Name: in vitro reconstitution of self-organizing protein patterns on supported lipid bilayers
Uploaded: 2018-07-28T14:45:00
Duration: 8 min 10 s
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हम सिलिकॉन वेफर्स के उत्पादन के लिए माइकल Heymann और फ्रैंक Siedler धंयवाद, कोर सुविधा MPI-बी में सहायता के लिए प्रोटीन शुद्धि और साइमन Kretschmer और लियोन Harrington पांडुलिपि पर टिप्पणी के लिए ।

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	<li>Soh, S., Byrska, M., Kandere-Grzybowska, K., Grzybowski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction-diffusion+systems+in+intracellular+molecular+transport+and+control.">Reaction-diffusion systems in intracellular molecular transport and control.</a> Angew Chemie Int Ed. 49 (25), 4170-4198 (2010).</li><li>Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ParA/MinD+family+puts+things+in+their+place.">The ParA/MinD family puts things in their place.</a> Trends Microbiol. 20 (9), 411-418 (2012).</li><li>Shih, Y. -. 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G., Huang, F., Bewersdorf, J., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+DNA-relay+mechanism+in+ParABS-mediated+chromosome+segregation.">Evidence for a DNA-relay mechanism in ParABS-mediated chromosome segregation.</a> Elife. 3, e02758 (2014).</li><li>Mileykovskaya, E., Fishov, I., Fu, X., Corbin, B. D., Margolin, W., Dowhan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+phospholipid+composition+on+MinD-membrane+interactions+in+vitro+and+in+vivo.">Effects of phospholipid composition on MinD-membrane interactions in vitro and in vivo.</a> J Biol Chem. 278 (25), 22193-22198 (2003).</li><li>Renner, L. D., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+microdomains+localize+to+negatively+curved+regions+of+Escherichia+coli+membranes.">Cardiolipin microdomains localize to negatively curved regions of Escherichia coli membranes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (15), 6264-6269 (2011).</li><li>Ivanov, V., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+modes+of+interconverting+dynamic+pattern+formation+by+bacterial+cell+division+proteins.">Multiple modes of interconverting dynamic pattern formation by bacterial cell division proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8071-8078 (2010).</li><li>Caspi, Y., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+out+Min+protein+patterns+in+fully+confined+fluidic+chambers.">Mapping out Min protein patterns in fully confined fluidic chambers.</a> Elife. 5, e19271 (2016).</li><li>Vecchiarelli, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-bound+MinDE+complex+acts+as+a+toggle+switch+that+drives+Min+oscillation+coupled+to+cytoplasmic+depletion+of+MinD.">Membrane-bound MinDE complex acts as a toggle switch that drives Min oscillation coupled to cytoplasmic depletion of MinD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), E1479-E1488 (2016).</li><li>Kretschmer, S., Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+modulation+of+reconstituted+Min+protein+patterns+and+gradients+by+defined+mutations+in+MinE's+membrane+targeting+sequence.">Large-scale modulation of reconstituted Min protein patterns and gradients by defined mutations in MinE's membrane targeting sequence.</a> PLoS One. 12 (6), e0179582 (2017).</li><li>Schweizer, J., Loose, M., Bonny, M., Kruse, K., Monch, I., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometry+sensing+by+self-organized+protein+patterns.">Geometry sensing by self-organized protein patterns.</a> Proc Natl Acad Sci. 109 (38), 15283-15288 (2012).</li><li>Martos, A., Raso, A., Jim&#233;nez, M., Petr&#225;&#353;ek, Z., Rivas, G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+polymers+tethered+to+the+membrane+by+ZipA+are+susceptible+to+spatial+regulation+by+min+waves.">FtsZ polymers tethered to the membrane by ZipA are susceptible to spatial regulation by min waves.</a> Biophys J. 108 (9), 2371-2383 (2015).</li><li>Vecchiarelli, A. G., Li, M., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+affinities+of+MinD+and+MinE+to+anionic+phospholipid+influence+Min+patterning+dynamics+in+vitro.">Differential affinities of MinD and MinE to anionic phospholipid influence Min patterning dynamics in vitro.</a> Mol Microbiol. 93 (3), 453-463 (2014).</li><li>Glock, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+a+biological+reaction-diffusion+system.">Optical control of a biological reaction-diffusion system.</a> Angew Chemie Int Ed. 57 (9), 2362-2366 (2018).</li><li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+pole-to-pole+oscillations+of+min+proteins+in+microengineered+polydimethylsiloxane+compartments.">Reconstitution of pole-to-pole oscillations of min proteins in microengineered polydimethylsiloxane compartments.</a> Angew Chemie Int Ed. 52 (1), 459-462 (2013).</li><li>Miyagi, A., Ramm, B., Schwille, P., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed+Atomic+Force+Microscopy+Reveals+the+Inner+Workings+of+the+MinDE+Protein+Oscillator.">High-Speed Atomic Force Microscopy Reveals the Inner Workings of the MinDE Protein Oscillator.</a> Nano Lett. 18 (1), 288-296 (2017).</li><li>Ramirez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treadmilling+analysis+reveals+new+insights+into+dynamic+FtsZ+ring+architecture.">Treadmilling analysis reveals new insights into dynamic FtsZ ring architecture.</a> PLoS Biol. 16 (5), e2004845 (2018).</li><li>Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+motors+fragment+and+compact+membrane-bound+actin+filaments.">Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments.</a> Elife. 2, e00116 (2013).</li><li>Zieske, K., Schweizer, J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+topology+assisted+alignment+of+Min+protein+waves.">Surface topology assisted alignment of Min protein waves.</a> FEBS Lett. 588 (15), 2545-2549 (2014).</li><li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Herold, C., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Min+protein+patterns+emerge+from+rapid+rebinding+and+membrane+interaction+of+MinE.">Min protein patterns emerge from rapid rebinding and membrane interaction of MinE.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (5), 577-583 (2011).</li><li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+geometry-modulated+protein+patterns+in+membrane+compartments.">Reconstituting geometry-modulated protein patterns in membrane compartments.</a> Methods Cell Biol. 128, 149-163 (2015).</li><li>Gruenberger, A., Probst, C., Heyer, A., Wiechert, W., Frunzke, J., Kohlheyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+picoliter+bioreactor+for+microbial+single-cell+analysis:+fabrication,+system+setup,+and+operation.">Microfluidic picoliter bioreactor for microbial single-cell analysis: fabrication, system setup, and operation.</a> J Vis Exp. (82), e50560 (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Loose, M., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+self-organization:+Lessons+from+the+min+system.">Protein self-organization: Lessons from the min system.</a> Annu Rev Biophys. 40, 315-336 (2011).</li><li>Arumugam, S., Petra&#353;ek, Z., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MinCDE+exploits+the+dynamic+nature+of+FtsZ+filaments+for+its+spatial+regulation.">MinCDE exploits the dynamic nature of FtsZ filaments for its spatial regulation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1192-E1200 (2014).</li></ol>

