Name: subtype-specific optical action potential recordings in human induced pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes
Uploaded: 2018-09-27T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra tysk Research Foundation (Si 1747/1-1), den andre Kröner-Fresenius-Stiftung og Deutsche Stiftung für Herzforschung.

1. utarbeidelse av iPSC-avledet Cardiomyocytes for Imaging
Merk: Metoder for iPSC kultur og cardiac differensiering blitt publisert før12,13,14 og er ikke omtalt her i detalj. Rensing av iPSC-CMs manuell microdissection, magnetiske celle separasjon eller laktat utvalg anbefales, avhengig av differensiering protokollen som brukes. For følgende protokollen, ble microdissected explants fra slo områder, ...

<ol>
	<li>Sinnecker, D., Laugwitz, K. L., Moretti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+development+and+toxicity+testing.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug development and toxicity testing.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 143 (2), 246-252 (2014).</li><li>Goedel, A., My, I., Sinnecker, D., Moretti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+and+Challenges+of+Pluripotent+Stem+Cells+in+Cardiac+Arrhythmia+Research.">Perspectives and Challenges of Pluripotent Stem Cells in Cardiac Arrhythmia Research.</a> Current Cardiology Reports. 19 (3), 23 (2017).</li><li>Rocchetti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+arrhythmogenic+mechanisms+of+long-QT+syndrome+CALM1-F142L+mutation+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Elucidating arrhythmogenic mechanisms of long-QT syndrome CALM1-F142L mutation in patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cardiovascular Research. 113 (5), 531-541 (2017).</li><li>Sinnecker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+long-QT+syndromes+with+iPS+cells.">Modeling long-QT syndromes with iPS cells.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 6 (1), 31-36 (2013).</li><li>Talkhabi, M., Aghdami, N., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiomyocyte+generation+from+pluripotent+stem+cells:+A+state-of-art.">Human cardiomyocyte generation from pluripotent stem cells: A state-of-art.</a> Life Sciences. , 98-113 (2016).</li><li>Ben-Ari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+electrophysiological+characteristics+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).</li><li>Den Hartogh, S. C., Passier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+Review:+Fluorescent+Reporters+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells:+Contributions+to+Cardiac+Differentiation+and+Their+Applications+in+Cardiac+Disease+and+Toxicity.">Concise Review: Fluorescent Reporters in Human Pluripotent Stem Cells: Contributions to Cardiac Differentiation and Their Applications in Cardiac Disease and Toxicity.</a> Stem Cells. 34 (1), 13-26 (2016).</li><li>Schweizer, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-specific+differentiation+of+cardiac+pacemaker+cell+clusters+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Subtype-specific differentiation of cardiac pacemaker cell clusters from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 229 (2017).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-specific+promoter-driven+action+potential+imaging+for+precise+disease+modelling+and+drug+testing+in+hiPSC-derived+cardiomyocytes.">Subtype-specific promoter-driven action potential imaging for precise disease modelling and drug testing in hiPSC-derived cardiomyocytes.</a> European Heart Journal. 38 (4), 292-301 (2017).</li><li>Lam, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+FRET+dynamic+range+with+bright+green+and+red+fluorescent+proteins.">Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Bhattacharya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes+and+characterization+by+flow+cytometry.">High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).</li><li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+production.">Lentivirus production.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1499 (2009).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Jung, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dantrolene+rescues+arrhythmogenic+RYR2+defect+in+a+patient-specific+stem+cell+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> EMBO Molecular Medicine. 4 (3), 180-191 (2012).</li><li>Lemoine, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+cardiomyocytes+cultured+in+3D+engineered+heart+tissue+show+physiological+upstroke+velocity+and+sodium+current+density.">Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density.</a> Scientific Reports. 7, 5464 (2017).</li><li>Dorn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+nkx2-5+transcriptional+repression+of+isl1+controls+cardiomyocyte+subtype+identity.">Direct nkx2-5 transcriptional repression of isl1 controls cardiomyocyte subtype identity.</a> Stem Cells. 33 (4), 1113-1129 (2015).</li><li>Kaestner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+Encoded+Voltage+Indicators+in+Circulation+Research.">Genetically Encoded Voltage Indicators in Circulation Research.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (9), 21626-21642 (2015).</li></ol>

Metoden beskrevet her kan et optisk opptak med APs fra en bestemt undertype (dvs., ventrikkel-lignende celler) av CMs generert fra menneskelige iPSCs. Menneskelige iPSC-CMs er en nye verktøy for å ta et stort utvalg av biologisk og medisinsk problemer, og differensiering til forskjellige CM-deltyper er en viktig kilde til eksperimentell variasjoner. Ved å bruke spesifikke promoter elementer, oppnås uttrykk for en GEVI spesielt i CMs som representerer undertypen av interesse, som er så optisk fotografert.</p...

