Name: in vitro reconstitution of self-organizing protein patterns on supported lipid bilayers
Uploaded: 2018-07-28T14:45:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers at JoVE.com

Vi takker Michael Heymann og Frank Siedler for produktion af silicium wafers, Core facilitet MPI-B for bistand i protein oprensning og Simon Kretschmer og Leon Harrington for kommentarer til manuskriptet.

<ol>
	<li>Soh, S., Byrska, M., Kandere-Grzybowska, K., Grzybowski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction-diffusion+systems+in+intracellular+molecular+transport+and+control.">Reaction-diffusion systems in intracellular molecular transport and control.</a> Angew Chemie Int Ed. 49 (25), 4170-4198 (2010).</li><li>Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ParA/MinD+family+puts+things+in+their+place.">The ParA/MinD family puts things in their place.</a> Trends Microbiol. 20 (9), 411-418 (2012).</li><li>Shih, Y. -. L., Zheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+control+of+the+cell+division+site+by+the+Min+system+in+Escherichia+coli.">Spatial control of the cell division site by the Min system in Escherichia coli.</a> Environ Microbiol. 15 (12), 3229-3239 (2013).</li><li>Halatek, J., Frey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+canalized+MinD+transfer+and+MinE+sequestration+explain+the+origin+of+robust+MinCDE-protein+dynamics.">Highly canalized MinD transfer and MinE sequestration explain the origin of robust MinCDE-protein dynamics.</a> Cell Rep. 1 (6), 741-752 (2012).</li><li>Raskin, D. M., De Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MinDE-dependent+pole-to-pole+oscillation+of+division+inhibitor+MinC+in+Escherichia+coli.">MinDE-dependent pole-to-pole oscillation of division inhibitor MinC in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 181 (20), 6419-6424 (1999).</li><li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulators+for+bacterial+cell+division+self-organize+into+surface+waves+in+vitro.">Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro.</a> Science. 320 (5877), 789-792 (2008).</li><li>Wu, F., van Schie, B. G. C., Keymer, J. E., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+and+scale+orient+Min+protein+patterns+in+shaped+bacterial+sculptures.">Symmetry and scale orient Min protein patterns in shaped bacterial sculptures.</a> Nat Nanotechnol. 10 (June), 719-726 (2015).</li><li>Hu, Z., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+regulation+of+cell+division+in+E.+coli:+Spatiotemporal+oscillation+of+MinD+requires+stimulation+of+its+ATPase+by+MinE+and+phospholipid.">Topological regulation of cell division in E. coli: Spatiotemporal oscillation of MinD requires stimulation of its ATPase by MinE and phospholipid.</a> Mol Cell. 7 (6), 1337-1343 (2001).</li><li>Meinhardt, H., de Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+Escherichia+coli:+A+model+for+the+pole-to-pole+oscillations+of+Min+proteins+and+the+localization+of+the+division+site.">Pattern formation in Escherichia coli: A model for the pole-to-pole oscillations of Min proteins and the localization of the division site.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (25), 14202-14207 (2001).</li><li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+self-organizing+protein+gradients+as+spatial+cues+in+cell-free+systems.">Reconstitution of self-organizing protein gradients as spatial cues in cell-free systems.</a> Elife. 3, e03949 (2014).</li><li>Roberts, M. A. J., Wadhams, G. H., Hadfield, K. A., Tickner, S., Armitage, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ParA-like+protein+uses+nonspecific+chromosomal+DNA+binding+to+partition+protein+complexes.">ParA-like protein uses nonspecific chromosomal DNA binding to partition protein complexes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (17), 6698-6703 (2012).</li><li>Vecchiarelli, A. G., Mizuuchi, K., Funnell, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfing+biological+surfaces:+Exploiting+the+nucleoid+for+partition+and+transport+in+bacteria.">Surfing biological surfaces: Exploiting the nucleoid for partition and transport in bacteria.</a> Mol Microbiol. 86 (3), 513-523 (2012).</li><li>Thanbichler, M., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MipZ,+a+spatial+regulator+coordinating+chromosome+segregation+with+cell+division+in+Caulobacter.">MipZ, a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter.</a> Cell. 126 (1), 147-162 (2006).</li><li>Lim, H. C., Surovtsev, I. V., Beltran, B. G., Huang, F., Bewersdorf, J., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+DNA-relay+mechanism+in+ParABS-mediated+chromosome+segregation.">Evidence for a DNA-relay mechanism in ParABS-mediated chromosome segregation.