 추가하십시오. 그리고 IPS 세포 유래 심근세포 배양 접시에서 심근세포 유지 배지를 감염 배지로 대체한다.감염된 심근낭을 섭씨 37도에서 12시간 동안 배양하고, 감염 배지를 신선한 심근세포 유지 보수 매체로 대체한다. 이미징 전에 세포 배양 배지를 티로드의 용액으로 교환하여 칼슘으로 보충합니다. 그런 다음 심근세포는 화상 스플리터를 장착한 반전된 형광 현미경의 단계에 화상 진찰실에 놓습니다.전기 적 속도 조정이 필요한 경우 이미징 챔버에 속도 전극을 설치하고 전극을 자극 발생기에 연결합니다. 세포를 초점으로 가져오고, 시야의 중앙에 유전으로 인코딩된 전압 표시기를 표현하는 세포를 찾습니다. 방출된 빛이 영상 스플리터로 라우팅되도록 광학 경로를 설정하고 현미경의 필터 큐브를 이미지 스플리터의 필터와 결합하도록 전환합니다.카메라를 제어하는 소프트웨어에서 고속 이미징이 가능하도록 획득 설정을 설정하고 제조업체의 지침에 따라 이미지 스플리터를 설정합니다. 두 개의 서로 다른 방출 파장 밴드를 나타내는 두 이미지는 서로 인접해야 하며, 각각 이미지의 절반을 차지합니다. 필요에 따라 카메라에서 생성한 이미지의 초점을 확인하고 조정합니다.그리고 픽셀 채도를 피할 수 있도록 조명 광의 밝기를 조정합니다. 타임 시리즈의 획득을 설정하고, 측정에 영향을 미치는 길잃은 빛을 피하기 위해 방에 빛을 어둡게. 그런 다음 흥분 라이트 셔터를 열고 이미지 시리즈의 수집을 시작하여 실험적으로 적절하다면 적절한 시점에서 전기 적 속도를 시작합니다.획득이 완료되면 필요에 따라 여기 라이트 셔터를 닫고 기록을 하드 드라이브에 저장합니다. 그런 다음 기록 설정을 변경하지 않고 셀없이 커버 슬립 영역을 통해 배경을 기록합니다. 광학 멤브레인 전위 기록의 분석을 위해, ImageJ에서 세포를 포함하는 티프 스택을 열고, 자유 손 선택 도구를 사용하여 형광 심근세포에 대한 관심 영역을 그릴 수 있으며, 적색 채널에서는, 영역이 수축하는 동안 영역이 영역밖으로 이동하지 않을 정도로 충분히 크다는 것을 주의한다.다음으로 분석, 도구, 관심 영역 관리자를 선택하고 T 추가를 선택하여 이 지역을 관심 영역 1로 추가합니다. 관심 영역을 녹색 채널의 동일한 셀 위에 드래그하고 이 영역을 관심 영역 2로 추가합니다. 측정 분석 및 설정 메뉴에서 평균 회색 값을 제외한 모든 옵션을 선택 취소합니다.관심 영역 관리자에서 더 많은 및 다중 측정값을 클릭하여 슬라이스 옵션당 모든 조각과 행 1개를 측정하고 확인을 클릭합니다. 세 개의 행이 있는 스프레드시트가 포함된 창이 열립니다. 파일 및 저장 As를 사용하여 스프레드시트를 쉼표 분리된 값 파일에 저장합니다. 관심 영역 관리자 창을 닫지 않고 이미지 스택및 스프레드시트 창으로 창을 닫고 백그라운드 측정이 포함된 티프 스택을 엽니다.관심 영역 관리자에서 더 많은 측정값과 다중 측정값을 클릭하여 슬라이스 옵션당 모든 조각 및 행 1개를 측정하고 확인을 클릭합니다. 그런 다음 배경 데이터를 별도의 csv 파일에 저장합니다. 여기서, 대표적인 단일 IPS 세포 유래 심근세포는 RFP 및 GFP 채널에서 이미징 분석 중에 그려진 관심 영역을 표시하는 백색 점선으로 묘사된다. RFP 채널의 신호는 멤브레인 전위의 변화로 인한 강제 또는 공명 에너지 전달증가로 인한 각 작업 전위 동안 형광 강도의 주기적인 증가를 보여줍니다.GFP 신호는 형광 강도의 주기적인 감소를 나타낸다. RFP/GFP 비율은 동작 잠재력 지속시간 50 및 90 측정과 같은 다운스트림 분석에 사용되는 생물학적 신호입니다. 예를 들어,이 방법을 사용하여 0.5 Hertz에 배치 된 IPS 세포 유래 심근 세포와 같은 30 일 된 심실, 평균 작용 전위 지속 시간 50 의 439 밀리 초, 및 평균 작업 지속 전위 90 의 520 밀리 초.IPS 세포 유래 심근세포의 전기 자극은 5비트마다 자극률을 증가시키고, 구타율이 증가함에 따라 작용 잠재력의 점진적 단축을 입증하였다. 더욱이, 자발적으로 구타IPS 세포 유래 심근세포의 치료 isoproternol, 비 선택적 베타 아드레노 수용체 작용제, 구타 속도의 신속한 증가로 이어졌다, 그 아고니스트의 증가 용량으로 더 증가 될 수있다. 이 방법은 고전적인 전기 생리학적 측정에 비해 우수한 처리량을 제공하지만 형광 전압 센서의 본질적인 운동 특성에 의해 제한된 시간적 분해능을 포함하여 그 한계를 알고 있어야 합니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

인간 유도 만능의 줄기 세포를 Transfecting 및 Nucleofecting

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

연구

생물학

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포로부터 인간 심장 엽 성의 전구 물질과 Cardiomyocytes의 효율 유도

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

인간 유도 Pluripotent 줄기 세포의 선택 및 분리 식민지는 성인 섬유아 세포에서 다시 프로그램

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

GFP와 Retroviral 벡터를 사용하여 유도 Pluripotent 줄기 세포 (iPSCs)로 인간 체세포를 프로그래밍

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

손쥐 심방과 심실 Cardiomyocytes의 절연 및 KV 채널 레코딩

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

인간의 Cardiomyocytes의 생성 : 피더없는 인간 유도 만능 줄기 세포에서 분화 프로토콜

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

센다이 바이러스와 인간의 체세포의 효율적인 생성 인간 유도 만능 줄기 세포

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

유동 세포 계측법에 의한 고효율 심근에 인간 다 능성 줄기 세포의 분화 및 특성

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

진동절단 심근슬라이스에서 인간 심실 심근세포의 분리

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

통합 된 라이브 셀 모니터링을 통해 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 피질 및 도파민 뉴런의 자동화 된 생산

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...