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

हम में इन विट्रो पुनर्गठन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया है MinCDE स्वयं संगठन पर planar समर्थित लिपिड bilayers और लिपिड bilayer में 3d संरचनाओं को कवर, रॉड का उदाहरण के आकार का उपयोग कर PDMS microstructures. आदेश में इन परख से मूल्यवान डेटा प्राप्त करने के लिए, सबसे महत्वपूर्ण कारकों को नियंत्रित करने के लिए प्रोटीन और झिल्ली की गुणवत्ता हैं ।
प्रोटीन की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए, प्रोटीन मास एसडीएस-पृष्ठ और मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग कर पुष्टि की जानी चाहिए । इसके अलावा, यह सत्यापित किया जाना चाहिए कि प्रोटीन घुलनशील और एकत्रित नहीं कर रहे हैं, विश्लेषणात्मक जेल निस्पंदन या गतिशील प्रकाश बिखरने का उपयोग करके । जेल निस्पंदन प्रोटीन के किसी भी एकत्रित अंश को दूर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । सावधान पीएच समायोजन और जोड़ा गया न्यूक्लियोटाइड की गुणवत्ता महत्वपूर्ण है, के अलावा के रूप में गैर समायोजित या आंशिक रूप से नीचा न्यूक्लियोटाइड प्रोटीन स्टॉक या आत्म-आयोजन परख करने के लिए प्रोटीन गतिविधि को खत्म करने के लिए पर्याप्त है, इसलिए समाप्त स्व संगठन ।
प्रोटीन की गुणवत्ता के बगल में, झिल्ली की गुणवत्ता सबसे महत्वपूर्ण है, और अनुचित झिल्ली गठन अक्सर दोषपूर्ण स्वयं संगठन और artefactual सतह संरचनाओं के मूल के लिए कारण है ।
पहली बार के लिए प्रोटोकॉल प्रदर्शन करते हैं, यह कम दाढ़ प्रतिशत (०.०५%) में एटो-६५५-डोप या दिी के रूप में लेबल लिपिड सहित द्वारा समर्थित लिपिड bilayers लेबल करने के लिए उपयोगी है । जिससे गुणों और झिल्ली की गुणवत्ता पर सीधे न्याय किया जा सकता है. frap है का प्रयोग, झिल्ली की तरलता का आकलन किया जा सकता है । इसके अलावा, एक सीधे SLB की धुलाई की गुणवत्ता का आकलन कर सकते हैं, के रूप में वहाँ भी कई बुलबुले हो जाएगा, कोई द्रव झिल्ली, या सभी पर कोई झिल्ली, अगर यह बंद धोया गया है. खुला चैंबर दृष्टिकोण कड़ाई से झिल्ली धोने के लिए अनुमति देता है, और इसलिए भी बुलबुले कि SLB की सतह पर चिपके हुए है हटाने के लिए । द्रव और समरूप समर्थित लिपिड bilayers प्राप्त करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कारकों की सफाई और समर्थन सतह के hydrophilicity और सही आकार और सुबनाम की सजातीयता यह एसयूवी आकार और आकार वितरण की जांच करने के लिए सहायक हो सकता है का उपयोग कर गतिशील प्रकाश बिखरने । संकीर्ण आकार वितरण के लिए, हम उंहें sonicating के बजाय बुलबुले बाहर निकालना सलाह देते हैं । coverslips सफाई के अंय तरीकों, जैसे, मजबूत कुर्सियां, बुनियादी डिटर्जेंट, या पानी के साथ धोने के बाद सीधे coverslips का उपयोग कर के साथ उपचार, अच्छे परिणाम उपज सकते हैं, आवेदन और लिपिड मिश्रण पर निर्भर करता है ।