Name: subtype-specific optical action potential recordings in human induced pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes
Uploaded: 2018-09-27T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes at JoVE.com

Detta arbete stöds av bidrag från den tyska forskningsfondens (Si 1747/1-1), den annan Kröner-Fresenius-Stiftung och Deutsche Stiftung für Herzforschung.

1. beredning av iPSC-derived hjärtmuskelcellerna för avbildning
Obs: Metoder för iPSC kultur och hjärt differentiering har publicerats före12,13,14 och diskuteras inte här i detalj. Rening av iPSC-CMs av manuell lokalt, magnetiska cellseparation eller laktat urval rekommenderas, beroende på det differentiering-protokoll som används. För följande protokoll, microdissected bladsticklingar från ...

<ol>
	<li>Sinnecker, D., Laugwitz, K. L., Moretti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+development+and+toxicity+testing.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug development and toxicity testing.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 143 (2), 246-252 (2014).</li><li>Goedel, A., My, I., Sinnecker, D., Moretti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+and+Challenges+of+Pluripotent+Stem+Cells+in+Cardiac+Arrhythmia+Research.">Perspectives and Challenges of Pluripotent Stem Cells in Cardiac Arrhythmia Research.</a> Current Cardiology Reports. 19 (3), 23 (2017).</li><li>Rocchetti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+arrhythmogenic+mechanisms+of+long-QT+syndrome+CALM1-F142L+mutation+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Elucidating arrhythmogenic mechanisms of long-QT syndrome CALM1-F142L mutation in patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cardiovascular Research. 113 (5), 531-541 (2017).</li><li>Sinnecker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+long-QT+syndromes+with+iPS+cells.">Modeling long-QT syndromes with iPS cells.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 6 (1), 31-36 (2013).</li><li>Talkhabi, M., Aghdami, N., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiomyocyte+generation+from+pluripotent+stem+cells:+A+state-of-art.">Human cardiomyocyte generation from pluripotent stem cells: A state-of-art.</a> Life Sciences. , 98-113 (2016).</li><li>Ben-Ari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+electrophysiological+characteristics+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).</li><li>Den Hartogh, S. C., Passier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+Review:+Fluorescent+Reporters+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells:+Contributions+to+Cardiac+Differentiation+and+Their+Applications+in+Cardiac+Disease+and+Toxicity.">Concise Review: Fluorescent Reporters in Human Pluripotent Stem Cells: Contributions to Cardiac Differentiation and Their Applications in Cardiac Disease and Toxicity.</a> Stem Cells. 34 (1), 13-26 (2016).</li><li>Schweizer, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-specific+differentiation+of+cardiac+pacemaker+cell+clusters+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Subtype-specific differentiation of cardiac pacemaker cell clusters from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 229 (2017).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-specific+promoter-driven+action+potential+imaging+for+precise+disease+modelling+and+drug+testing+in+hiPSC-derived+cardiomyocytes.">Subtype-specific promoter-driven action potential imaging for precise disease modelling and drug testing in hiPSC-derived cardiomyocytes.</a> European Heart Journal. 38 (4), 292-301 (2017).</li><li>Lam, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+FRET+dynamic+range+with+bright+green+and+red+fluorescent+proteins.">Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Bhattacharya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes+and+characterization+by+flow+cytometry.">High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).</li><li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+production.">Lentivirus production.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1499 (2009).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Jung, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dantrolene+rescues+arrhythmogenic+RYR2+defect+in+a+patient-specific+stem+cell+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> EMBO Molecular Medicine. 4 (3), 180-191 (2012).</li><li>Lemoine, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+cardiomyocytes+cultured+in+3D+engineered+heart+tissue+show+physiological+upstroke+velocity+and+sodium+current+density.">Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density.</a> Scientific Reports. 7, 5464 (2017).</li><li>Dorn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+nkx2-5+transcriptional+repression+of+isl1+controls+cardiomyocyte+subtype+identity.">Direct nkx2-5 transcriptional repression of isl1 controls cardiomyocyte subtype identity.</a> Stem Cells. 33 (4), 1113-1129 (2015).</li><li>Kaestner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+Encoded+Voltage+Indicators+in+Circulation+Research.">Genetically Encoded Voltage Indicators in Circulation Research.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (9), 21626-21642 (2015).</li></ol>

Den metod som beskrivs här kan en optisk inspelning av APs från en specifik undertyp (dvs, ventrikulär-liknande celler) av CMs som genereras från iPSCs mänskliga. Mänskliga iPSC-CMs är ett framväxande verktyg att hantera en enorm mängd biologiska och medicinska problem och differentiering till CM subtyperna är en viktig källa till experimentella variabilitet. Genom att använda specifika promotorn element, uppnås specifikt uttryck för ett GEVI CMs som representerar subtyp av intresse, som sedan är ...

