Name: in vitro reconstitution of self-organizing protein patterns on supported lipid bilayers
Uploaded: 2018-07-28T14:45:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers at JoVE.com

Vi takker Michael Heymann og Frank Siedler for produksjon av silisium wafere, Core anlegget MPI-B for hjelp i protein rensing og Simon Kretschmer og Leon Harrington for kommentarer på manuskriptet.

<ol>
	<li>Soh, S., Byrska, M., Kandere-Grzybowska, K., Grzybowski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction-diffusion+systems+in+intracellular+molecular+transport+and+control.">Reaction-diffusion systems in intracellular molecular transport and control.</a> Angew Chemie Int Ed. 49 (25), 4170-4198 (2010).</li><li>Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ParA/MinD+family+puts+things+in+their+place.">The ParA/MinD family puts things in their place.</a> Trends Microbiol. 20 (9), 411-418 (2012).</li><li>Shih, Y. -. L., Zheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+control+of+the+cell+division+site+by+the+Min+system+in+Escherichia+coli.">Spatial control of the cell division site by the Min system in Escherichia coli.</a> Environ Microbiol. 15 (12), 3229-3239 (2013).</li><li>Halatek, J., Frey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+canalized+MinD+transfer+and+MinE+sequestration+explain+the+origin+of+robust+MinCDE-protein+dynamics.">Highly canalized MinD transfer and MinE sequestration explain the origin of robust MinCDE-protein dynamics.</a> Cell Rep. 1 (6), 741-752 (2012).</li><li>Raskin, D. M., De Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MinDE-dependent+pole-to-pole+oscillation+of+division+inhibitor+MinC+in+Escherichia+coli.">MinDE-dependent pole-to-pole oscillation of division inhibitor MinC in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 181 (20), 6419-6424 (1999).</li><li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulators+for+bacterial+cell+division+self-organize+into+surface+waves+in+vitro.">Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro.</a> Science. 320 (5877), 789-792 (2008).</li><li>Wu, F., van Schie, B. G. C., Keymer, J. E., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+and+scale+orient+Min+protein+patterns+in+shaped+bacterial+sculptures.">Symmetry and scale orient Min protein patterns in shaped bacterial sculptures.</a> Nat Nanotechnol. 10 (June), 719-726 (2015).</li><li>Hu, Z., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+regulation+of+cell+division+in+E.+coli:+Spatiotemporal+oscillation+of+MinD+requires+stimulation+of+its+ATPase+by+MinE+and+phospholipid.">Topological regulation of cell division in E. coli: Spatiotemporal oscillation of MinD requires stimulation of its ATPase by MinE and phospholipid.</a> Mol Cell. 7 (6), 1337-1343 (2001).</li><li>Meinhardt, H., de Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+Escherichia+coli:+A+model+for+the+pole-to-pole+oscillations+of+Min+proteins+and+the+localization+of+the+division+site.">Pattern formation in Escherichia coli: A model for the pole-to-pole oscillations of Min proteins and the localization of the division site.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (25), 14202-14207 (2001).</li><li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+self-organizing+protein+gradients+as+spatial+cues+in+cell-free+systems.">Reconstitution of self-organizing protein gradients as spatial cues in cell-free systems.</a> Elife. 3, e03949 (2014).</li><li>Roberts, M. A. J., Wadhams, G. H., Hadfield, K. A., Tickner, S., Armitage, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ParA-like+protein+uses+nonspecific+chromosomal+DNA+binding+to+partition+protein+complexes.">ParA-like protein uses nonspecific chromosomal DNA binding to partition protein complexes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (17), 6698-6703 (2012).</li><li>Vecchiarelli, A. G., Mizuuchi, K., Funnell, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfing+biological+surfaces:+Exploiting+the+nucleoid+for+partition+and+transport+in+bacteria.">Surfing biological surfaces: Exploiting the nucleoid for partition and transport in bacteria.</a> Mol Microbiol. 86 (3), 513-523 (2012).</li><li>Thanbichler, M., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MipZ,+a+spatial+regulator+coordinating+chromosome+segregation+with+cell+division+in+Caulobacter.">MipZ, a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter.</a> Cell. 126 (1), 147-162 (2006).</li><li>Lim, H. C., Surovtsev, I. V., Beltran, B. G., Huang, F., Bewersdorf, J., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+DNA-relay+mechanism+in+ParABS-mediated+chromosome+segregation.">Evidence for a DNA-relay mechanism in ParABS-mediated chromosome segregation.</a> Elife. 3, e02758 (2014).</li><li>Mileykovskaya, E., Fishov, I., Fu, X., Corbin, B. D., Margolin, W., Dowhan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+phospholipid+composition+on+MinD-membrane+interactions+in+vitro+and+in+vivo.">Effects of phospholipid composition on MinD-membrane interactions in vitro and in vivo.</a> J Biol Chem. 278 (25), 22193-22198 (2003).</li><li>Renner, L. D., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+microdomains+localize+to+negatively+curved+regions+of+Escherichia+coli+membranes.">Cardiolipin microdomains localize to negatively curved regions of Escherichia coli membranes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (15), 6264-6269 (2011).</li><li>Ivanov, V., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+modes+of+interconverting+dynamic+pattern+formation+by+bacterial+cell+division+proteins.">Multiple modes of interconverting dynamic pattern formation by bacterial cell division proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8071-8078 (2010).</li><li>Caspi, Y., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+out+Min+protein+patterns+in+fully+confined+fluidic+chambers.">Mapping out Min protein patterns in fully confined fluidic chambers.</a> Elife. 5, e19271 (2016).</li><li>Vecchiarelli, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-bound+MinDE+complex+acts+as+a+toggle+switch+that+drives+Min+oscillation+coupled+to+cytoplasmic+depletion+of+MinD.">Membrane-bound MinDE complex acts as a toggle switch that drives Min oscillation coupled to cytoplasmic depletion of MinD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), E1479-E1488 (2016).</li><li>Kretschmer, S., Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+modulation+of+reconstituted+Min+protein+patterns+and+gradients+by+defined+mutations+in+MinE's+membrane+targeting+sequence.">Large-scale modulation of reconstituted Min protein patterns and gradients by defined mutations in MinE's membrane targeting sequence.</a> PLoS One. 12 (6), e0179582 (2017).</li><li>Schweizer, J., Loose, M., Bonny, M., Kruse, K., Monch, I., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometry+sensing+by+self-organized+protein+patterns.">Geometry sensing by self-organized protein patterns.</a> Proc Natl Acad Sci. 109 (38), 15283-15288 (2012).</li><li>Martos, A., Raso, A., Jim&#233;nez, M., Petr&#225;&#353;ek, Z., Rivas, G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+polymers+tethered+to+the+membrane+by+ZipA+are+susceptible+to+spatial+regulation+by+min+waves.">FtsZ polymers tethered to the membrane by ZipA are susceptible to spatial regulation by min waves.</a> Biophys J. 108 (9), 2371-2383 (2015).</li><li>Vecchiarelli, A. G., Li, M., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+affinities+of+MinD+and+MinE+to+anionic+phospholipid+influence+Min+patterning+dynamics+in+vitro.">Differential affinities of MinD and MinE to anionic phospholipid influence Min patterning dynamics in vitro.</a> Mol Microbiol. 93 (3), 453-463 (2014).</li><li>Glock, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+a+biological+reaction-diffusion+system.">Optical control of a biological reaction-diffusion system.</a> Angew Chemie Int Ed. 57 (9), 2362-2366 (2018).</li><li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+pole-to-pole+oscillations+of+min+proteins+in+microengineered+polydimethylsiloxane+compartments.">Reconstitution of pole-to-pole oscillations of min proteins in microengineered polydimethylsiloxane compartments.</a> Angew Chemie Int Ed. 52 (1), 459-462 (2013).</li><li>Miyagi, A., Ramm, B., Schwille, P., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed+Atomic+Force+Microscopy+Reveals+the+Inner+Workings+of+the+MinDE+Protein+Oscillator.">High-Speed Atomic Force Microscopy Reveals the Inner Workings of the MinDE Protein Oscillator.</a> Nano Lett. 18 (1), 288-296 (2017).</li><li>Ramirez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treadmilling+analysis+reveals+new+insights+into+dynamic+FtsZ+ring+architecture.">Treadmilling analysis reveals new insights into dynamic FtsZ ring architecture.