Name: subtype-specific optical action potential recordings in human induced pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes
Uploaded: 2018-09-27T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантов от немецкого фонда научных исследований (Si 1747/1-1), остальное Kröner-Fresenius-Stiftung и Deutsche Stiftung für Herzforschung.

1. Подготовка iPSC производные кардиомиоцитов изображений
Примечание: Методы для iPSC культуры и сердечных дифференциации были опубликованы до12,13,14 и здесь не обсуждаются подробно. Рекомендуется очищение iPSC-CMs ручного microdissect...

<ol>
	<li>Sinnecker, D., Laugwitz, K. L., Moretti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+development+and+toxicity+testing.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug development and toxicity testing.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 143 (2), 246-252 (2014).</li><li>Goedel, A., My, I., Sinnecker, D., Moretti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+and+Challenges+of+Pluripotent+Stem+Cells+in+Cardiac+Arrhythmia+Research.">Perspectives and Challenges of Pluripotent Stem Cells in Cardiac Arrhythmia Research.</a> Current Cardiology Reports. 19 (3), 23 (2017).</li><li>Rocchetti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+arrhythmogenic+mechanisms+of+long-QT+syndrome+CALM1-F142L+mutation+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Elucidating arrhythmogenic mechanisms of long-QT syndrome CALM1-F142L mutation in patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cardiovascular Research. 113 (5), 531-541 (2017).</li><li>Sinnecker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+long-QT+syndromes+with+iPS+cells.">Modeling long-QT syndromes with iPS cells.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 6 (1), 31-36 (2013).</li><li>Talkhabi, M., Aghdami, N., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiomyocyte+generation+from+pluripotent+stem+cells:+A+state-of-art.">Human cardiomyocyte generation from pluripotent stem cells: A state-of-art.</a> Life Sciences. , 98-113 (2016).</li><li>Ben-Ari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+electrophysiological+characteristics+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).</li><li>Den Hartogh, S. C., Passier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+Review:+Fluorescent+Reporters+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells:+Contributions+to+Cardiac+Differentiation+and+Their+Applications+in+Cardiac+Disease+and+Toxicity.">Concise Review: Fluorescent Reporters in Human Pluripotent Stem Cells: Contributions to Cardiac Differentiation and Their Applications in Cardiac Disease and Toxicity.</a> Stem Cells. 34 (1), 13-26 (2016).</li><li>Schweizer, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-specific+differentiation+of+cardiac+pacemaker+cell+clusters+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Subtype-specific differentiation of cardiac pacemaker cell clusters from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 229 (2017).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-specific+promoter-driven+action+potential+imaging+for+precise+disease+modelling+and+drug+testing+in+hiPSC-derived+cardiomyocytes.">Subtype-specific promoter-driven action potential imaging for precise disease modelling and drug testing in hiPSC-derived cardiomyocytes.</a> European Heart Journal. 38 (4), 292-301 (2017).</li><li>Lam, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+FRET+dynamic+range+with+bright+green+and+red+fluorescent+proteins.">Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Bhattacharya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes+and+characterization+by+flow+cytometry.">High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).</li><li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+production.">Lentivirus production.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1499 (2009).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Jung, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dantrolene+rescues+arrhythmogenic+RYR2+defect+in+a+patient-specific+stem+cell+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> EMBO Molecular Medicine. 4 (3), 180-191 (2012).</li><li>Lemoine, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+cardiomyocytes+cultured+in+3D+engineered+heart+tissue+show+physiological+upstroke+velocity+and+sodium+current+density.">Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density.</a> Scientific Reports. 7, 5464 (2017).</li><li>Dorn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+nkx2-5+transcriptional+repression+of+isl1+controls+cardiomyocyte+subtype+identity.">Direct nkx2-5 transcriptional repression of isl1 controls cardiomyocyte subtype identity.</a> Stem Cells. 33 (4), 1113-1129 (2015).</li><li>Kaestner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+Encoded+Voltage+Indicators+in+Circulation+Research.">Genetically Encoded Voltage Indicators in Circulation Research.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (9), 21626-21642 (2015).</li></ol>

Метод, описанный здесь позволяет оптической записи APs от конкретного подтипом (например, желудочков подобных клеток) CMs, созданный из человека iPSCs. Человека iPSC-CMs являются новым инструментом решать огромное разнообразие биологических и медицинских проблем, и дифференциации в разли?...