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल की पहली छमाही, इन विट्रो में खुले कक्षों में planar समर्थित लिपिड bilayers पर पुनर्गठन, ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के लिए सुलभ सतह प्रतिपादन का लाभ है, इस तरह के TIRF माइक्रोस्कोपी के रूप में30, frap है विश्लेषण6, एकल कण३४ट्रैकिंग, साथ ही साथ सतह जांच तकनीक जैसे परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी26। बड़े सजातीय क्षेत्र परिभाषित सांद्रता में बेहतर आंकड़ों के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा खुले चैंबर दृष्टिकोण को ठीक प्रोटीन एकाग्रता और आगे घटकों के एक तेजी से और सरल इसके अलावा, इसलिए एक एकल कक्ष20में अनुमापन प्रोटीन एकाग्रता की अनुमति के नियंत्रण की अनुमति देता है । परख भी FtsZ22,३५, ZipA22 या chimeric प्रोटीन FtsZ-YFP-MTS10,३५के रूप में अंय बैक्टीरियल divisome घटकों के अलावा द्वारा विस्तारित किया जा सकता है ।
अंय समूहों में इन विट्रो मेंंयूनतम प्रणाली का पुनर्गठन करने के लिए एक समान दृष्टिकोण ले लिया है, लेकिन एक प्रवाह सेल के बजाय एक खुले चैंबर17,18,19का उपयोग करें । प्रवाह कोशिकाओं को कुछ लाभ है, विशेष रूप से जब एक पूरी तरह से संलग्न 3 डी वातावरण की जरूरत है18, प्रवाह के प्रभाव17,19,23 या MinCDE पैटर्न पर झिल्ली23 रचना है जांच की है, या यदि प्रोटीन पैटर्न के तहत मनाया जा रहा है प्रोटीन शर्तों19सीमित । फिर भी, आणविक सांद्रता के स्थानीय नियंत्रण और अधिक कठिन है । प्रोटीन अवयव, विशेष रूप से मन, दृढ़ता से झिल्ली वे पहली मुठभेड़18,19को बांध । हमारे अनुभव में, प्रोटीन अक्सर गैर-विशिष्ट टयूबिंग, लेट्स, सीरिंज और अन्य microfluidic भागों के लिए बाध्यकारी प्रदर्शित करते हैं । इसलिए, स्थानीय प्रोटीन सांद्रता इनपुट सांद्रता18 से अलग और भी प्रवाह-सेल की लंबाई से अधिक भिंन है, प्रवेश और आउटलेट के बीच झिल्ली पर विभिंन प्रोटीन पैटर्न की एक किस्म में जिसके परिणामस्वरूप, के रूप में19दूसरों के द्वारा मनाया ।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल की दूसरी छमाही, इन विट्रो में पुनर्गठन रॉड के आकार का microstructures फिर से एक नमूनों पर खुले चैंबर दृष्टिकोण का उपयोग कर लिपिड bilayers द्वारा कवर की एक सरल नकल के लिए अनुमति देता है vivo प्रोटीन व्यवहार में भले ही प्रोटीन सांद्रता पर सटीक नियंत्रण बफर हटाने के कारण खो दिया है । ध्यान दें कि क्योंकि मन की तरंग दैर्ध्य के बारे में एक आदेश के बारे में है परिमाण में vivo की तुलना में बड़ा से एक छड़ के आकार का microcompartments भी है परिमाण के एक आदेश के बारे में बड़ा (10 x 30 µm) एक रॉड के आकार का ई. कोलाई सेल ।
कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल प्रोटीन एकाग्रता, बफर संरचना और झिल्ली गुण सहित सभी शर्तों के सटीक नियंत्रण के लिए अनुमति देता है । 3 डी संरचित का उपयोग का समर्थन करता है स्थानिक के तहत अध्ययन किया जा प्रतिक्रिया सक्षम बनाता है, vivo व्यवहार में जटिल microfluidics उपकरणों की आवश्यकता के बिना नकल उतार ।