</a> PLoS Biol. 16 (5), e2004845 (2018).</li><li>Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+motors+fragment+and+compact+membrane-bound+actin+filaments.">Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments.</a> Elife. 2, e00116 (2013).</li><li>Zieske, K., Schweizer, J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+topology+assisted+alignment+of+Min+protein+waves.">Surface topology assisted alignment of Min protein waves.</a> FEBS Lett. 588 (15), 2545-2549 (2014).</li><li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Herold, C., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Min+protein+patterns+emerge+from+rapid+rebinding+and+membrane+interaction+of+MinE.">Min protein patterns emerge from rapid rebinding and membrane interaction of MinE.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (5), 577-583 (2011).</li><li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+geometry-modulated+protein+patterns+in+membrane+compartments.">Reconstituting geometry-modulated protein patterns in membrane compartments.</a> Methods Cell Biol. 128, 149-163 (2015).</li><li>Gruenberger, A., Probst, C., Heyer, A., Wiechert, W., Frunzke, J., Kohlheyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+picoliter+bioreactor+for+microbial+single-cell+analysis:+fabrication,+system+setup,+and+operation.">Microfluidic picoliter bioreactor for microbial single-cell analysis: fabrication, system setup, and operation.</a> J Vis Exp. (82), e50560 (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Loose, M., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+self-organization:+Lessons+from+the+min+system.">Protein self-organization: Lessons from the min system.</a> Annu Rev Biophys. 40, 315-336 (2011).</li><li>Arumugam, S., Petra&#353;ek, Z., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MinCDE+exploits+the+dynamic+nature+of+FtsZ+filaments+for+its+spatial+regulation.">MinCDE exploits the dynamic nature of FtsZ filaments for its spatial regulation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1192-E1200 (2014).</li></ol>

Forfatterne ikke avsløre.

Vi har beskrevet en protokoll for i vitro rekonstituering av MinCDE selv-organisering på planar støttede lipid bilayers og i lipid bilayer dekket 3D strukturer, bruker eksemplet med stav-formet PDMS microstructures. For å få verdifulle data fra disse analyser, er de viktigste faktorene å kontrollere protein og membran kvalitet.
Å sikre protein kvalitet, protein masse skal bekreftes SDS side og massespektrometri. Videre må det bekreftes at proteiner er løselig og ikke aggregerte, ved hjelp av analytiske gel filtrering eller dynamisk lysspredning. Gel filtrering kan brukes til å fjerne alle aggregerte brøkdel av proteiner. Nøye pH justering og kvaliteten på ekstra nukleotider er kritisk, som i tillegg ikke-justert eller delvis forringet nukleotid protein aksjer eller selv-organisering analyser er tilstrekkelig til å eliminere protein aktivitet, derfor avskaffe Self-Organization.
Ved siden av protein kvalitet, membranen er mest kritiske og upassende membran formasjon er ofte årsaken defekt selv-organisering og opprinnelsen til artefactual overflaten strukturer.
Når du utfører protokollen for første gang, er det nyttig å merke støttes lipid-bilayers ved å inkludere merket lipider som Atto-655-DOPE eller DiI på lav molar prosenter (0,05%). Dermed kan egenskapene og kvalitet av membranen bedømmes direkte. Bruker FRAP, kan flyt av membranen vurderes. Videre kan en direkte vurdere kvaliteten på vask av SLB, som det vil enten være for mange blemmer, ingen væske membran eller ingen membran, hvis det har blitt vasket. Åpne kammeret tilnærming tillater å grundig vaske membranen, og dermed også for å fjerne blemmer som stikker på overflaten av SLB. De mest avgjørende faktorene for å få væske og homogen støttes lipid bilayers er rengjøring og hydrophilicity støtte overflaten og riktig størrelse og homogene SUvs kan det være nyttig å sjekke SUV størrelse og størrelse distribusjon ved hjelp dynamisk lysspredning. Smale størrelse distribusjoner anbefaler vi ekstrudering blemmer i stedet for å sonicating dem. Andre metoder for rengjøring coverslips, f.eks behandlinger med sterke baser, grunnleggende vaskemidler eller bruke coverslips direkte etter skylling med vann, kan gi gode resultater, avhengig av programmet og lipid blandingen.