Hjärtmuskelcellerna (CMs) härrör från inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) är ett framväxande verktyg att dissekera molekylära mekanismer av hjärtsjukdom, att undersöka nya terapier, och till skärmen för kardiella biverkningar effects1,2 ,3. Rätt från början, har Högerkammarfunktion sjukdomar såsom channelopathies varit ett viktigt fokus för denna forskning område4. Metoder för att undersöka elektriska fenotyper av CMs, såsom arytmier eller förändringar i aktionspotential (AP) morfologier, är således kärnan i denna teknik.
En viktig faktor i tillämpningen av iPSC-CMs är att nuvarande hjärt differentiering protokoll inte resulterar i en homogen population av celler. Istället, de är snarare en blandning av celler som liknar sinusknutan, förmaksflimmer, och ventrikulära CMs på olika nivåer av mognad5,6,7,8. Denna heterogenitet kan vara en relevant källa av experimentell variationer, särskilt om parametrar såsom AP varaktighet (APD) undersöks, som intimt skiljer sig mellan CM subtyper (t.ex., APD är kortare i förmaksflimmer än i ventrikulära CMs). Den konventionella metoden för att lösa problemet är att undersöka enda iPSC-CMs med metoden för patch-clamp och klassificera varje cell som nodal-, förmaks-, eller ventrikulär-liknande, baserat på dess AP morfologi9. Eventuella efterföljande analys kan då begränsas till cellerna som representerar CM subtyp av intresse. Den stora nackdelen med denna strategi är dess begränsade genomströmning och avsaknaden av skalbarhet. Dessutom tillåter inte invasiva arten av patch clamp elektrofysiologi bildtagning av samma celler sekventiellt över längre tidsperioder.
Här tillhandahåller vi experimentella Detaljer om en metod10 utvecklade för att optiskt bild APs i specifika subtyper av iPSC-CMs. Detta övervinner problemet subtyp heterogenitet och ökar dramatiskt genomströmningen jämfört med konventionella metoder, så att den snabba fenotypning av iPSC-CMs bär genetiska varianter eller att vara utsatt för farmakologiska agenter.
Översikt av subtyp-specifika optisk imaging strategi
En genetiskt-kodade spänningsindikator (GEVI), vars fluorescens egenskaper ändras vid depolarisation och repolarisering av cellmembranet, används för att optiskt bild förändringar av membranet potential av CMs. Den GEVI tillämpas här är det spänningsavkännande fluorescerande proteinet VSFP-CR11, som består av en spänningsavkännande transmembrana domän smält till ett par en grön (klöver) och en röd (mRuby2) fluorescerande protein (figur 1A). På grund av närheten av de två fluorophores, excitation av grönt fluorescerande protein resulterar i en bråkdel av magnetiseringen energin överförs till den röda fluorescerande protein via Förster resonans energiöverföringen (bandet). Därför, excitation av grönt fluorescerande protein resulterar i utsläpp från både gröna och de röda fluorescerande proteinerna (figur 1A, övre panelen). När cellen depolarizes, uppstår en strukturell ombildning av spänning sensorn som översätter till en omorientering av de två fluorescerande proteiner, effektivisering bandet. Således överförs ännu mer av energin som excitation från gröna till röda fluorescerande proteinet (figur 1A, nedre panelen). Som ett resultat, i en Aricebo cell, grön fluorescens utsläpp är dimmer och röd fluorescens utsläpp är ljusare än i en cell på Vila membranpotential (figur 1B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig1.jpg"> Figur 1: optisk avbildning av membranpotential som med VSFP-CR. (A) A Schematisk föreställande åtgärden av spänningskänsliga fluorescerande protein VSFP-CR visas. Vid depolarisation av cellmembranet översätter en strukturell ombildning i domänen spänningsavkännande transmembrana till en omorientering av den gröna (GFP) och röd (RFP) fluorescerande protein, öka effektiviteten i de intramolekylära Förster resonans energiöverföringen (bandet). (B) utsläpp spektra av en VSFP vid excitation av GFP i celler på vilande membranpotentialen (övre panelen) och i Aricebo celler (nedre panelen) skildras. Den spektrala ändringen vid depolarisation är överdriven tydlighet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Förändringar i bandet effektivitet spegling växlingarna av membranet potential är avbildade med fluorescens Mikroskop utrustat med en bild-splitter, som skiljer röd och grön fluorescens utsläpp och projekt dem på två angränsande områden i chip av en sCMOS kamera (figur 2). Med denna uppsättning, kan fluorescens utsläpp på två olika våglängd band spelas in samtidigt, vilket gör att beräkningen av en kvot på röd-till-grön fluorescens att återspegla membranet potential i varje bild av en time-lapse serie.