</a> Elife. 3, e02758 (2014).</li><li>Mileykovskaya, E., Fishov, I., Fu, X., Corbin, B. D., Margolin, W., Dowhan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+phospholipid+composition+on+MinD-membrane+interactions+in+vitro+and+in+vivo.">Effects of phospholipid composition on MinD-membrane interactions in vitro and in vivo.</a> J Biol Chem. 278 (25), 22193-22198 (2003).</li><li>Renner, L. D., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+microdomains+localize+to+negatively+curved+regions+of+Escherichia+coli+membranes.">Cardiolipin microdomains localize to negatively curved regions of Escherichia coli membranes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (15), 6264-6269 (2011).</li><li>Ivanov, V., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+modes+of+interconverting+dynamic+pattern+formation+by+bacterial+cell+division+proteins.">Multiple modes of interconverting dynamic pattern formation by bacterial cell division proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8071-8078 (2010).</li><li>Caspi, Y., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+out+Min+protein+patterns+in+fully+confined+fluidic+chambers.">Mapping out Min protein patterns in fully confined fluidic chambers.</a> Elife. 5, e19271 (2016).</li><li>Vecchiarelli, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-bound+MinDE+complex+acts+as+a+toggle+switch+that+drives+Min+oscillation+coupled+to+cytoplasmic+depletion+of+MinD.">Membrane-bound MinDE complex acts as a toggle switch that drives Min oscillation coupled to cytoplasmic depletion of MinD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), E1479-E1488 (2016).</li><li>Kretschmer, S., Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+modulation+of+reconstituted+Min+protein+patterns+and+gradients+by+defined+mutations+in+MinE's+membrane+targeting+sequence.">Large-scale modulation of reconstituted Min protein patterns and gradients by defined mutations in MinE's membrane targeting sequence.</a> PLoS One. 12 (6), e0179582 (2017).</li><li>Schweizer, J., Loose, M., Bonny, M., Kruse, K., Monch, I., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometry+sensing+by+self-organized+protein+patterns.">Geometry sensing by self-organized protein patterns.</a> Proc Natl Acad Sci. 109 (38), 15283-15288 (2012).</li><li>Martos, A., Raso, A., Jim&#233;nez, M., Petr&#225;&#353;ek, Z., Rivas, G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+polymers+tethered+to+the+membrane+by+ZipA+are+susceptible+to+spatial+regulation+by+min+waves.">FtsZ polymers tethered to the membrane by ZipA are susceptible to spatial regulation by min waves.</a> Biophys J. 108 (9), 2371-2383 (2015).</li><li>Vecchiarelli, A. G., Li, M., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+affinities+of+MinD+and+MinE+to+anionic+phospholipid+influence+Min+patterning+dynamics+in+vitro.">Differential affinities of MinD and MinE to anionic phospholipid influence Min patterning dynamics in vitro.</a> Mol Microbiol. 93 (3), 453-463 (2014).</li><li>Glock, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+a+biological+reaction-diffusion+system.">Optical control of a biological reaction-diffusion system.</a> Angew Chemie Int Ed. 57 (9), 2362-2366 (2018).</li><li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+pole-to-pole+oscillations+of+min+proteins+in+microengineered+polydimethylsiloxane+compartments.">Reconstitution of pole-to-pole oscillations of min proteins in microengineered polydimethylsiloxane compartments.</a> Angew Chemie Int Ed. 52 (1), 459-462 (2013).</li><li>Miyagi, A., Ramm, B., Schwille, P., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed+Atomic+Force+Microscopy+Reveals+the+Inner+Workings+of+the+MinDE+Protein+Oscillator.">High-Speed Atomic Force Microscopy Reveals the Inner Workings of the MinDE Protein Oscillator.</a> Nano Lett. 18 (1), 288-296 (2017).</li><li>Ramirez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treadmilling+analysis+reveals+new+insights+into+dynamic+FtsZ+ring+architecture.">Treadmilling analysis reveals new insights into dynamic FtsZ ring architecture.</a> PLoS Biol. 16 (5), e2004845 (2018).</li><li>Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+motors+fragment+and+compact+membrane-bound+actin+filaments.">Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments.</a> Elife. 2, e00116 (2013).</li><li>Zieske, K., Schweizer, J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+topology+assisted+alignment+of+Min+protein+waves.">Surface topology assisted alignment of Min protein waves.</a> FEBS Lett. 588 (15), 2545-2549 (2014).