Кардиомиоцитов (CMs), производные от индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) являются новым инструментом для рассечения молекулярных механизмов болезни сердца, расследовать Роман терапии и экран для сердца побочных эффектов1,2 ,3. С самого начала аритмогенная заболеваний, таких как channelopathies был важным направлением этой области исследования4. Следовательно методы расследования электрические фенотипы CMs, например аритмий или изменения в морфологии потенциал действия (AP), находятся в центре этой технологии.
Важным фактором в применении iPSC-CMs является, что текущие протоколы сердца дифференциация не приводят к однородная популяция клеток. Вместо этого они являются скорее смесь из клетки, напоминающие синусового узла, фибрилляция и желудочковая CMs на различных уровнях созревания5,6,,78. Эта разнородность может быть источником соответствующих экспериментальных изменчивости, особенно если исследованы параметры, такие как продолжительность AP (APD), который неразрывно различаются подтипы см (например, APD короче предсердий, чем в желудочковой CMs). Традиционный подход к решению этой проблемы является расследование одного iPSC-CMs, с помощью метода зажим патч и классифицировать каждой ячейки как узловой-, предсердий-, или желудочков как, на основе ее AP морфология9. Любой последующий анализ может быть затем ограничен в клетки, представляющие см подтип интерес. Основным недостатком данной стратегии является его ограниченной пропускной способности и отсутствие масштабируемости. Кроме того захватнический характер патч зажим электрофизиологии не позволяют изображений же клетки последовательно в течение длительного времени.
Здесь мы подробно экспериментальный метод10 , разработаны для оптически изображения APs в конкретных подтипы iPSC-CMs. Это преодолевает проблему неоднородности подтип и резко повышает пропускную способность по сравнению с традиционными методами, позволяя быстрое фенотипирование iPSC-CMs проведение генетических вариантов или в подверженными фармакологических агентов.
Обзор подтип-оптических изображений подход
Генетически закодированный напряжения Индикатор (GEVI), свойства которых флуоресценции изменить деполяризации и реполяризации клеточной мембраны, используется для оптически изображение изменения мембранного потенциала CMs. GEVI, здесь это напряжение зондирования флуоресцентный белок VSFP-CR11, которая состоит из напряжения зондирования трансмембранного домена сливается с парой Грин (клевер) и красный (mRuby2) флуоресцентный белок (рис. 1A). Благодаря близости двух флуорофоров возбуждения зеленого флуоресцентного белка приводит к небольшую часть энергии возбуждения, передаются в красных флуоресцентных белков через передачи энергии резонанса Фёрстер (лад). Таким образом возбуждения зеленого флуоресцентного белка приводит к эмиссии из зеленых и красных флуоресцентных белков (рис. 1A, верхняя группа). Когда клетки depolarizes, структурной перестройки датчика напряжения происходит что переводится в переориентации двух флуоресцентных белков, повышение эффективности ладу. Таким образом даже больше энергии возбуждения передается от зеленого до Красного флуоресцирующего белка (рис. 1A, Нижняя панель). В результате в ячейку деполяризованный, зеленая Флуоресценция выбросов диммер, и красной флуоресценцией выбросов ярче, чем в камере в отдыхая мембранного потенциала (рис. 1B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig1.jpg"> Рисунок 1: оптическая томография мембранного потенциала с VSFP-ручей (A) A схема с изображением действий напряжения чувствительных флуоресцентный белок, проявленную VSFP-CR. При деполяризации мембраны клетки структурной перестройки в напряжение зондирования трансмембранных доменов переводит в переориентации Грин (ГПУП) и красный (RFP) флуоресцентный белок, повышение эффективности внутримолекулярной Фёрстер передача энергии резонанса (лад). (B) выбросов спектры VSFP после возбуждения GFP в клетках на мембранного потенциала покоя (Верхняя панель) и в деполяризованный клетках (Нижняя панель) изображены. Спектральные изменения при деполяризации преувеличен для ясности. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
