Name: subtype-specific optical action potential recordings in human induced pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes
Uploaded: 2018-09-27T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes at JoVE.com

Este trabalho foi financiado por doações da Fundação alemã de pesquisa (Si 1747/1-1), a outra Kröner-Fresenius-Stiftung e a Deutsche Stiftung für Herzforschung.

1. preparação dos Cardiomyocytes iPSC-derivado para a imagem latente
Nota: Métodos de diferenciação de cultura e cardíaca de iPSC foram publicados antes de12,13,14 e não serão discutidos aqui em detalhes. A purificação de iPSC-CMs microdissection manual, separação magnética celular ou seleção de lactato é recomendada, dependendo do protocolo de diferenciação utilizado. Para o seguinte ...

<ol>
	<li>Sinnecker, D., Laugwitz, K. L., Moretti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+development+and+toxicity+testing.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug development and toxicity testing.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 143 (2), 246-252 (2014).</li><li>Goedel, A., My, I., Sinnecker, D., Moretti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+and+Challenges+of+Pluripotent+Stem+Cells+in+Cardiac+Arrhythmia+Research.">Perspectives and Challenges of Pluripotent Stem Cells in Cardiac Arrhythmia Research.</a> Current Cardiology Reports. 19 (3), 23 (2017).</li><li>Rocchetti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+arrhythmogenic+mechanisms+of+long-QT+syndrome+CALM1-F142L+mutation+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Elucidating arrhythmogenic mechanisms of long-QT syndrome CALM1-F142L mutation in patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cardiovascular Research. 113 (5), 531-541 (2017).</li><li>Sinnecker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+long-QT+syndromes+with+iPS+cells.">Modeling long-QT syndromes with iPS cells.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 6 (1), 31-36 (2013).</li><li>Talkhabi, M., Aghdami, N., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiomyocyte+generation+from+pluripotent+stem+cells:+A+state-of-art.">Human cardiomyocyte generation from pluripotent stem cells: A state-of-art.</a> Life Sciences. , 98-113 (2016).</li><li>Ben-Ari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+electrophysiological+characteristics+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).</li><li>Den Hartogh, S. C., Passier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+Review:+Fluorescent+Reporters+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells:+Contributions+to+Cardiac+Differentiation+and+Their+Applications+in+Cardiac+Disease+and+Toxicity.">Concise Review: Fluorescent Reporters in Human Pluripotent Stem Cells: Contributions to Cardiac Differentiation and Their Applications in Cardiac Disease and Toxicity.</a> Stem Cells. 34 (1), 13-26 (2016).</li><li>Schweizer, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-specific+differentiation+of+cardiac+pacemaker+cell+clusters+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Subtype-specific differentiation of cardiac pacemaker cell clusters from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 229 (2017).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-specific+promoter-driven+action+potential+imaging+for+precise+disease+modelling+and+drug+testing+in+hiPSC-derived+cardiomyocytes.">Subtype-specific promoter-driven action potential imaging for precise disease modelling and drug testing in hiPSC-derived cardiomyocytes.</a> European Heart Journal. 38 (4), 292-301 (2017).</li><li>Lam, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+FRET+dynamic+range+with+bright+green+and+red+fluorescent+proteins.">Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Bhattacharya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes+and+characterization+by+flow+cytometry.">High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).</li><li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+production.">Lentivirus production.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1499 (2009).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Jung, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dantrolene+rescues+arrhythmogenic+RYR2+defect+in+a+patient-specific+stem+cell+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> EMBO Molecular Medicine. 4 (3), 180-191 (2012).</li><li>Lemoine, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+cardiomyocytes+cultured+in+3D+engineered+heart+tissue+show+physiological+upstroke+velocity+and+sodium+current+density.">Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density.</a> Scientific Reports. 7, 5464 (2017).</li><li>Dorn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+nkx2-5+transcriptional+repression+of+isl1+controls+cardiomyocyte+subtype+identity.">Direct nkx2-5 transcriptional repression of isl1 controls cardiomyocyte subtype identity.</a> Stem Cells. 33 (4), 1113-1129 (2015).</li><li>Kaestner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+Encoded+Voltage+Indicators+in+Circulation+Research.">Genetically Encoded Voltage Indicators in Circulation Research.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (9), 21626-21642 (2015).</li></ol>

O método descrito aqui permite que uma gravação óptica de APs de um subtipo específico (ou seja, células ventriculares) de CMs gerado a partir de iPSCs humana. IPSC-CMs humanos são uma ferramenta emergente para resolver uma enorme variedade de problemas biológicos e médicos, e a diferenciação de diferentes subtipos de CM é uma importante fonte de variabilidade experimental. Usando elementos específicos do promotor, a expressão de um GEVI especificamente é alcançada em CMs que representa o subtipo...