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig2.jpg"> Figur 2: konfiguration av bildgivande systemet. De huvudsakliga komponenterna av bildgivande systemet brukade bild spektrala ändringarna av spänningskänsliga fluorescerande protein spegling membran potentiella ändringar på en temporal högupplöst skildras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Uttrycket av VSFP-CR i CMs uppnås genom lentiviral transduktion. För direkt intresseanmälan till undertypen CM, innehåller lentivirus ett arrangören element (den MLC2v förstärkare) som specifikt driver transkription i ventrikulära-liknande iPSC-CMs10. När iPSC-CMs som representerar en blandning av förmaksflimmer-liknande, nodal-liknande och ventrikulära-liknande celler är sensorik med denna lentivirus, uttrycks VSFP-CR endast i ventrikulära-liknande celler. Eftersom den optiska aktionspotential imaging beror på denna fluorescerande sensor, representerar de inspelade handlingspänningar uteslutande CM subtyp av intresse (figur 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig3.jpg"> Figur 3: arrangören-driven VSFP uttryck för subtyp-specifika membran potentiella imaging. (en) Detta schema visar hur hjärtmuskelcellen subtyp-specifika optiska aktionspotential inspelningar uppnås. (b) iPSC-CMs infekterade med en VSFP under kontroll av den ventrikulära-specifika MLC2v-förstärkare visas. Ett uttryck för spänningssensor observeras bara i ventrikulära-liknande CMs i GFP-kanalen (vänster). Faskontrast (mellersta panelen) och överlägg bild (höger panel) finns också. De vita streckade linjerna markerar cellgränserna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#223;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21331046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS(Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16141079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax-I Supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050061</td>
			<td>alternative L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin bovine plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>Worthington Biochem</td>
			<td>LS004174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine Bromide (Polybrene)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9268</td>
			<td>enhancing lentiviral infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 cm glass-bottom microdishes</td>
			<td>MatTek corporation, Ashland, MA, USA</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stand</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DMI6000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope objective</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td colspan="2">HCX PL APO 63x/1.4-0.6 Oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor Technology, Belfast, UK</td>
			<td>Zyla V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope filter cube: excitation filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA</td>
			<td>ET480/40X</td>
			<td>bandpass 480/40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope filter cube: dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA</td>
			<td>T505lpxr</td>
			<td>longpass 505 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter</td>
			<td>&#160;Cairn Research, Faversham, UK</td>
			<td>OptoSplit II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter filter cube: dichroic mirror</td>
			<td>AHF Analysentechnik GmbH, T&#252;bigen, Germany</td>
			<td>568LPXR</td>
			<td>longpass 568 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter filter cube: emission filter 1 (GFP emission)</td>
			<td>AHF Analysentechnik GmbH, T&#252;bigen, Germany</td>
			<td>520/28 BrightLine HC</td>
			<td>bandpass 520/28 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitter filter cube: emission filter 2 (RFP emission)</td>
			<td>AHF Analysentechnik GmbH, T&#252;bigen, Germany</td>
			<td>630/75 ET Bandpass</td>
			<td>bandpass 630/75 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacing inset</td>
			<td>Warner Instruments, Hamden, CT, USA</td>
			<td>RC-37FS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subtype-specific optical action potential recordings in human induced pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes

Hjärtmuskelcellerna genereras från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPSC-CMs) är ett framväxande verktyg i kardiovaskulär forskning. Snarare än att vara en homogen population av celler, iPSC-CMs genereras av nuvarande differentiering protokoll representerar en blandning av celler med ventrikulära-, förmaks-, och nodal-liknande fenotyper, vilket komplicerar fenotypiska analyser. Här presenteras en metod för att optiskt rekord handlingspänningar specifikt från ventrikulära-liknande iPSC-CMs. Detta uppnås genom lentiviral transduktion med en konstruktion där en genetiskt-kodade spänningsindikator är under kontroll av en ventrikulär-specifika promotorn element. När iPSC-CMs är sensorik med denna konstruktion, uttrycks spänningssensor uteslutande i ventrikulära-liknande celler, aktivera subtyp-specifika optiska membran potentiella inspelningar med time-lapse fluorescensmikroskopi.

I figur 4aavbildas en representativ enda iPSC-CM med de vita streckade linjerna märkning ROI dras under bildanalys i på RFP (vänster sida) och kanalen GFP (höger sida). Signalen från RFP kanalen visar en periodisk ökning i fluorescerande intensitet under varje aktionspotential (figur 4b, övre panelen). Som beskrivits i inledningen, beror detta på en ökande bandet som orsakas av förändringar i membranet potential (<stro...

Watch this Scientific Journal Video about Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes at JoVE.com

Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes

Här presenterar vi en metod för att optiskt bild handlingspänningar, särskilt i ventrikulära-liknande inducerade pluripotenta stamceller-derived hjärtmuskelcellerna. Metoden är baserad på arrangören-driven uttrycket av en spänningskänsliga fluorescerande protein.

Subtyp-specifika optiska aktionspotential inspelningar i mänskliga inducerade pluripotenta stamceller-derived ventrikulära hjärtmuskelcellerna

Cardiomyocytes generated from human induced pluripotent stem cells (iPSC-CMs) are an emerging tool in cardiovascular research. Rather than being a ...