</li><li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Herold, C., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Min+protein+patterns+emerge+from+rapid+rebinding+and+membrane+interaction+of+MinE.">Min protein patterns emerge from rapid rebinding and membrane interaction of MinE.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (5), 577-583 (2011).</li><li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+geometry-modulated+protein+patterns+in+membrane+compartments.">Reconstituting geometry-modulated protein patterns in membrane compartments.</a> Methods Cell Biol. 128, 149-163 (2015).</li><li>Gruenberger, A., Probst, C., Heyer, A., Wiechert, W., Frunzke, J., Kohlheyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+picoliter+bioreactor+for+microbial+single-cell+analysis:+fabrication,+system+setup,+and+operation.">Microfluidic picoliter bioreactor for microbial single-cell analysis: fabrication, system setup, and operation.</a> J Vis Exp. (82), e50560 (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Loose, M., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+self-organization:+Lessons+from+the+min+system.">Protein self-organization: Lessons from the min system.</a> Annu Rev Biophys. 40, 315-336 (2011).</li><li>Arumugam, S., Petra&#353;ek, Z., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MinCDE+exploits+the+dynamic+nature+of+FtsZ+filaments+for+its+spatial+regulation.">MinCDE exploits the dynamic nature of FtsZ filaments for its spatial regulation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1192-E1200 (2014).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Vi har beskrevet en protokol for in vitro- rekonstituering af MinCDE selvorganisering på planar støttet lipid dobbeltlag og i lipid tolagede dækket 3D strukturer, med stang-formede PDMS mikrostrukturer eksempel. For at få værdifulde data fra disse assays, er de vigtigste faktorer til kontrol af protein og membran kvalitet.
At sikre protein, protein masse bør bekræftes ved hjælp af SDS-PAGE og massespektrometri. Derudover bør det kontrolleres, at proteiner er opløselige og ikke samlet, ved hjælp af analytisk gel filtrering eller dynamisk lysspredning. Gel filtrering kan bruges til at fjerne eventuelle aggregerede brøkdel af proteiner. Omhyggelig pH justering og kvaliteten af tilsat nukleotider er kritisk, som tilsætning af ikke-justerede eller delvist nedbrudte nukleotid til protein bestande eller selvorganiserende assays er tilstrækkelig til at eliminere protein aktivitet, derfor afskaffe selvorganisering.
Ved siden af protein kvalitet, membran kvalitet er mest kritiske og forkert membran dannelse er oftest årsag til defekte selvorganisering og oprindelsen af artefactual overflade strukturer.
Når du udfører protokollen for første gang, er det nyttigt at mærke understøttet lipid dobbeltlag af herunder mærket lipider som Atto-655-DOPE eller DiI på lav kindtand procent (0,05%). Dermed kan egenskaber og kvalitet af membranen bedømmes direkte. Bruger FRAP, kan bevægeligheden på membranen vurderes. Desuden kan en direkte vurdere kvaliteten af vask af SLB, som der vil enten være for mange blærer, ingen væske membran eller ingen membran på alle, hvis det er blevet vasket. Den åbne afdeling tilgang gør det muligt at grundigt vaske membranen, og dermed også at fjerne blærer, som holder fast på overfladen af SLB. De mest afgørende faktorer for at opnå væske og homogen understøttede lipid dobbeltlag er rengøring og hydrofiliciteten support overflade og den korrekte størrelse og homogenitet af SUvs kan det være nyttigt at kontrollere SUV størrelse og størrelse distribution ved hjælp af dynamisk lysspredning. For smalle størrelse distributioner anbefaler vi strengpresning af vesikler i stedet sonicating dem. Andre metoder til rengøring coverslips, fx behandlinger med stærke baser, grundlæggende rengøringsmidler eller ved hjælp af coverslips direkte efter skylning med vand, kan give gode resultater, afhængigt af anvendelse og lipid blandingen.
Den første halvdel af protokollen præsenteres her, in vitro- rekonstitution på planar understøttede lipid dobbeltlag i åbne kamre, har fordelen for præstationen overfladen tilgængeligt for optisk microscopies, såsom JOHANNAS mikroskopi30, FRAP analyse6, enkelt-partikel tracking34, samt overflade probe teknikker såsom atomic force mikroskopi26. Det store homogene område giver mulighed for bedre statistikker på definerede koncentrationer. Desuden åbent kammer tilgang gør det muligt at netop kontrol proteinkoncentration og en hurtig og enkel tilføjelse af yderligere komponenter, dermed tillade for at titrere proteinkoncentration i en enkelt afdeling20. Analysen kan også udvides ved tilsætning af andre bakterielle divisome komponenter såsom FtsZ22,35, ZipA22 eller kimære protein FtsZ-YFP-MTS10,35.