Cardiomyocytes (CMs) derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) são uma ferramenta emergente para dissecar os mecanismos moleculares da doença de coração, para investigar novas terapias e a tela para drogas cardíacos adversos efeitos1,2 ,3. Desde o início, arrhythmogenic doenças como canalopatias têm sido um importante foco desta área de investigação4. Consequentemente, métodos para investigar fenótipos elétricos do CMs, como arritmias ou alterações em morfologias do potencial de ação (AP), são o cerne desta tecnologia.
Uma consideração importante na aplicação de iPSC-CMs é que protocolos de diferenciação cardíaca atual não resulta em uma população homogênea de células. Em vez disso, eles são uma mistura de células, assemelhando-se a nó sinusal, atrial e CMs ventriculares em diferentes níveis de maturação5,6,7,8. Esta heterogeneidade pode ser uma fonte relevante de variabilidade experimental, especialmente se são investigados parâmetros como duração de AP (APD), que intrinsecamente diferem entre os subtipos CM (por exemplo, a APD é menor no atrial do que em CMs ventriculares). A abordagem convencional para resolver este problema é para investigar único iPSC-CMs usando o método de braçadeira do remendo e classificar cada célula como nodal-, atrial-, ou como ventricular, com base na sua morfologia AP9. Qualquer análise subsequente pode ser restringido em seguida para as células que representa o subtipo CM de interesse. A grande desvantagem dessa estratégia é seu throughput limitado e a falta de escalabilidade. Além disso, a natureza invasiva da eletrofisiologia de braçadeira do remendo não permite a imagem das mesmas células sequencialmente durante períodos de tempo prolongado.
Aqui, nós fornecemos detalhes experimentais em um método10 desenvolvido para imagem opticamente APs em subtipos específicos de iPSC-CMs. Isso supera o problema da heterogeneidade do subtipo e aumenta drasticamente o throughput em comparação com os métodos convencionais, permitindo a rápida fenotipagem de iPSC-CMs carregando variantes genéticas ou sendo agentes expostos a farmacológica.
Visão geral da abordagem de imagem óptica subtipo específico
Um indicador de tensão geneticamente codificado (GEVI), cujas propriedades de fluorescência mudam após a despolarização e repolarização da membrana celular, é usado para imagem opticamente alterações do potencial de membrana da CMs. O GEVI aplicado aqui é a proteína fluorescente sensor de voltagem VSFP-CR11, que consiste em um domínio transmembrana sensor de tensão, fundido a um par de um verde (trevo) e uma proteína fluorescente vermelha (mRuby2) (figura 1A). Devido a grande proximidade dos dois fluorophores, a excitação da proteína verde fluorescente resulta em uma fração da energia da excitação sendo transferida para a proteína fluorescente vermelha através de transferência de energia de ressonância de Förster (FRET). Portanto, a excitação da proteína verde fluorescente resulta em uma emissão de ambos o verde e as proteínas fluorescentes vermelhas (figura 1A, painel superior). Quando a célula depolarizes, um rearranjo estrutural do sensor de tensão ocorre que se traduz em uma reorientação das duas proteínas fluorescentes, aumentando a eficiência do FRET. Assim, ainda mais a energia de excitação é transferida de verde para a proteína fluorescente vermelha (figura 1A, painel inferior). Como resultado, em uma célula despolarizada, a emissão de fluorescência verde é redutor, e a emissão de fluorescência vermelha é mais brilhante do que em uma célula no potencial de membrana (figura 1B) a descansar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig1.jpg"> Figura 1: imagem ótica da membrana potencial com CR. VSFP (A), A diagrama esquemático mostrando a ação da proteína fluorescente sensível à tensão QUE VSFP-CR é mostrado. Após a despolarização da membrana celular, um rearranjo estrutural no domínio transmembranar do sensor de tensão se traduz em uma reorientação do verde (GFP) e vermelha (RFP) fluorescente da proteína, aumentando a eficiência da intramolecular Förster transferência de energia de ressonância (FRET). Espectros (B) a emissão de um VSFP em cima da excitação da GFP em células com o potencial de membrana de repouso (painel superior) e em células despolarizadas (painel inferior) são retratados. A mudança espectral após a despolarização é exagerada para maior clareza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