Kardiomyocyter som genereras från Induced Pluripotent Stem eller IPS celler används alltmer för att besvara en mängd biologiska frågor inom området hjärt elektrofysiologi. De viktigaste fördelarna med denna teknik är att det möjliggör en dramatisk ökning av genomströmningen samt subtyp specifika åtgärder potentiella inspelningar i ventrikulärt som myocyter, med hjälp av en ventrikulär specifik promotor element. Införandet av genetiskt kodade spänningssensorer genom lentiviral transduktion gör det möjligt att optisk avbildning av human-inducerad pluripotenta stamceller-härledda kardiomyocyter åtgärder potentialer.Börja med att blanda lentivirus-innehållande cellkultur supernatant med cardiomyocyte underhållsmedium, vid ett ett till ett förhållande. Tillsätt hexadimetherine bromid vid en slutlig koncentration av 8 mikrogram per milliliter, för att förbättra infektionen effektivitet. Och ersätta kardiomyocyte underhållsmediet i IPS cell-härledda kardiomyocyter kultur skålen, med infektionsmediet.Kultur de infekterade kardiomyocyter i 12 timmar vid 37 grader Celsius, och ersätta infektionsmediet med färska kardiomyocyter underhållsmedium. Innan bildbehandling, utbyte cellkultur mediet med Tyrode lösning, kompletterad med kalcium. Placera sedan kardiomyocyterna i en bildkammare på scenen av ett inverterat epifluorescensmikroskop utrustat med en bildklyserare.Om elektrisk pacing krävs, installera PACING elektroder i bildbehandlingskammaren och ansluta elektroderna till en stimulus generator. Sätt cellerna i fokus, och lokalisera en cell som uttrycker den genetiskt kodade spänningsindikatorn i mitten av visningsfältet. Ställ in den optiska banan så att det utsända ljuset dras till bilddelaren och växla filterkuben i mikroskopet till den som ska kombineras med filtren i bilddelaren.I programvaran som styr kameran ställer du in anskaffningsinställningen så att höghastighetsavbildning är möjlig, och ställer in bilddelaren enligt tillverkarens anvisningar. De två bilder som representerar de två olika utsläpp våglängd band bör vara intill varandra, var och en upptar ena halvan av bilden. Kontrollera och justera fokus för bilden som produceras av kameran vid behov.Och justera belysningsljusets ljusstyrka så att pixelmättnaden undviks. Ställ in förvärvet av tidsserien, och dämpa ljuset i rummet för att undvika ströljus påverka mätningen. Öppna sedan excitation ljus slutaren och börja förvärvet av bildserien, börjar den elektriska pacing vid lämplig tidpunkt, som experimentellt lämpligt.När förvärvet är klart, stäng excitation ljus slutare vid behov och spara inspelningen till hårddisken. Sedan, lämnar inspelningsinställningen oförändrad, spela in bakgrunden över en region av coverslip utan celler. För analys av den optiska membran potentiella inspelningar, öppna tiff stacken innehåller cellerna i ImageJ, och använda fri-hand urval verktyg för att dra en region av intresse över en fluorescerande kardiomycyt, i den röda kanalen, var noga med att området är tillräckligt stor att cellen inte kommer att flytta ut ur regionen medan upphandlande.Därefter väljer du Analysera, Verktyg, Region Av Intressehanteraren och välj Lägg till T, för att lägga till regionen som Region av intresse 1. Dra regionen av intresse över samma cell i den gröna kanalen, och lägg till den här regionen som Region Av intresse 2. Avmarkera alla alternativ med undantag för medelvärdet för medelvärdet för grå under menyerna Analysera och Ange mått.Klicka på Mer och Multi Measure i intressehanteraren för region för att markera alternativen Mät alla segment och En rad per segment och klicka på OK. Ett fönster öppnas som innehåller ett kalkylblad med de tre raderna. Använd Arkiv och Spara som för att spara kalkylbladet i en kommaavgränsad värdefil. Stäng fönstret med bildstacken och kalkylbladsfönstret utan att stänga fönstret Region av intressehanterare och öppna den tiffstack som innehåller bakgrundsmåttet.I räntehanterarens region klickar du på alternativet Mer och Flera mått för att markera alternativen Mät alla segment och En rad per segment och klicka på OK. Spara sedan bakgrundsdata i en separat csv-fil. Här avbildas en representativ enda IPS-cell-härledda kardiomyocyte med de vita streckade linjerna som markerar de områden av intresse, som dras under bildframställningsanalysen i RFP- och GFP-kanalerna. Signalen från RFP-kanalen visar en periodisk ökning av fluorescerande intensitet under varje åtgärd potential på grund av en ökande forcerad eller resonans energiöverföring som orsakas av förändringar i membranet potential.Concordantly, GFP signal uppvisar en periodisk minskning av fluorescerande intensitet. RFP/GFP-förhållandet är den biologiska signal som används i analyser nedströms, såsom åtgärdspotential varaktighet 50 och 90 mätningar. Till exempel, med hjälp av denna metod, 30-dagars gamla ventrikulärt som IPS cell-härledda kardiomyocyter placeras på 0,5 Hertz, visade en genomsnittlig åtgärd potentiella varaktighet 50 av 439 millisekunder, och en medelåtgärd potentiella varaktighet 90 av 520 millisekunder.Elektrisk stimulering av IPS cell-derived kardiomyocyter på ökande stimulering priser var femte beats, visat en progressiv förkortning av åtgärden potentialer som slå takt ökade. Behandling av den spontant slå IPS cell-härledda kardiomyocyter med isoproternol, en nonselective beta adreno receptor agonist, ledde dessutom till en snabb ökning av svävningsfrekvensen, som skulle kunna ökas ytterligare med ökande doser av agonist. Medan denna metod ger överlägsen genomströmning jämfört med klassiska elektrofysiologiska mätningar, måste man vara medveten om sina begränsningar, inklusive en tidsmässig upplösning som begränsas av de inneboende kinetiska egenskaperna hos fluorescerande spänningssensorn.

Research

JoVE Journal

Biology

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Transfektering och Nucleofecting Human inducerade pluripotenta stamceller

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv Derivering av mänskliga Hjärtat prekursorer och Cardiomyocytes från Pluripotenta mänskliga embryonala stamcellslinjer med liten molekyl Induktion

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Välja och isolera Kolonier av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller omprogrammeras från vuxna fibroblaster

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Omprogrammering Mänskliga somatiska celler in i inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) Använda retroviral vektor med GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

Isolering och Kv Recordings Channel i murina förmaks-och ventrikulära kardiomyocyter

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generering av Human Cardiomyocytes: differentiering protokoll från Feeder-fria mänskliga inducerade pluripotenta stamceller

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Effektiv Generation Human inducerade pluripotenta stamceller från mänskliga somatiska celler med Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

High Efficiency Differentiering av Human pluripotenta stamceller till Cardiomyocytes och karakterisering av flödescytometri

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

Isolering av mänskliga Ventrikulära kardiomyocyter från Vibratome-Cut Myokardial Skivor

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

Automatiserad produktion av humant inducerat Pluripotent Stamcell-derived kortikal och dopaminerga nervceller med integrerad Live-Cell Övervakning

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...