Spatiotemporal पैटर्न प्रकृति में आवश्यक हैं, दोनों कोशिकीय और सेलुलर स्तर पर जटिल कार्यों को विनियमित करने के लिए morphogenesis से विनियमित सेल डिवीजन1,2। प्रतिक्रिया-प्रसार प्रणालियों इन नमूनों की स्थापना में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, लेकिन अभी भी अच्छी तरह से समझ में नहीं आ रहे हैं । एक प्रतिक्रिया का एक प्रमुख उदाहरण-प्रसार प्रणाली और सबसे अच्छा विशेषता जैविक प्रणाली अब तक ई कोलाई MinCDE प्रणाली3,4,5,6,7है । MinCDE प्रणाली सेल ध्रुव से ई. कोलाई में सेल ध्रुव के लिए भविष्य के विभाजन साइट के रूप में सेल के बीच निर्धारित करने के लिए झूलती है । इस प्रणाली ATPase मन पर आधारित है, प्रोटीन मेरा सक्रिय ATPase, और एक स्थानिक प्रतिक्रिया मैट्रिक्स8के रूप में झिल्ली । MinC पैटर्न गठन तंत्र का हिस्सा नहीं है, लेकिन वास्तविक कार्यात्मक एजेंट है: मुख्य divisome प्रोटीन FtsZ5,6के एक अवरोधक । MinC मन को बांधता है और इसलिए दोलनों, एक समय में जिसके परिणामस्वरूप औसत प्रोटीन एकाग्रता ढाल है कि सेल के खंभे पर अधिक से अधिक है और सेल मध्य में कम है, केवल midcell9,10 में polymerize को FtsZ की अनुमति . MinCDE प्रणाली वाकर के बड़े परिवार का हिस्सा है एक ATPases कि2बैक्टीरिया में spatiotemporal संगठन के लिए महत्वपूर्ण हैं, स्थिति के लिए और परिवहन प्रोटीन परिसरों11 और plasmids12 और सेल विनियमन के लिए विभाजन13 और गुणसूत्र अलगाव14। इसलिए, MinCDE प्रतिक्रिया-प्रसार प्रणाली न केवल एक ठेठ प्रतिक्रिया-प्रसार प्रणाली का प्रतिनिधित्व करता है, लेकिन यह भी बैक्टीरिया में spatiotemporal संगठन के लिए अपनी प्रासंगिकता की वजह से ध्यान आकर्षित किया है ।
vivo में MinCDE प्रणाली के विस्तृत कार्यात्मक अध्ययन प्रोटीन के हेरफेर के रूप में जटिल हैं, और जीन विलोपन कोशिका विभाजन दोष में आम तौर पर परिणाम. इसके अलावा, झिल्ली संरचना या vivo में cytosol के गुणों को बदलने के बहुत चुनौतीपूर्ण है15,16। प्रणाली में परिवर्तन और कारकों को प्रभावित करने के लिए सेल के जटिल वातावरण में व्याख्या कठिन हैं, और भी तो अगर यह कोशिका विभाजन के रूप में इस तरह के एक आवश्यक समारोह में परेशान है । हम और दूसरों को इसलिए एक इन विट्रो पुनर्गठन दृष्टिकोण में बदल गया है, अपने मूल घटकों के लिए प्रणाली को कम करने: मन, मेरा, एक ऊर्जा स्रोत के रूप में एटीपी, और समर्थित लिपिड bilayer एक प्रतिक्रिया मैट्रिक्स के रूप में6,17, 18. यह नीचे-ऊपर दृष्टिकोण एक जीवित कोशिका की जटिलता के बिना विस्तार में स्वयं संगठन के तंत्र की जांच करने के लिए अनुमति देता है । प्रोटीन की सतह लहरें यात्रा6 और अन्य प्रकार के पैटर्न17,19 इन शर्तों के तहत, हालांकि एक तरंग दैर्ध्य के साथ कि आमतौर पर एक परिमाण के बारे में vivo मेंसे बड़ा है. एक खुले चैंबर के उपयोग पैटर्न गठन को प्रभावित सभी पहलुओं पर सटीक नियंत्रण की सुविधा: प्रोटीन सांद्रता6, प्रोटीन गुण20, झिल्ली संरचना10, बफर संरचना, और एटीपी एकाग्रता 6, साथ ही अंय कारकों के अतिरिक्त जैसे भीड़ एजेंटों21 और अंय divisome प्रोटीन22। इसकी तुलना में इन विट्रो में एक प्रवाह में MinCDE प्रणाली के पुनर्गठन-सेल18,19,23 प्रवाह के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता17,23, प्रोटीन 19शर्तों, झिल्ली रचना19 और पूर्ण 3 डी प्रसूति प्रोटीन पैटर्न पर सीमित है, लेकिन प्रोटीन का एक सटीक नियंत्रण/घटक एकाग्रता और अनुक्रमिक घटक इसके अलावा और अधिक जटिल प्रदान करता है ।
इस खुले चैंबर का उपयोग करना, हम भी planar लिपिड bilayers के द्वारा जो एक जांच कर सकते है कैसे ज्यामितीय सीमाओं पैटर्न गठन21, एक घटना है कि हाल ही में भी विवो बैक्टीरिया का उपयोग कर जांच की गई है प्रभाव का समर्थन पैटर्न microstructures7में ढाला । हम भी इस परख कार्यरत कैसे मेरा में उत्परिवर्तन परिभाषित परिवर्तन प्रणाली20के पैटर्न के गठन को प्रभावित करते हैं । इसके अलावा, एक ही मूल परख प्रारूप की जांच कैसे पैटर्न गठन प्रकाश द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है कार्यरत है, परख में एक azobenzene-crosslinked मेरा पेप्टाइड शुरू करने, और TIRF माइक्रोस्कोपी24के साथ इमेजिंग ।
हमने पाया है कि, में आदेश मन पैटर्न गठन की नकल करने में vivo में मनाया एक में इन विट्रो प्रणाली, प्रसूति महत्वपूर्ण था । रॉड के आकार का प्रयोग microcompartments, के साथ इन विट्रो में दिमाग का बड़ा तरंग दैर्ध्य को समायोजित आयामों के साथ (10 x 30 µm), एक समर्थित लिपिड bilayer के साथ पहने की अनुमति दी के पुनर्गठन के मन पोल-ध्रुव दोलनों और प्रोटीन ढाल गठन 10,25. इस परख में, समर्थित लिपिड bilayers एक नमूनों PDMS सब्सट्रेट कि रॉड के आकार का microcompartments है कि शीर्ष पर खुला रहने के कई सौ प्रतिकृतियां शामिल हैं पर जमा हो जाती है । इस के द्वारा, प्रतिक्रिया एक खुले कक्ष में स्थापित किया जा सकता है, और बाद में बफर microcompartments के रिम को कम है, जिससे एक छोटी मात्रा के लिए प्रतिक्रिया को परिष्कृत । भले ही इन डिब्बों एक तरफ एक एयर बफर इंटरफेस है और इसलिए झिल्ली द्वारा एक पूर्ण 3 डी शोधन का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं, प्रोटीन गतिशीलता vivo दोलनों में नकल उतार10,25. पूर्ण 3d शोधन, जो बहुत ही परिणाम18से पता चलता है की तुलना में, खुले microstructures परख अपेक्षाकृत सरल है और आसानी से संभाल और प्रयोगशालाओं द्वारा भी किया जा सकता है कि विशेष microfluidics उपकरण के साथ सुसज्जित नहीं कर रहे है और स्वच्छ कमरे सुविधाएं ।