As mudanças na eficiência FRET espelhando as flutuações do potencial de membrana são fotografadas usando um microscópio de fluorescência, equipado com um divisor de imagem, que separa a emissão de fluorescência vermelha e verde e projeta-los sobre duas áreas adjacentes de o chip de uma câmera de sCMOS (Figura 2). Com esta configuração, a emissão de fluorescência em duas bandas de comprimento de onda diferente pode ser gravada simultaneamente, que permite o cálculo de um rácio de fluorescência verde-vermelho-para refletir o potencial em cada imagem de uma lapso de tempo série de membrana.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig2.jpg"> Figura 2: configuração do sistema de geração de imagens. Os principais componentes do sistema de imagem usados para imagem as mudanças espectrais da proteína fluorescente tensão sensível as alterações de potencial de membrana em uma alta resolução temporal de espelhamento são retratadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
A expressão de VSFP-CR em CMs é conseguida Lentivirus transdução. Para direcionar a expressão para o subtipo CM de interesse, o lentivirus contém um elemento de promotor (o MLC2v enhancer) que especificamente drives transcrição em ventricular como iPSC-CMs10. Quando o iPSC-CMs que representam uma mistura de células semelhantes a atrial, nodal, como e ventricular, como é transfectado com este lentivirus, VSFP-CR é expresso apenas nas células como ventricular. Uma vez que a imagem latente ótica potencial de ação depende deste sensor fluorescente, os potenciais de ação gravados exclusivamente representam o subtipo CM de interesse (Figura 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig3.jpg"> Figura 3: expressão de VSFP orientada por promotor para a imagem latente de potencial de membrana do subtipo específico. (um) este esquema mostra como gravações de potencial de ação óptico subtipo específico de casos são atingidas. (b) iPSC-CMs infectados com um VSFP sob o controle do atrapalha-MLC2v ventricular específicas são mostrados. A expressão do sensor de tensão é observada somente em CMs ventricular, como no canal de GFP (painel esquerdo). O contraste de fase (painel central) e a imagem de superposição (painel direito) também são fornecidos. Linhas brancas pontilhadas marcam limites da célula. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#223;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21331046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS(Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16141079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax-I Supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050061</td>
			<td>alternative L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin bovine plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>Worthington Biochem</td>
			<td>LS004174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine Bromide (Polybrene)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9268</td>
			<td>enhancing lentiviral infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 cm glass-bottom microdishes</td>
			<td>MatTek corporation, Ashland, MA, USA</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stand</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DMI6000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope objective</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td colspan="2">HCX PL APO 63x/1.4-0.6 Oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor Technology, Belfast, UK</td>
			<td>Zyla V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope filter cube: excitation filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA</td>
			<td>ET480/40X</td>
			<td>bandpass 480/40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope filter cube: dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA</td>
			<td>T505lpxr</td>
			<td>longpass 505 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter</td>
			<td>&#160;Cairn Research, Faversham, UK</td>
			<td>OptoSplit II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter filter cube: dichroic mirror</td>
			<td>AHF Analysentechnik GmbH, T&#252;bigen, Germany</td>
			<td>568LPXR</td>
			<td>longpass 568 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter filter cube: emission filter 1 (GFP emission)</td>
			<td>AHF Analysentechnik GmbH, T&#252;bigen, Germany</td>
			<td>520/28 BrightLine HC</td>
			<td>bandpass 520/28 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter filter cube: emission filter 2 (RFP emission)</td>
			<td>AHF Analysentechnik GmbH, T&#252;bigen, Germany</td>
			<td>630/75 ET Bandpass</td>
			<td>bandpass 630/75 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacing inset</td>
			<td>Warner Instruments, Hamden, CT, USA</td>
			<td>RC-37FS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subtype-specific optical action potential recordings in human induced pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes

Cardiomyocytes gerados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (iPSC-CMs) são uma ferramenta emergente em pesquisa cardiovascular. Ao invés de ser uma população homogênea de células, o iPSC-CMs gerado pelos protocolos de diferenciação atual representam uma mistura de células com ventricular-, atrial-e nodal, como fenótipos, que dificulta a análise fenotípica. Aqui, um método para opticamente registro de potenciais de ação, especificamente do tipo ventricular iPSC-CMs é apresentado. Isto é conseguido pelo Lentivirus transdução com uma construção em que um indicador de tensão geneticamente codificado está sob o controle de um elemento promotor específico ventricular. Quando iPSC-CMs são transfectadas com essa construção, o sensor de tensão é expressa exclusivamente em ventricular células, permitindo gravações de potencial de membrana óptico subtipo específico usando microscopia de fluorescência de lapso de tempo.

Na figura 4a, um único representante iPSC-CM é retratado com as linhas pontilhadas brancas marcando o ROI desenhado durante a análise de imagem na RFP (lado esquerdo) e o canal GFP (lado direito). O sinal do canal RFP mostra um aumento periódico em intensidade fluorescente durante cada potencial de ação (figura 4b, painel superior). Conforme descrito na introdução, este é devido a uma crescente FRET causado por alteraç?...

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Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes

Aqui nós apresentamos um método de potenciais de ação opticamente imagem, especificamente em pluripotentes induzidas ventricular, como células-tronco derivadas cardiomyocytes. O método baseia-se na expressão de uma proteína fluorescente sensível à tensão orientado para o promotor.

Potencial de ação óptico subtipo específico gravações em humanos induzida pluripotentes células-tronco derivadas de Cardiomyocytes Ventricular

Cardiomyocytes generated from human induced pluripotent stem cells (iPSC-CMs) are an emerging tool in cardiovascular research. Rather than being a ...