Andre grupper har taget en lignende tilgang til at retablere Min system i vitro, men brug en flow-celle i stedet for en åben afdeling17,18,19. Flow-celler har visse fordele, navnlig når en fuldstændig lukket 3D miljø er nødvendige18, påvirkning af flow17,19,23 eller membran sammensætning23 på MinCDE mønstre undersøgt, eller hvis protein mønstre at være observeret under protein begrænsende betingelser19. Ikke desto mindre, lokale kontrol med fusioner og molekylær er vanskeligere. Proteinkomponenter, især sind, stærkt binder sig til membranen de første møde18,19. Vores erfaring udviser proteinerne ofte ikke-specifik binding til slanger, fjorde, sprøjter og andre mikrofluid dele. Derfor, lokale protein koncentrationer afviger fra input koncentrationer18 og også variere over længden af den flow-celle, hvilket resulterer i en række forskellige protein mønstre på membranen mellem indsugnings- og udstødningsporte, som bemærket af andre19.
Den anden halvdel af protokollen præsenteres her, in vitro- rekonstituering i stavformet mikrostrukturer igen ved hjælp af metoden open kammer på en mønstret støtte omfattet af lipid dobbeltlag giver mulighed for en simpel efterligner i vivo protein adfærd selv om præcis kontrol over protein koncentrationer er tabt på grund af buffer fjernelse. Bemærk, at fordi bølgelængde af MinDE om en størrelsesorden større i vitro end in vivo stavformet microcompartments er også om en størrelsesorden større (10 x 30 µm) end en stavformet E. coli celle.
Samlet set denne protokol giver mulighed for præcis kontrol af alle betingelser herunder proteinkoncentration, buffer sammensætning og membran egenskaber. Brugen af 3D struktureret understøtter muliggør reaktion studeres under rumlige indeslutning, efterligne i vivo adfærd uden behov for komplekse mikrofluidik udstyr.

Spatiotemporelle mønstre er afgørende i naturen, regulering af komplekse opgaver både på de flercellede og cellulære niveau, fra morfogenese til regulerede celledeling1,2. Reaktion-diffusion systemer spiller en vigtig rolle ved fastlæggelsen af disse mønstre, men er stadig ikke godt forstået. Et godt eksempel på en reaktion-diffusion system og de bedst karakteriserede biologiske system er hidtil Escherichia coli MinCDE system3,4,5,6,7. MinCDE systemet svinger fra celle pole til celle pol i E. coli til at bestemme i midten af cellen som fremtidige division site. Dette system er baseret på ATPase sind, ATPase aktivering protein minen, og membran som en fysisk reaktion matrix8. MinC er ikke en del af mønster formation mekanisme, men er den faktiske funktionelle agent: en hæmmer af vigtigste divisome protein FtsZ5,6. MinC binder sig til sind og derfor følger svingningerne, hvilket resulterer i en tid-gennemsnit protein koncentration forløb, der er maksimal ved celle polerne og minimal på midten celle kun tillader FtsZ at polymerisere på midcell9,10 . MinCDE systemet er en del af den større familie af Walker A ATPases der er nøglen til den spatiotemporelle organisation i bakterier2, til positionering og transport af protein komplekser11 og plasmider12 og regulerer celle division13 og kromosom segregation14. Derfor MinCDE reaktion-diffusion systemet ikke kun repræsenterer en arketypisk reaktion-diffusion system, men har også tiltrukket sig opmærksomhed på grund af dets relevans for den spatiotemporelle organisation i bakterier.