Cardiomyocytes (CMs) avledet fra indusert pluripotent stamceller (iPSCs) er en nye verktøy for å analysere molekylære mekanismer av hjertesykdom, undersøke romanen terapi, og skjermen for uønskede cardiac narkotika effekter1,2 ,3. Helt fra starten, har arrhythmogenic sykdommer som channelopathies vært et viktig fokus i denne forskning området4. Følgelig er metoder for å undersøke elektrisk fenotyper CMS, som arytmi eller endringer i handlingen potensial (AP) morphologies, i hjertet av denne teknologien.
En viktig faktor i anvendelsen av iPSC-CMs er at gjeldende cardiac differensiering protokoller ikke resultere i en homogen populasjon av celler. I stedet er de snarere en blanding av celler som ligner sinus node, atrial, og ventrikkel CMs på ulike nivåer av modning5,6,7,8. Denne heterogene kan være en relevante kilde av eksperimentell variasjoner, spesielt hvis parametere som AP varighet (APD) er undersøkt, som egentlig skiller mellom CM-deltyper (f.eksAPD er kortere atrial enn i ventrikkel CMs). Konvensjonelle tilnærming til dette problemet er å undersøke enkelt iPSC-CMs med metoden oppdateringen klemme og klassifisere hver celle som knutepunktet-, atrial-, eller ventrikkel som, basert på dens AP morfologi9. Alle påfølgende analyse kan deretter begrenses til cellene representerer CM undertypen av interesse. Den store ulempen med denne strategien er den begrenset produksjon og mangel på skalerbarhet. Dessuten tillater ikke invasiv art på oppdateringen klemme elektrofysiologi avbilding av de samme cellene sekvensielt over lengre tidsperioder.
Her gir vi eksperimentelle detaljer på en metode10 utvilket optisk image APs i bestemte undergrupper av iPSC-CMs. Dette overvinner problemet med undertypen heterogenitet og øker dramatisk i forhold til konvensjonelle metoder, slik at den raske phenotyping for iPSC-CMs bærer genetisk varianter eller blir utsatt for farmakologisk agenter.
Oversikt over Undertypespesifikke optisk tenkelig tilnærming
En genetisk kodet spenning indikator (GEVI), fluorescens egenskapene endre depolarization og repolarisasjon i cellemembranen, brukes å optisk image endringer av membran potensialet i CMs. GEVI brukt her er spenning-sensing fluorescerende protein VSFP-CR11, som består av et spenning-sensing transmembrane domene smeltet til et par av en grønn (kløver) og en rød (mRuby2) fluorescerende protein (figur 1A). På grunn av nærheten til de to fluorophores, magnetisering av grønne fluorescerende protein resultater på en brøkdel av eksitasjon overføres til den røde fluorescerende protein via han selvmord resonans energioverføring (bånd). Derfor resulterer magnetisering av grønne fluorescerende protein i et utslipp fra både grønne og røde fluorescerende proteiner (figur 1A, øvre panel). Når cellen depolarizes, oppstår det en strukturell omorganisering av spenningssensoren som oversetter til en nyorientering av to fluorescerende proteiner, øke bånd effektiviteten. Dermed overføres enda mer av eksitasjon fra grønn til rød fluorescerende protein (figur 1A, nedre panel). Resultatet i en depolarized celle, grønne fluorescens utslipp er dimmer og røde fluorescens utslipp er lysere enn i en celle på hvile membran potensial (figur 1B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig1.jpg"> Figur 1: optisk avbilding av membran potensial med VSFP-Kreditnotabeløp (A) A skjematisk som spenning-sensitive fluorescerende protein VSFP-CR vises. Ved depolarization i cellemembranen oversettes en strukturell omorganisering i spenning-sensing transmembrane domenet til en nyorientering i grønt (GFP) og rød (RFP) fluorescerende protein, øke effektiviteten av den intramolekylære han selvmord resonans energioverføring (bånd). (B) utslipp spektra av en VSFP på magnetisering av GFP i cellene på hvile membran potensialet (øvre panel) og depolarized celler (nedre panel) er avbildet. Spectral endringen på depolarization er overdrevet for klarhet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Endringene i bånd effektiviteten speiling svingninger membran potensial er avbildet med fluorescens mikroskop utstyrt med en bilde splitter, som skiller røde og grønne fluorescens utslipp og prosjekter dem på to tilstøtende områder av chip til et sCMOS kamera (figur 2). Med dette oppsettet, kan fluorescens utslipp på to forskjellige bølgelengde band tas opp samtidig, som gjør beregningen av forholdet rød til grønn fluorescens å reflektere membranen i hvert bilde av en time-lapse serie.