यहां, हम एक खुला चैंबर कि सभी घटकों और ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी द्वारा आसान पहुंच के नियंत्रण के लिए अनुमति देता है का उपयोग कर इन विट्रो में समर्थित लिपिड bilayers पर MinCDE पैटर्न गठन के गठन के लिए एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल वर्तमान और, नाबालिग के साथ संशोधन, सतह के लिए भी अनुकूल है-जांच तकनीक26। planar समर्थित लिपिड bilayers के बगल में, हम यह भी बताएंगे कि कैसे प्रोटीन शोधन रॉड के आकार का PDMS microstructures पर सरल नमूनों का समर्थन लिपिड bilayers का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है । इन परख, हालांकि MinCDE प्रणाली के लिए अनुकूलित भी अंय प्रोटीन प्रणालियों है कि इस तरह के FtsZ27 या एक ंयूनतम actin प्रांतस्था28के रूप में झिल्ली, के साथ एक समान तरीके से बातचीत करने के लिए हस्तांतरित किया जा सकता है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPG</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli polar lipid extract</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>100600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt trihydrate</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-diphosphate monopotassium salt dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5285-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27810.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9277.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCl</td>
			<td>Termo Fisher Scientific</td>
			<td>20491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Diamine Tetraacetate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.08418.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid 98%</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>173163.1611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide 50%</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>147064.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>05288.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102950</td>
			<td>Uvasol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol 86%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2316.x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atto-655-DOPE</td>
			<td>Atto Tec</td>
			<td>AD 655-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS base</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td></td>
			<td>SYLGARD 184</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS crosslinker</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Glue</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>6801</td>
			<td>#68 and #63 both work well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips #1.5 24x24 mm</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips #1 24x24 mm</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td></td>
			<td>used only for PDMS microstructures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml reaction tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;0030123301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>culture flask 2L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>e.g. 734-1905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-Trap HP</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfiltration column: HiLoad Superdex 75 PG or 200 PG</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac 10DG desalting column prepacked column</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7322010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis device: Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 0.1 - 0.5 mL or 0.5-3 mL</td>
			<td>Termo Fisher Scientific</td>
			<td>66333 or 66330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>razor blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure water: Milli-Q Type 1 Ultrapure Water Systems</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>automated protein purification system: &#196;kta Pure</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bath sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td>e.g. Model 1510</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARE-250 mixer</td>
			<td>Thinky Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner Zepto</td>
			<td>Diener electronic</td>
			<td></td>
			<td>use oxygen as process gas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>positive displacement pipettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td></td>
			<td>Transferpettor models with glass tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM780 confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Fitted with Zeiss C-Apochromat 40X/1.20 water-immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28a-His-MinD_MinE</td>
			<td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td>
			<td></td>
			<td>plasmid encoding His-MinD and non-tagged MinE to improve yield</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28a-His-MinE</td>
			<td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td>
			<td></td>
			<td>plasmid encoding His-MinE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28a-His-EGFP-MinD</td>
			<td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td>
			<td></td>
			<td>plasmid encoding His-EGFP-MinD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28a-His-mRuby3-MinD</td>
			<td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td>
			<td></td>
			<td>plasmid encoding His-mRuby3-MinD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28a-His- MinC</td>
			<td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td>
			<td></td>
			<td>plasmid encoding His-MinC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro reconstitution of self-organizing protein patterns on supported lipid bilayers