Detaljerede funktionelle studier af MinCDE system i vivo er kompliceret, da manipulation af proteiner og gen sletning typisk resultere i celledeling defekter. Desuden ændrer membran sammensætning eller egenskaber i cytosol i vivo er meget udfordrende15,16. Ændringer i systemet og påvirke faktorer er svære at fortolke i det komplekse miljø i cellen, endnu mere så hvis det er forstyrret i sådan en afgørende funktion som celledeling. Vi og andre har derfor vendt til en in vitro- rekonstitution tilgang, reducerer systemet til sin kernekomponenter: sind, MinE, ATP som energikilde, og understøttede lipid tolagede som en reaktion matrix6,17, 18. denne bottom-up-tilgang giver mulighed for at sonde mekanisme af selvorganisering i detaljer uden kompleksiteten af en levende celle. Formen proteiner rejser overflade bølger6 og andre former for mønstre17,19 under disse betingelser, omend med en bølgelængde der er som regel om en størrelsesorden større end in vivo. Brugen af en åben kammer letter præcis kontrol over alle aspekter påvirker mønster dannelse: protein koncentrationer6, protein egenskaber20, membran sammensætning10, buffer sammensætning og ATP koncentrationen 6, såvel som tilføjelsen af andre faktorer såsom fortrængning agenter21 og andre divisome proteiner22. I sammenligning, kan in vitro- rekonstituering af MinCDE systemet i en flow-celle18,19,23 bruges til at probe indflydelse af flow17,23, protein begrænsende betingelser19, membran sammensætning19 og fuld 3D indespærring18 på protein mønstre, men gengiver en nøjagtig kontrol af protein/komponent koncentration og sekventiel komponent desuden meget mere kompliceret.
Bruger åben her, vi også mønstrede støtte af planar lipid dobbeltlag som kan en sonde hvordan geometriske grænser indflydelse mønster dannelse21, et fænomen, der har for nylig også blevet undersøgt i vivo ved hjælp af bakterier støbt ind mikrostrukturer7. Vi har også ansat denne analyse at undersøge hvordan definerede mutationer i MinE påvirker mønster dannelsen af system20. Endvidere, de samme grundlæggende assay format har været ansat til at undersøge, hvordan mønster dannelse kan kontrolleres af lys, at indføre en azobenzen-crosslinked minen peptid i analysen, og imaging med JOHANNAS mikroskopi24.
Vi har fundet, at for at replikere MinDE mønster konstateret dannelse, i vivo i en in vitro- system, nedkomst var nøglen. Ved hjælp af stang-formede microcompartments, med dimensioner tilpasses den større bølgelængde af MinDE i vitro (10 x 30 µm), beklædt med en understøttet lipid tolagede tilladt rekonstituering af MinDE Pol til pol svingninger og protein gradient dannelsen 10,25. I denne analyse, er understøttede lipid dobbeltlag deponeret på en mønstret PDMS substrat, der indeholder flere hundrede reproduktioner af stang-formede microcompartments at forbliver åben på toppen. Af dette, reaktionen kan sættes op i en åben kammer, og efterfølgende bufferen er sænket til randen af microcompartments, dermed begrænser reaktion på en lille mængde. Selv om disse rum har en luft-buffer interface på den ene side og dermed ikke repræsenterer en fuld 3D indespærring af membran, efterlignede protein dynamikken i vivo svingninger10,25. Sammenlignet med fuld 3D indespærring, som viser meget lignende resultater18, åben mikrostrukturer assay er relativt enkel og let at håndtere og kan også udføres af laboratorier, der ikke er udstyret med specialiserede mikrofluidik udstyr og rense-værelsesfaciliteter.
Her præsenterer vi en forsøgsplan for erstatningsgodtgørelse MinCDE mønster dannelse på understøttede lipid dobbeltlag i vitro ved hjælp af en åben kammer, der giver mulighed for kontrol af alle komponenter og nem adgang af Optisk mikroskopi og med mindre ændringer, kan også tilpasses for overflade-probe teknikker26. Ved siden af planar understøttede lipid dobbeltlag, viser vi også, hvordan protein indespærring kan være fremstillet ved hjælp af simple mønstrede understøttede lipid dobbeltlag på stavformet PDMS mikrostrukturer. Disse assays, kan Selvom optimeret til MinCDE systemet, også blive overført til andre protein-systemer, der interagerer på en lignende måde med membran, som FtsZ27 eller en minimal actin cortex28.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPG</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli polar lipid extract</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>100600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt trihydrate</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-diphosphate monopotassium salt dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5285-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27810.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9277.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCl</td>
			<td>Termo Fisher Scientific</td>
			<td>20491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Diamine Tetraacetate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.08418.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid 98%</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>173163.1611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide 50%</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>147064.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>05288.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102950</td>
			<td>Uvasol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol 86%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2316.x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atto-655-DOPE</td>
			<td>Atto Tec</td>
			<td>AD 655-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS base</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td></td>
			<td>SYLGARD 184</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS crosslinker</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Glue</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>6801</td>