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig2.jpg"> Figur 2: konfigurasjonen av tenkelig systemet. Hovedkomponentene tenkelig systemet brukes til bilde spectral endringene av spenning-sensitive fluorescerende protein speiling endres membran potensial med en høy timelige oppløsning er avbildet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Uttrykk for VSFP-CR i CMs oppnås ved lentiviral signaltransduksjon. For direkte uttrykk til CM undertypen av interesse, inneholder lentivirus et arrangøren element ( MLC2v forsterker) som spesielt driver transkripsjon i ventrikkel-lignende iPSC-CMs10. Når iPSC-CMs som representerer en blanding av cellene atrial-lignende, knutepunktet-lignende og ventrikkel som er transduced med denne lentivirus, er VSFP-CR uttrykt i ventrikkel som cellene. Siden optisk handling potensial avbilding avhenger fluorescerende sensor, representerer de registrerte handlingen potensialene utelukkende CM undertypen av interesse (Figur 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig3.jpg"> Figur 3: Promoter-drevet VSFP uttrykk for Undertypespesifikke membran potensielle bildebehandling. (en) dette skjematisk viser hvordan cardiomyocyte Undertypespesifikke optisk handling potensial recordings er oppnådd. (b) iPSC-CMs infisert med en VSFP under kontroll av ventrikkel-spesifikke MLC2v-enhancer vises. Uttrykk for spenningssensoren er observert i ventrikkel-lignende CMs i GFP kanalen (venstre panel). Kontrast (midten panel) og overleggsbildet (høyre panel) tilbys også. De hvite prikkete merke cellekantlinjene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#223;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21331046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS(Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16141079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax-I Supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050061</td>
			<td>alternative L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin bovine plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>Worthington Biochem</td>
			<td>LS004174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine Bromide (Polybrene)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9268</td>
			<td>enhancing lentiviral infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 cm glass-bottom microdishes</td>
			<td>MatTek corporation, Ashland, MA, USA</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stand</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DMI6000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope objective</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td colspan="2">HCX PL APO 63x/1.4-0.6 Oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor Technology, Belfast, UK</td>
			<td>Zyla V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope filter cube: excitation filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA</td>
			<td>ET480/40X</td>
			<td>bandpass 480/40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope filter cube: dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA</td>
			<td>T505lpxr</td>
			<td>longpass 505 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter</td>
			<td>&#160;Cairn Research, Faversham, UK</td>
			<td>OptoSplit II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter filter cube: dichroic mirror</td>
			<td>AHF Analysentechnik GmbH, T&#252;bigen, Germany</td>
			<td>568LPXR</td>
			<td>longpass 568 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter filter cube: emission filter 1 (GFP emission)</td>
			<td>AHF Analysentechnik GmbH, T&#252;bigen, Germany</td>
			<td>520/28 BrightLine HC</td>
			<td>bandpass 520/28 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter filter cube: emission filter 2 (RFP emission)</td>
			<td>AHF Analysentechnik GmbH, T&#252;bigen, Germany</td>
			<td>630/75 ET Bandpass</td>
			<td>bandpass 630/75 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacing inset</td>
			<td>Warner Instruments, Hamden, CT, USA</td>
			<td>RC-37FS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subtype-specific optical action potential recordings in human induced pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes

Cardiomyocytes generert fra menneskelige indusert pluripotent stamceller (iPSC-CMs) er en nye verktøy i hjerte forskning. Snarere enn å være en homogen populasjon av celler, iPSC-CMs generert av gjeldende differensiering protokoller representerer en blanding av celler med ventrikkel-, atrial-, og knutepunktet-lignende fenotyper, kompliserer fenotypiske analyser. Her vises en metode til optisk posten handling potensial spesielt fra ventrikkel-lignende iPSC-CMs. Dette oppnås ved lentiviral signaltransduksjon med en konstruksjon som en genetisk kodet spenning indikator er under kontroll av et ventrikkel-spesifikke promoter element. Når iPSC-CMs er transduced med denne konstruksjonen, uttrykkes spenningssensoren utelukkende i ventrikkel-lignende celler, slik at Undertypespesifikke optisk membran potensielle innspillinger med time-lapse fluorescens mikroskopi.

I figur 4a, er en representant enkelt iPSC-CM avbildet med hvite stiplede linjer markerer Avkastningen trukket under tenkelig analysen RFP (venstre) og GFP (høyre side) kanalen. Signalet fra RFP kanalen viser en periodisk økning i fluorescerende intensitet under hver handling potensial (figur 4b, øvre panel). Som beskrevet i innledningen, skyldes dette en økende bånd skyldes endringer i membranen potensielle (<strong class="...

Watch this Scientific Journal Video about Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes at JoVE.com

Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes

Her presenterer vi en metode til optisk image handling potensial, spesielt i ventrikkel som indusert pluripotent Stamcelle-avledet cardiomyocytes. Metoden er basert på arrangøren-drevet uttrykk for en spenning-sensitive fluorescerende protein.

Undertypespesifikke optisk handling potensial Recordings i menneskelig indusert Pluripotent Stamcelle-avledet ventrikulær Cardiomyocytes

Cardiomyocytes generated from human induced pluripotent stem cells (iPSC-CMs) are an emerging tool in cardiovascular research. Rather than being a ...