Første halvdel av protokollen presenteres her, i vitro rekonstituering på planar støttes lipid bilayers i åpne chambers, har fordelen av gjengivelse overflaten tilgjengelig for optisk microscopies, som TIRF mikroskopi30FRAP analyse6, enkelt-partikkel sporing34, likeledes idet overflaten sonde teknikker som atomic force mikroskopi26. Stor homogen området gir bedre statistikk på definerte konsentrasjoner. Videre kan åpne kammeret tilnærming til nettopp styre protein konsentrasjon og en rask og enkel tillegg av flere komponenter, derfor tillater for å sjarmere protein konsentrasjon i en enkelt kammer20. Analysen kan også bli utvidet med tillegg av andre bakteriell divisome komponenter som FtsZ22,35, ZipA22 eller chimeric protein FtsZ-YFP-MTS10,35.
Andre grupper har tatt en lignende tilnærming til gjenoppbygge på Min systemet i vitro, men bruk en flyt-celle i stedet for en åpen kammer17,18,19. Flyt-celler har visse fordeler, spesielt når et innelukket 3D-miljø er nødvendig18, påvirkning av flyt17,19,23 eller membran komposisjon23 på MinCDE mønstre undersøkt, eller hvis protein mønstre er å bli observert under protein begrense forhold19. Likevel, lokale kontroll av molekylære konsentrasjoner er vanskeligere. Protein komponenter, spesielt sinn, sterkt binde til membranen de første møte18,19. I vår erfaring oppfører proteiner uspesifisert binding til rør, viker, sprøyter og andre microfluidic. Derfor lokale protein konsentrasjoner er forskjellig fra input konsentrasjoner18 og også variere over lengden av flyt-cellen, som resulterer i en rekke forskjellige protein mønstre på membranen mellom innløp og utløp, som observert av andre19.
Den andre halvparten av protokollen presenteres her, i vitro rekonstituering i stav-formet microstructures å bruke åpne kammeret tilnærming på en mønstret støtte dekket av lipid bilayers gir en enkel etterligne i vivo protein atferd Selv om nøyaktig kontroll over protein konsentrasjoner er tapt på grunn av buffer fjerning. Merk at fordi Bølgelengden av MinDE er om en størrelsesorden større i vitro enn i vivo stav-formet microcompartments er også om en størrelsesorden større (10 x 30 µm) enn en stav-formet E. coli celle.
Samlet gir denne protokollen presis kontroll over alle betingelser inkludert protein konsentrasjon, buffer komposisjon og membran egenskaper. Bruk av 3D strukturert støtter kan reaksjonen til studeres under romlige confinement, etterligne vivo virkemåte uten behov for komplisert microfluidics utstyr.

Spatiotemporal mønstre er avgjørende i naturen, regulere komplekse oppgaver både på flercellede og mobilnettet nivå, fra morphogenesis til regulert celledeling1,2. Reaksjon-diffusjon systemer spiller en viktig rolle i å etablere disse mønstrene, men er fortsatt ikke godt forstått. Et godt eksempel på en reaksjon-diffusjon system og de beste preget biologiske system er så langt Escherichia coli MinCDE system3,4,5,6,7. MinCDE systemet svinger fra cellen pole til celle pole E. coli å bestemme midten av cellen som fremtidig deling. Dette systemet er basert på ATPase sinnet, ATPase aktivere protein MinE, og membranen som en romlig reaksjon matrix8. MinC er ikke del av mønster formasjonen mekanisme, men er faktisk funksjonelle agent: en inhibitor av viktigste divisome protein FtsZ5,6. MinC binder til hjernen og derfor følger svingninger, noe som resulterer i en gjennomsnittlige protein konsentrasjon gradient maksimal ved celle polene og minimal cellen midt, kun tillater FtsZ å danner midcell9,10 . MinCDE systemet er en del av den større familien av Walker A ATPases som er nøkkelen til spatiotemporal organisasjonen i bakterier2, plassere og transportere protein komplekser11 og plasmider12 og regulerer celle divisjon13 og kromosom segregering14. Derfor MinCDE reaksjon-diffusjon systemet ikke bare representerer et arketypisk reaksjon-diffusjon system, men har også fått oppmerksomhet på grunn av dens relevans for spatiotemporal organisasjonen i bakterier.