Cardiomiócitos gerados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas ou células IPS são cada vez mais usados para responder a uma variedade de questões biológicas no campo da eletrofisiologia cardíaca. As principais vantagens desta tecnologia são que ela permite um aumento dramático no throughput, bem como gravações potenciais de ação específicas do subtipo em miócitos ventriculares, usando um elemento promotor específico ventricular. A introdução de sensores de tensão geneticamente codificados através da transdução lentiviral permite a imagem óptica de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem potenciais de ação cardiomiócitos derivados de células-tronco.Comece misturando a cultura celular contendo lentivírus com meio de manutenção de cardiomiócitos, em uma proporção de um para um. Adicione brometo de hexadimetherine a uma concentração final de 8 microgramas por mililitro, para aumentar a eficiência da infecção. E substitua o meio de manutenção de cardiomiócitos no prato de cultura de cardiomiócitos derivados de células IPS, com o meio de infecção.Cultue os cardiomiócitos infectados por 12 horas a 37 graus Celsius, e substitua o meio de infecção por meio de manutenção de cardiomiócitos frescos. Antes da imagem, troque o meio de cultura celular com a solução de Tyrode, suplementada com cálcio. Em seguida, coloque os cardiomiócitos em uma câmara de imagem no palco de um microscópio de epifluorescência invertido equipado com um divisor de imagens.Se for necessário ritmo elétrico, instale eletrodos de ritmo na câmara de imagem e conecte os eletrodos a um gerador de estímulo. Leve as células ao foco e localize uma célula expressando o indicador de tensão geneticamente codificado no centro do campo de visão. Defina o caminho óptico para que a luz emitida seja roteada para o divisor de imagens e mude o cubo do filtro no microscópio para aquele a ser combinado com os filtros no divisor de imagens.No software que controla a câmera, defina a configuração de aquisição para que a imagem de alta velocidade seja possível e configure o divisor de imagens de acordo com as instruções do fabricante. As duas imagens que representam as duas diferentes faixas de comprimento de onda de emissão devem ser adjacentes uma à outra, cada uma ocupando metade da imagem. Verifique e ajuste o foco da imagem produzida pela câmera conforme necessário.E ajuste o brilho da luz de iluminação para que a saturação dos pixels seja evitada. Defina a aquisição da série temporal e diminua a luz na sala para evitar que a luz perdida influencie a medição. Em seguida, abra o obturador de luz de excitação e comece a aquisição da série de imagens, iniciando o ritmo elétrico no ponto de tempo apropriado, conforme experimentalmente apropriado.Quando a aquisição estiver concluída, feche o obturador de luz de excitação conforme necessário e salve a gravação no disco rígido. Em seguida, deixando a configuração de gravação inalterada, registo o fundo sobre uma região do deslizamento sem células. Para análise das gravações potenciais da membrana óptica, abra a pilha de tiff contendo as células no ImageJ, e use a ferramenta de seleção à mão livre para desenhar uma região de interesse sobre um cardiomiócito fluorescente, no canal vermelho, tomando cuidado para que a área seja grande o suficiente para que a célula não saia da região durante a contração.Em seguida, selecione Analisar, Ferramentas, Gerente de Região de Interesse e selecione Adicionar T, para adicionar a região como Região de Interesse 1. Arraste a região de interesse sobre a mesma célula no canal verde, e adicione essa região como Região de Interesse 2. Nos menus Analisar e Definir Medidas, desmarque todas as opções, exceto o valor cinza Médio.No Gerenciador de Região de Interesse, clique em Mais e Multi Medida para selecionar as opções Medir todas as fatias e uma linha por fatia e clique em OK. Uma janela será aberta contendo uma planilha com as três linhas. Use Arquivo e Salvar Para salvar a planilha em um arquivo de valor separado por círia. Feche a janela com a pilha de imagens e a janela da planilha sem fechar a janela Region of Interest Manager e abra a pilha de tiff contendo a medição de fundo.No Gerenciador de Região de Interesse, clique na Medida Mais e Multi para selecionar as opções Medir todas as fatias e uma linha por fatia e clique em OK. Em seguida, salve os dados de fundo em um arquivo csv separado. Aqui, um cardiomiócito derivado de células IPS representativo é representado com as linhas pontilhadas brancas marcando as regiões de interesse, desenhadas durante a análise de imagem nos canais RFP e GFP. O sinal do canal RFP demonstra um aumento periódico da intensidade fluorescente durante cada potencial de ação devido a uma crescente transferência de energia forçada ou ressonância causada por mudanças no potencial da membrana.Concordantemente, o sinal GFP apresenta uma diminuição periódica na intensidade fluorescente. A razão RFP/GFP é o sinal biológico utilizado em análises a jusante, como a duração potencial de ação 50 e 90 medições. Por exemplo, usando este método, ventricular de 30 dias de idade como cardiomiócitos derivados de células IPS colocados a 0,5 Hertz, mostrou uma duração potencial de ação média 50 de 439 milissegundos, e uma duração potencial de ação média 90 de 520 milissegundos.A estimulação elétrica dos cardiomiócitos derivados de células IPS a aumentar as taxas de estimulação a cada cinco batidas, demonstrou um encurtamento progressivo dos potenciais de ação à medida que a taxa de espancamento aumentava. Além disso, o tratamento dos cardiomiócitos derivados de células IPS espontaneamente com isoproternol, um agonista receptor beta adreno não seletivo, levou a um aumento imediato na taxa de espancamento, que poderia ser aumentado ainda mais com doses crescentes do agonista. Embora este método forneça um rendimento superior em comparação com as medidas eletrofisiológicas clássicas, deve-se estar ciente de suas limitações, incluindo uma resolução temporal limitada pelas propriedades cinéticas intrínsecas do sensor de tensão fluorescente.

Research

JoVE Journal

Biology

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Transfectando e Nucleofecting células-tronco pluripotentes induzidas

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Biologia

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Derivação eficiente dos recursos humanos Precursores cardíaca e Cardiomyocytes pluripotentes a partir de células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Seleção e isolamento de colônias de células-tronco pluripotentes induzidas a partir de fibroblastos adultos reprogramado

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramação de células somáticas humanas em células tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando vetor retroviral com GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

Isolamento e gravações de canais Kv em Murino cardiomiócitos atriais e ventriculares

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Geração de cardiomiócitos Humanos: Um Protocolo de Diferenciação de Feeder livres Humanos células-tronco pluripotentes induzidas

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Eficiente Geração induzida pelo homem células-tronco pluripotentes a partir de células somáticas humanas com Sendai-vírus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

Diferenciação de alta eficiência de pluripotentes humanas células-tronco para Cardiomyocytes e Caracterização por citometria de fluxo

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

Isolamento de Cardiomiócitos Ventriculares Humanos de fatias de miocárdio cortadas por vibratome

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

Produção automatizada de neurônios cortical e dopaminérgico derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos com monitoramento integrado de células vivas

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...