Изменения в ладу эффективность зеркального отображения колебаний мембранного потенциала отражаются с помощью микроскопа флуоресценции оснащены изображения разделителя, который отделяет красной и зеленой флуоресценцией выбросов и проецирует их на две прилегающие районы Микросхема sCMOS камеры (рис. 2). С этой настройки флуоресценции выбросов на двух разных волны полосы могут быть записаны одновременно, что позволяет расчет коэффициента красно зеленая Флуоресценция отразить мембранного потенциала в каждом изображении покадровой серии.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig2.jpg"> Рисунок 2: Настройка системы,. Основные компоненты системы, используется для изображений, которые изображены спектральные изменения напряжения чувствительных флуоресцентный белок, зеркального отображения потенциальных изменений мембраны с высоким временным разрешением. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
Выражение VSFP-CR в CMs достигается лентивирусные трансдукции. Направлять проявление интереса к подтипу см, несущего содержит элемент промоутер ( MLC2v усилитель), который конкретно диски транскрипции в iPSC-CMs желудочков как10. Когда iPSC-CMs, которые представляют собой смесь предсердий как, узловой как и желудочков подобных клеток преобразованы с этой Лентивирусы, VSFP-CR выражается только в клетках желудочков как. Так как оптический потенциал действия изображений зависит от флуоресцентных датчик, записанные потенциалы действия исключительно представляют см подтип интерес (рис. 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig3.jpg"> Рисунок 3: промоутер управляемый VSFP выражение для подтипа специфические мембраны потенциал изображений. () Эта схема показывает, как достигаются cardiomyocyte оптический потенциал действия подтип конкретных записей. (b) iPSC-CMs инфицированных VSFP под контролем желудочков специфических MLC2v-усилитель показываются. Выражение датчика напряжения наблюдается только в желудочков как CMs в канале GFP (левая панель). Также предоставляются фазового контраста (средняя группа) и накладываемого изображения (правая панель). Белыми пунктирными линиями Марк границ ячейки. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#223;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21331046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS(Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16141079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax-I Supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050061</td>
			<td>alternative L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin bovine plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>Worthington Biochem</td>
			<td>LS004174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine Bromide (Polybrene)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9268</td>
			<td>enhancing lentiviral infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 cm glass-bottom microdishes</td>
			<td>MatTek corporation, Ashland, MA, USA</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stand</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DMI6000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope objective</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td colspan="2">HCX PL APO 63x/1.4-0.6 Oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor Technology, Belfast, UK</td>
			<td>Zyla V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope filter cube: excitation filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA</td>
			<td>ET480/40X</td>
			<td>bandpass 480/40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope filter cube: dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA</td>
			<td>T505lpxr</td>
			<td>longpass 505 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter</td>
			<td>&#160;Cairn Research, Faversham, UK</td>
			<td>OptoSplit II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter filter cube: dichroic mirror</td>
			<td>AHF Analysentechnik GmbH, T&#252;bigen, Germany</td>
			<td>568LPXR</td>
			<td>longpass 568 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter filter cube: emission filter 1 (GFP emission)</td>
			<td>AHF Analysentechnik GmbH, T&#252;bigen, Germany</td>
			<td>520/28 BrightLine HC</td>
			<td>bandpass 520/28 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter filter cube: emission filter 2 (RFP emission)</td>
			<td>AHF Analysentechnik GmbH, T&#252;bigen, Germany</td>
			<td>630/75 ET Bandpass</td>
			<td>bandpass 630/75 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacing inset</td>
			<td>Warner Instruments, Hamden, CT, USA</td>
			<td>RC-37FS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subtype-specific optical action potential recordings in human induced pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes

Cardiomyocytes, образующиеся человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC-CMs) являются инструментом, возникающих в сердечно-сосудистых исследований. Однородная популяция клеток, а iPSC-CMs, порожденных текущей дифференциация протоколы представляют собой смесь клеток с желудочковой-, предсердий-и узловые как фенотипы, которые усложняет фенотипические анализы. Здесь представлен метод для оптически записи потенциалы действия конкретно от желудочков как iPSC-CMs. Это достигается путем лентивирусные трансдукция с конструкцией, в которой генетически закодированный напряжения Индикатор находится под контролем элемента желудочков конкретной промоутера. Когда iPSC-CMs преобразованы с этой конструкции, датчик напряжения выражается исключительно желудочков подобных клеток, позволяя оптических мембраны подтип конкретных потенциальных записи с помощью микроскопии флуоресцирования промежуток времени.

В рисунке 4aпредставитель одного iPSC-CM изображен с белыми пунктирными линиями, маркировка ROI, обращается в ходе анализа изображений в ППП (слева) и канал GFP (справа). Сигнал от канала ППП показывает периодический рост в интенсивности флуоресценции во время...

Watch this Scientific Journal Video about Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes at JoVE.com

Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes

Здесь мы представляем метод оптически изображение потенциалы действия, особенно в кардиомиоцитов желудочков как индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Метод основан на промоутер driven выражение напряжения чувствительных флуоресцентный белок.

Подтип конкретных оптический потенциал действия записи в человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток кардиомиоцитов желудочков

Cardiomyocytes generated from human induced pluripotent stem cells (iPSC-CMs) are an emerging tool in cardiovascular research. Rather than being a ...