			<td>#68 and #63 both work well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips #1.5 24x24 mm</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips #1 24x24 mm</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td></td>
			<td>used only for PDMS microstructures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml reaction tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;0030123301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>culture flask 2L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>e.g. 734-1905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-Trap HP</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfiltration column: HiLoad Superdex 75 PG or 200 PG</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac 10DG desalting column prepacked column</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7322010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis device: Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 0.1 - 0.5 mL or 0.5-3 mL</td>
			<td>Termo Fisher Scientific</td>
			<td>66333 or 66330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>razor blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure water: Milli-Q Type 1 Ultrapure Water Systems</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>automated protein purification system: &#196;kta Pure</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bath sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td>e.g. Model 1510</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARE-250 mixer</td>
			<td>Thinky Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner Zepto</td>
			<td>Diener electronic</td>
			<td></td>
			<td>use oxygen as process gas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>positive displacement pipettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td></td>
			<td>Transferpettor models with glass tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM780 confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Fitted with Zeiss C-Apochromat 40X/1.20 water-immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28a-His-MinD_MinE</td>
			<td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td>
			<td></td>
			<td>plasmid encoding His-MinD and non-tagged MinE to improve yield</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28a-His-MinE</td>
			<td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td>
			<td></td>
			<td>plasmid encoding His-MinE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28a-His-EGFP-MinD</td>
			<td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td>
			<td></td>
			<td>plasmid encoding His-EGFP-MinD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28a-His-mRuby3-MinD</td>
			<td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td>
			<td></td>
			<td>plasmid encoding His-mRuby3-MinD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28a-His- MinC</td>
			<td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td>
			<td></td>
			<td>plasmid encoding His-MinC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro reconstitution of self-organizing protein patterns on supported lipid bilayers

Mange aspekter af det grundlæggende spatiotemporelle organisation af celler er underlagt reaktion-diffusion type systemer. In vitro rekonstituering af sådanne systemer giver mulighed for detaljerede undersøgelser af deres underliggende mekanismer, hvilket ikke ville være muligt in vivo. Her, leverer vi en protokol for in vitro- rekonstituering af MinCDE systemet af Escherichia coli, som placerer celledeling septum i celle midten. Analysen er designet til at levere kun de nødvendige komponenter til selvorganisering, nemlig en membran, de to proteiner sind og MinE og energi i form af ATP. Vi fabrikere derfor en åben reaktionskammeret på en coverslip, hvor en understøttet lipid tolagede er dannet. Det åbne design af kammeret giver mulighed for optimal forberedelse af lipid tolagede og kontrolleret manipulation af bulk indhold. De to proteiner, sind og MinE, samt ATP, føjes derefter til bulk volumen over membranen. Tænkelig er muligt ved mange optisk microscopies, som design understøtter Konfokal, wide-felt og JOHANNAS mikroskopi ens. I en variation af protokollen, er lipid tolagede dannet på en mønstret støtte på celle-formet PDMS mikrostrukturer, i stedet for glas. Sænke bulk løsning til randen af disse rum omslutter reaktionen i et mindre rum og giver grænser, der giver mulighed for efterligne i vivo oscillerende adfærd. Taget sammen, beskriver vi protokoller for at rekonstruere MinCDE systemet både med og uden rumlige indeslutning, giver forskerne at præcist styre alle aspekter påvirker mønster dannelse, som koncentrationsintervaller og tilsætning af andre faktorer eller proteiner, og at systematisk øge systemkompleksitet i en relativt simpel eksperimentel opsætning.

Protein oprensning efter vores protokol bør give Min proteiner af passende renhed. Som reference indeholder figur 1 en SDS-PAGE billede af sindet, fluorescently mærket sind, MinE, og MinC. De enkelte trin i proceduren til at udføre en MinDE selvorganisering assay på ikke-mønstrede understøttede lipid dobbeltlag er beskrevet i figur 2. Ved hjælp af denne protokol, kan regelmæssigt MinDE rejser overflade bølger iagttages i hele salen (figur 3). Bølgelængden kan variere lidt i kammeret, men generelt mønstre ligne. Kanterne af salen bør ikke anvendes til kvantitativ sammenligninger, som membraner, form på UV-lim synes at have andre egenskaber end på glasset overfladen (Se figur 3 c). De omrejsende overflade bølger kan analyseres ved at plotte intensitet langs formering retning (figur 3B). Mens tankerne fluorescens plateauer temmelig hurtigt fra forkanten af bølgen og derefter kraftigt falder på bagkanten, MinE fluorescens øger næsten lineært fra starten af MinD wave og når sit maksimum efter sind på bagkanten, hvor det falder af markant6.