कोशिकाओं के मौलिक spatiotemporal संगठन के कई पहलुओं की प्रतिक्रिया-प्रसार प्रकार प्रणालियों द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं । इन विट्रो में ऐसी प्रणालियों के पुनर्गठन उनके अंतर्निहित तंत्र है जो vivo में संभव नहीं होगा की विस्तृत अध्ययन के लिए अनुमति देता है । यहां, हम इन विट्रो में के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान ई कोलाईके MinCDE प्रणाली है, जो कोशिका मध्य में कोशिका विभाजन पट पदों का पुनर्गठन । परख केवल स्वयं के लिए आवश्यक घटक संगठन, अर्थात् एक झिल्ली, दो प्रोटीन मन और मेरा और एटीपी के रूप में ऊर्जा की आपूर्ति के लिए डिज़ाइन किया गया है । इसलिए हम एक coverslip, जिस पर एक समर्थित लिपिड bilayer का गठन किया है पर एक खुली प्रतिक्रिया चैंबर बनाना । चैंबर के खुले डिजाइन लिपिड bilayer और थोक सामग्री के नियंत्रित हेरफेर की इष्टतम तैयारी के लिए अनुमति देता है । दो प्रोटीन, मन और मेरा, साथ ही एटीपी, तो झिल्ली के ऊपर थोक मात्रा में जोड़ रहे हैं । इमेजिंग कई ऑप्टिकल सूक्ष्मदर्शी द्वारा संभव है, के रूप में डिजाइन का समर्थन करता है फोकल, व्यापक क्षेत्र और TIRF माइक्रोस्कोपी एक जैसे । प्रोटोकॉल की एक भिन्नता में, लिपिड bilayer एक नमूनों का समर्थन पर, कोशिका के आकार का PDMS microstructures, बजाय कांच पर बना है. इन डिब्बों के रिम के लिए थोक समाधान कम एक छोटे डिब्बे में प्रतिक्रिया पडते और vivo थरथरानवाला व्यवहार में की नकल उतारने की अनुमति है कि सीमाओं प्रदान करता है. साथ में ले लिया, हम प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए MinCDE प्रणाली दोनों के साथ और स्थानिक प्रसूति के बिना पुनर्गठन, शोधकर्ताओं ने ठीक से सभी पहलुओं को नियंत्रित करने के लिए पैटर्न गठन को प्रभावित करने की अनुमति, एकाग्रता पर्वतमाला और अन्य कारकों के अलावा जैसे या प्रोटीन, और व्यवस्थित करने के लिए एक अपेक्षाकृत सरल प्रयोगात्मक सेटअप में सिस्टम जटिलता में वृद्धि ।