Kardiomyocytter generert fra induserte pluripotente stamceller eller IPS-celler brukes i økende grad til å svare på en rekke biologiske spørsmål innen hjerteelektrofysiologi. De viktigste fordelene med denne teknologien er at det tillater en dramatisk økning i gjennomstrømning samt subtype spesifikke handling potensielle opptak i ventrikulære som myocytter, ved hjelp av en ventrikulær spesifikk promotor element. Innføringen av genetisk kodede spenningssensorer gjennom lentiviral transduksjon gjør det mulig å optisk avbildning av menneskeinduserte pluripotente stamceller-avledede kardiomyocytter virkningspotensialer.Begynn med å blande lentivirusholdig cellekultur supernatant med kardiomyocytt vedlikeholdsmedium, med ett til ett forhold. Tilsett heksameterinbromid ved en endelig konsentrasjon på 8 mikrogram per milliliter, for å øke infeksjonseffektiviteten. Og erstatt kardiomyocyttvedlikeholdsmediet i IPS-celleavledet kardiomyocytter kulturrett, med infeksjonsmediet.Kultur de infiserte kardiomyocytter i 12 timer ved 37 grader Celsius, og erstatte infeksjonsmediet med frisk kardiomyocyte vedlikeholdsmedium. Før avbildning, børs cellekulturmediet med Tyrodes løsning, supplert med kalsium. Plasser deretter kardiomyocytter i et bildekammer på scenen av et omvendt epifluorescencemikroskop utstyrt med en bildesplitter.Hvis elektrisk tempo er nødvendig, installere pacing elektroder i bildekammeret og koble elektrodene til en stimulans generator. Sett cellene i fokus, og finn en celle som uttrykker den genetisk kodede spenningsindikatoren i midten av visningsfeltet. Still inn den optiske banen slik at det avgitte lyset rutes til bildesplitteren og bytter filterkuben i mikroskopet til den som skal kombineres med filtrene i bildesplitteren.I programvaren som styrer kameraet, angir du anskaffelsesinnstillingen slik at høyhastighetsbilder er mulig, og konfigurerer bildesplitteren i henhold til produsentens instruksjoner. De to bildene som representerer de to forskjellige utslippsbølgelengdebåndene, skal være ved siden av hverandre, hver opptar den ene halvdelen av bildet. Kontroller og juster fokuset på bildet som produseres av kameraet etter behov.Og juster lysstyrken på belysningslyset slik at pikselmetning unngås. Sett oppkjøpet av tidsserien, og dempe lyset i rommet for å unngå bortkommen lys påvirke målingen. Deretter åpner du eksitasjonslyslukkeren og begynner oppkjøpet av bildeserien, og starter den elektriske tempoet på riktig tidspunkt, som eksperimentelt hensiktsmessig.Når oppkjøpet er ferdig, lukker du eksitasjonslyslukkeren etter behov og lagrer opptaket på harddisken. Deretter lar opptaksinnstillingen være uendret, registrerer du bakgrunnen over et område av dekkslippen uten celler. For analyse av den optiske membran potensielle opptak, åpne tiff-stakken som inneholder cellene i ImageJ, og bruk frihåndsvalgverktøyet til å tegne et område av interesse over en fluorescerende kardiomyocyte, i den røde kanalen, og vær forsiktig med at området er stort nok til at cellen ikke vil bevege seg ut av regionen mens de trekker seg sammen.Deretter velger du Analyser, Verktøy, Område av interessebehandling og velger Legg til T for å legge til området som Område av interesse 1. Dra interesseområdet over den samme cellen i den grønne kanalen, og legg til dette området som Område av interesse 2. Fjern merket for alle alternativene under menyene Analyser og Angi målinger, bortsett fra Gjennomsnittsgrå-verdien.Klikk Mer og Flere mål i Områdeansvarlig for å velge alternativene Mål alle stykker og Én rad per sektor, og klikk OK. Et vindu åpnes med et regneark med de tre radene. Bruk Fil og Lagre som til å lagre regnearket i en kommadelt verdifil. Lukk vinduet med bildestakken og regnearkvinduet uten å lukke Vinduet Område for interessebehandling, og åpne TIFF-stakken som inneholder bakgrunnsmålingen.Klikk Flere og flere mål i Områdebehandling for å velge alternativene Mål alle stykker og Én rad per sektor, og klikk OK. Lagre deretter bakgrunnsdataene i en egen csv-fil. Her er en representativ enkelt IPS-celleavledet kardiomyocytt avbildet med de hvite stiplede linjene som markerer interesseområdene, tegnet under bildeanalysen i RFP- og GFP-kanalene, vises. Signalet fra RFP-kanalen viser en periodisk økning i fluorescerende intensitet under hvert handlingspotensial på grunn av en økende tvungen eller resonansenergioverføring forårsaket av endringer i membranpotensialet.Concordantly viser GFP-signalet en periodisk reduksjon i fluorescerende intensitet. RFP/GFP-forholdet er det biologiske signalet som brukes i nedstrøms analyser, for eksempel virkningspotensial varighet på 50 og 90 målinger. For eksempel, ved hjelp av denne metoden, viste 30-dagers gammel ventrikulær som IPS celleavledede kardiomyocytter plassert på 0,5 Hertz, en gjennomsnittlig handling potensiell varighet 50 av 439 millisekunder, og en gjennomsnittlig handling potensiell varighet 90 av 520 millisekunder.Elektrisk stimulering av IPS-celleavledede kardiomyocytter ved økende stimuleringshastigheter hvert femte slag, viste en progressiv forkortelse av handlingspotensialet etter hvert som slaghastigheten økte. Videre førte behandling av de spontant slående IPS-celleavledede kardiomyocytter med isoproternol, en ikke-selektiv beta adrenoreseptoragonist, til en rask økning i slaghastigheten, som kan økes ytterligere med økende doser av agonisten. Selv om denne metoden gir overlegen gjennomstrømning sammenlignet med klassiske elektrofysiologiske målinger, må man være klar over begrensningene, inkludert en timelig oppløsning som er begrenset av de indre kinetiske egenskapene til den fluorescerende spenningssensoren.

Research

JoVE Journal

Biology

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv Utledning av Human Cardiac Forstadier og cardiomyocytes fra pluripotent humane embryonale stamceller med lite molekyl Induksjon

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Velge og isolere kolonier av menneskeskapte pluripotent stamceller omprogrammert fra voksne Fibroblaster

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Omprogrammering Menneskelige Somatiske celler i Utførte pluripotent stamceller (iPSCs) Bruke retrovirale Vector med GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

Isolasjon og Kv Channel Recordings i Murine Atrial og ventrikulær cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Human Cardiomyocytes: En Differensiering Protokoll fra mater-frie menneskeskapte pluripotent stamceller

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Effektiv Generation Menneskelig indusert pluripotent stamceller fra menneskelige somatiske celler med Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

High Efficiency Differensiering of Human Pluripotent stamceller til Cardiomyocytes og karakterisering med flowcytometri

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

Isolering av humane ventrikulære kardiomyocytter fra vibratom-cut myokardskiver

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

Automatisert produksjon av humane induserte pluripotente stamcelleavledede kortikale og dopaminerge nevroner med integrert live-celle overvåking

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...