Ved siden af protein kvalitet er kvaliteten af understøttede lipid dobbeltlag mest kritiske for en regelmæssig selv-organisering af MinCDE. På den ene side hvis membranen er vasket for overdrevent eller den underliggende overflade er blevet renset og dermed opkrævet alt for stærkt, huller kan danne i membranen (figur 6A, top). På den anden side hvis membranen ikke er vaskede ordentligt eller den underliggende flade er ikke renset/hydrophilized, blærer vil holde sig til membranen eller membran fluiditet vil blive kompromitteret (figur 6A, nederst). Selv om ikke så synlige som når observere membran direkte via mærket lipider, disse problemer kan også påvises fra sind fluorescens signal, som mønstre er ikke regelmæssig og fluorescens i maxima er ikke homogene, men indeholder "huller" eller lyse pletter som vist i det midterste panel af figur 6A.
For MinDE selvorganisering i stavformet PDMS mikrostrukturer er proceduren sammenfattet i figur 4. Flere protokollen trin behøver ikke at blive gentaget, som proteiner og lipider kan genbruges. Som på ikke-mønstrede underlag, underlaget er renset og hydrophilized (af plasma-rengøring), en understøttet lipid tolagede er dannet på PDMS og selvorganisering assay er sat op i et volumen på 200 µL. For at kontrollere, at en ordentlig membran har dannet og MinDE selv arrangerer på membranen, er kamrene afbildet. Når en ordentlig membran er blevet dannet, MinDE former regelmæssige rejser overflade bølger på overfladen af PDMS mellem de enkelte mikrostrukturer og også selv arrangerer på bunden af mikrostrukturer som bølgerne kan frit flytte over hele membran-dækket overflade (figur 5A). Efter buffer fjernelse vise overflade mellem rum ikke nogen formeringsmaterialets MinDE mønstre (figur 5B), som det skal være helt tør. Hvis MinDE mønstre er stadig bevæger sig, skal flere buffer fjernes. Proteinerne er nu er begrænset i den stang-formede microcompartments af membran-klædte PDMS og luft på den øvre grænseflade (figur 5 c), hvor de selv organiserer. Disse betingelser kan de to proteiner udføre Pol til pol svingninger, som vist i figur 5 d. Som en brøkdel af sind og MinE er altid membran-bundet, også kan under buffer fjernelse, koncentrationer efter buffer fjernelse ikke sammenlignes med input koncentrationer. På grund af denne effekt variere koncentrationerne også mellem individuelle mikrostrukturer på den samme coverslip som de afhænger af placeringen af mønstre før buffer fjernelse. Silicium wafer produktionen eller PDMS molding fra silicon wafer kan resultere i ufuldstændig mikrostrukturer, der ikke kan bruges til analyse (fig. 6B). Desuden, på grund af bufferen fjernelse mikrostrukturer kan tørre ud under processen, og derfor bør udelukkes fra yderligere analyse (fig. 6B). Som et resultat viser kun en brøkdel af mikrostrukturer i ét kammer de ønskede Pol til pol svingninger. For at analysere protein dynamik i mikrostrukturer, kan en kymograph opnås ved at trække en markering over hele strukturen (figur 5E). Når MinCDE svinger fra Pol til pol, vil MinC og sind vise en tid i gennemsnit koncentration gradient med maksimal koncentration på rum polakker og minimal koncentration i midten af rummet (figur 5F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig1.jpg"> Figur 1: SDS-PAGE viser de endelige produkter af protein purifications. Hans sind (33.3 kDa), hans-eGFP-sind (60,1 kDa), hans-mRuby3-sind (59.9 kDa), hans-minen (13,9 kDa) og hans-MinC (28,3 kDa) er vist i rækkefølge. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig2.jpg"> Figur 2: proces flow diagram viser de enkelte trin og timing af protokollen til en selvstændig organisation på ikke-mønstrede understøttede lipid dobbeltlag (trin 1-6). Stiplede bokse angiver, at en af disse to muligheder kan bruges til rengøring. Pilene mærket af cirkler angiver hvor protokollen kan pause og genoptages senere. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig3.jpg"> Figur 3: Imaging af MinDE assay af konfokalmikroskopi. A) regelmæssig Min spiral, fra hvilke bølge formering hastighed, intensitet plot og hastighed målinger kan fås. Koncentrationerne anvendes: 0,6 µM sind (30% eGFP-sind), 1,8 hans µM MinE (30% hans-MinE-Alexa647) B) eksempel normaliseret intensitet plot for området markeret i A. C) overblik over hele analysen kammer (skalalinjen: 1 mm, samme protein koncentrationer som ovenfor). Spiraler dreje begge retninger samt target mønstre kan observeres. Det forstørrede område viser, hvordan bølge mønstre er forskellige på UV-lim. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig4.jpg"> Figur 4: proces flow diagram viser de enkelte trin og timing af protokollen til selvorganisering i stavformet mikrostrukturer (trin 1-5, 7, 8). Grå bokse angiver trin hvor produkter kan genbruges fra protokollen på ikke-mønstrede understøttede lipid dobbeltlag. Pilene mærket af cirkler angiver hvor protokollen kan pause og genoptages senere. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig5.jpg"> Figur 5: repræsentative resultater for MinDE mønster dannelse i stavformet PDMS microcompartments. A) MinDE selv organisere på overfladen af PDMS danner rejser overflade bølger (1 µM sind (30% EGFP-sind), 2 µM MinE og 2,5 mM ATP). B) efter bufferen er sænket til højden af mikrostrukturer, protein selvorganisering stopper på den plane overflade mellem microcompartments. C) skematisk af en stang-formede microcompartment. D) repræsentative billeder af MinDE Pol til pol svingninger efter buffer fjernelse. E) Kymograph af svingninger langs den markerede linje vist i D). F) Image og profil af gennemsnitlige fluorescens-intensiteten af tidsserierne vist i D) tydeligt viser den protein forløb, der er maksimal ved microcompartment poler og minimal på rum midten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig6.jpg"> Figur 6: eksempler på negative eksperimentelle resultater. A) over vasket membraner ophobes huller, mens suboptimal vesikel præparater og lipid kompositioner føre til stikning vesikler. To center panelerne viser en kombination af både problemer og hvordan de bliver synlige, når observeret Min svingninger. Membraner var mærket med 0,05% Atto655-DOPE. (skala barer: 50 µm) B) øverste panel: tørret ud microcompartments kan være forårsaget af for meget buffer fjernelse eller når bufferen fordamper med tiden. Bundpanelet: ufuldstændige rum kan være dannet under wafer produktionen eller PDMS støbning. (skala barer: 30 µm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig6large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Supplerende fil 1: Plasmid kort for hans sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/01_pET28a-MinD-MinE.gb%20" target="_blank">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende fil 2: Plasmid kort for hans-EGFP-sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/02_pET28a-EGFP-MinD.gb" target="_blank">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende fil 3: Plasmid kort for hans-mRuby3-sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/03_pET28a-mRuby3-MinD.gb" target="_blank">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende fil 4: Plasmid kort for hans-minen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/04_pET28a-MinE.gb" target="_blank">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende fil 5: Plasmid kort for hans MinC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/05_pET28a-MinC.gb" target="_blank">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende fil 6: CAD-filen for silicium plade af stang-formede microcompartments. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/JoVe_wafer_rod-like-structures_3x3.dwg" target="_blank">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers at JoVE.com

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Vi leverer en protokol for in vitro- selvorganisering assays af sind og MinE på en understøttet lipid tolagede i en åben kammer. Desuden, beskriver vi, hvordan du omslutte analysen i lipid-klædte PDMS microcompartments at efterligne i vivo betingelser ved reaktion indeslutning.

In Vitro Rekonstituering af selvstændige organisering Protein mønstre på understøttede Lipid dobbeltlag

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Brug Stillads Liposomer at Rekonstituer Lipid-proksimal protein-protein interaktioner<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrosprayioniserings Brint-deuterium Exchange-massespektrometri til at studere proteiners struktur og Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

In Vitro Polymerisering af F-actin på tidlig Endosomes

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Vaskemiddel-fri ultrahurtig rekonstituering af membranproteiner i Lipid dobbeltlag ved hjælp af Fusogenic komplementære-ladet Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rensning og rekonstituering af TRPV1 for spektroskopisk analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Antistatiske Microgravimetry at studere bindende dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til fast-understøttet Lipid dobbeltlag ved hjælp af et Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse af proteinfoldning, Transport og nedbrydning i levende celler af radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Vaskemiddel-assisteret rekonstitution af rekombinant Drosophila Atlastin til Liposomer til lipid-blanding assays

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Anvendelse af mikroskala termoforese til måling af protein-lipid interaktioner

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolering af aktiv caenorhabditis elegans nukleare ekstrakt og rekonstitution for In Vitro Transskription

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...