Кардиомиоциты, генерируемые из индуцированных плюрипотентных стволовых или IPS-клеток, все чаще используются для ответа на различные биологические вопросы в области сердечной электрофизиологии. Основными преимуществами этой технологии является то, что она позволяет резкое увеличение пропускной способности, а также подтип конкретных потенциальных действий записей в желудочков, как миоциты, используя желудочковый конкретный элемент промоутера. Внедрение генетически закодированных датчиков напряжения с помощью лентивирусной трансдукции позволяет оптический визуализации человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных кардиомиоцитов потенциалы действия.Начните с смешивания лентивирусно-содержащей клеточной культуры супернатанта с кардиомиоцитов поддержания среды, на один к одному соотношению. Добавьте бромид гексадиметерин при конечной концентрации 8 микрограмм на миллилитр, чтобы повысить эффективность инфекции. И заменить кардиомиоцитов поддержания среды в IPS клеток полученных кардиомиоцитов культуры блюдо, с инфекцией среды.Культура инфицированных кардиомиоцитов в течение 12 часов при 37 градусах по Цельсию, и заменить инфекции среды со свежими кардиомиоцитов поддержания среды. Перед визуализацией обменяйте среду клеточной культуры раствором Тирода, дополненным кальцием. Затем поместите кардиомиоциты в камеру визуализации на стадии перевернутого микроскопа эпифлюоресценции, оснащенного сплиттером изображения.Если требуется электрический темп, установите электроды в камеру визуализации и подключите электроды к генератору стимулов. Сосредоточьте клетки и найдите ячейку, выражают генетически закодированный индикатор напряжения в центре поля обзора. Установите оптический путь так, чтобы излучаемый свет был переключен на сплиттер изображения и переключил куб фильтра в микроскоп на тот, который будет сочетаться с фильтрами в сплиттере изображения.В программном обеспечении, контролируя камеру, установите настройку приобретения так, чтобы высокоскоростная визуализация была возможна, и наведи сплиттер изображения в соответствии с инструкциями производителя. Два изображения, представляющие две различные полосы длины волны излучения, должны быть рядом друг с другом, каждый из которых занимает половину изображения. Проверьте и отрегулируйте фокус изображения, производимого камерой по мере необходимости.И отрегулируйте яркость освещения таким образом, чтобы избежать насыщения пикселей. Установите приобретение часовой серии, и тусклый свет в комнате, чтобы избежать рассеянный свет, влияющий на измерение. Затем откройте возбуждающий свет затвора и начать приобретение серии изображений, начиная электрический темп в соответствующую точку времени, как экспериментально уместно.Когда приобретение закончено, закройте затвор возбуждения света по мере необходимости и сохраните запись на жестком диске. Затем, оставив запись без изменений, зафиксв фон над областью обложки без ячеек. Для анализа оптических мембран потенциальных записей, открыть tiff стек, содержащий клетки в ImageJ, и использовать инструмент свободного выбора руки, чтобы привлечь область интереса над флуоресцентным кардиомиоцитом, в красном канале, заботясь, что область достаточно велика, что клетка не будет двигаться из региона при заражении.Далее выберите анализ, инструменты, менеджер по интересам и выберите Add T, чтобы добавить регион как регион интересов 1. Перетащите область интереса над той же ячейкой в зеленом канале, и добавить этот регион, как регион интересов 2. В меню «Анализ и набор измерений» не выбраны все варианты, за исключением среднего серого значения.В регионе менеджера интересов щелкните Больше и Multi Measure, чтобы выбрать меру всех срезов и одну строку на срез вариантов и нажмите OK. Откроется окно, содержащее электронную таблицу с тремя строками. Используйте файл и сохранить Как сохранить электронную таблицу в запятую разделенного файла значения. Закройте окно стеком изображения и окном электронной таблицы, не закрыв окно менеджера по региону интересов, и откройте стек tiff, содержащий фоновое измерение.В регионе менеджера интересов щелкните больше и multi измерение для того чтобы выбрать измерение все ломтики и одну строку в варианты ломтика и щелкните ОДОБРЕНО. Затем сохраните фоновые данные в отдельном файле csv. Здесь показан представительный кардиомиоцит IPS-клеток с белыми пунктирными линиями, обозначающий области интереса, нарисованные в ходе анализа изображений в каналах RFP и GFP. Сигнал от канала RFP демонстрирует периодическое увеличение флуоресцентной интенсивности во время каждого действия потенциала из-за увеличения принудительной или резонансной передачи энергии, вызванной изменениями в мембранном потенциале.Соответственно, сигнал GFP демонстрирует периодическое снижение флуоресцентной интенсивности. Соотношение RFP/GFP является биологическим сигналом, используемым в анализах ниже по течению, таких как потенциальная продолжительность действия 50 и 90 измерений. Например, с помощью этого метода, 30-дневный желудочков, как IPS клеток полученных кардиомиоцитов, размещенных на 0,5 Герц, показали среднее действие потенциальной продолжительности 50 из 439 миллисекунд, и среднее действие потенциальной продолжительности 90 из 520 миллисекунд.Электрическая стимуляция кардиомиоцитов, полученных из клеток IPS, при увеличении скорости стимуляции каждые пять ударов, продемонстрировала постепенное сокращение потенциалов действия по мере увеличения скорости избиения. Кроме того, лечение спонтанно избиения IPS клеток полученных кардиомиоцитов с изопротернол, неселективный агонист рецепторов бета-адрено, привело к быстрому увеличению скорости избиения, которые могут быть дополнительно увеличены с увеличением доз агониста. Хотя этот метод обеспечивает превосходную пропускную способность по сравнению с классическими электрофизиологическими измерениями, необходимо знать о его ограничениях, включая временное разрешение, которое ограничено внутренними кинетическими свойствами датчика флуоресцентного напряжения.

Research

JoVE Journal

Biology

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Трансфекции и Nucleofecting человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Эффективное Вывод прав Сердечная Прекурсоры и кардиомиоциты из плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток человека с малыми Индукционная Молекула

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Выбор и изоляция Колонии человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из взрослых Перепрограммированный Фибробласты

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Перепрограммирование соматических клеток человека в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК) Использование ретровирусных вектор с GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

Выделение и записи Kv канала в мышиной предсердий и желудочков кардиомиоцитов

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Поколению прав кардиомиоцитов: Дифференциация Протокол от Ф-свободной человеческой индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Эффективная генерация человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из человеческих соматических клеток с Сендай-вируса

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

Высокая эффективность Дифференциация человека плюрипотентные стволовые клетки, чтобы кардиомиоцитов и характеристика цитометрическим

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

Изоляция желудочковых кардиомиоцитов человека от ломтиков миокарда вибромы

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

Автоматизированное производство человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных корковых и дофаминергических нейронов с интегрированным мониторингом live-Cell

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...