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In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

हम में के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान इन विट्रो स्वयं मन की परख संगठन और एक खुला कक्ष में एक समर्थित लिपिड bilayer पर मेरा । इसके अतिरिक्त, हम वर्णन कैसे लिपिड पहने PDMS microcompartments में परख संलग्न करने के लिए प्रतिक्रिया परिशोधन द्वारा vivo शर्तों में नकल ।

इन विट्रो में स्व का पुनर्गठन-समर्थित लिपिड Bilayers पर प्रोटीन पैटर्न का आयोजन

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

पाड़ Liposomes का उपयोग लिपिड-समीपस्थ प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत पुनर्गठित करने<em&gt; इन विट्रो</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

प्रोटीन संरचना और गतिशीलता के अध्ययन के लिए समय का समाधान electrospray ionization हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

इन विट्रो बहुलकीकरण के F प-actin पर जल्दी Endosomes

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

डिटर्जेंट-मुक्त Ultrafast Bilayers में झिल्ली प्रोटीन का पुनर्गठन Fusogenic पूरक का उपयोग कर Proteoliposomes आरोप लगाया ।

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए TRPV1 का शुद्धिकरण और पुनर्गठन

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

अपव्यय Microgravimetry फॉस्फोलिपिड बाइंडिंग प्रोटीन की बाइंडिंग गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए Annexin A2 करने के लिए ठोस-समर्थित लिपिड Bilayers एक क्वार्ट्ज प्रतिध्वनि का उपयोग

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

प्रोटीन तह, परिवहन, और रेडियोधर्मी पल्स चेस द्वारा जीवित कोशिकाओं में क्षरण का विश्लेषण

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

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लिपिड-मिश्रण परख के लिए Liposomes में रिकॉमबिनेंट Drosophila Atlastin के डिटर्जेंट की मदद से पुनर्गठन

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

प्रोटीन-लिपिड इंटरैक्शन को मापने के लिए माइक्रोस्केल थर्मोफोरेसिस का उपयोग

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

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सक्रिय Caenorhabditis elegans परमाणु निकालें और इन विट्रो प्रतिलेखन के लिए पुनर्गठन के अलगाव

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...