Detaljert funksjonelle studier av MinCDE systemet i vivo er komplisert, manipulering av proteiner og gene sletting vanligvis føre celledeling defekter. Videre endre membran sammensetning eller egenskapene av stoffer i vivo er svært utfordrende15,16. Endringer i systemet og påvirke faktorer er vanskelig å tolke i komplekse miljøet i cellen, enda mer hvis det er forstyrret i en viktig funksjon som celledeling. Vi og andre har derfor slått til en i vitro rekonstituering tilnærming, redusere systemet til dens kjernekomponentene: Husk meg, ATP som energikilde og støttede lipid bilayer som en reaksjon matrix6,17, 18. dette bottom-up tilnærming kan undersøke mekanisme selvstendig organisasjon i detalj uten kompleksiteten av en levende celle. Skjemaet proteiner reise overflaten bølger6 og andre typer mønstre17,19 under disse forholdene, men med en bølgelengde det er vanligvis om en størrelsesorden større enn i vivo. Bruk av en åpen kammer muliggjør nøyaktig kontroll over alle aspekter påvirke mønster formasjon: protein konsentrasjoner6, protein egenskaper20, membran komposisjon10, buffer komposisjon og ATP konsentrasjon 6, samt tillegg av andre faktorer som trengsel agenter21 og andre divisome proteiner22. Sammenligning kan i vitro rekonstituering av MinCDE system i en flyt-cellen18,19,23 brukes å undersøke påvirkning av flyt17,23, protein begrense forhold19, membran komposisjon19 og full 3D confinement18 på protein mønstre, men gjengir en nøyaktig kontroll proteinkomponenter/konsentrasjon og sekvensiell komponent tillegg mye mer komplisert.
Bruker denne åpne kammer, vi også mønstret støtte fra planar lipid bilayers som man kan undersøke hvordan geometriske grenser innflytelse mønster formasjon21, et fenomen som har nylig også vært undersøkt i vivo bruker bakterier støpt inn microstructures7. Vi har også ansatt denne analysen til å undersøke hvordan definerte mutasjoner i min påvirker mønster dannelsen av systemet20. Videre har samme grunnleggende analysen format vært ansatt å undersøke hvordan mønster formasjon styres av lys, presenterer en azobenzene-krysskoblet MinE peptid i analysen, og tenkelig med TIRF mikroskopi24.
Vi fant at, for at MinDE mønsteret formasjon observert i vivo i en i vitro system, confinement var nøkkelen. Bruke stav-formet microcompartments, med dimensjoner justert til større bølgelengden til MinDE i vitro (10 x 30 µm), kledd med en støttet lipid bilayer tillatt rekonstituering MinDE Pol-til-Pol svingninger og protein gradient formasjon 10,25. I denne analysen, er støttede lipid bilayers avsatt på et mønstret PDMS substrat som inneholder flere hundre kopier av stav-formet microcompartments som forblir åpne på toppen. Med det reaksjonen kan settes opp i en åpen kammer, og senere bufferen er senket til kanten av microcompartments, og dermed avgrense reaksjonen til små. Selv om disse avdelingene har en luft-buffer-grensesnitt på den ene siden og dermed ikke representerer en full 3D confinement av membran, etterlignet protein dynamikken i vivo svingninger10,25. Sammenlignet med full 3D confinement, som viser svært like resultater18, åpen microstructures analysen er relativt enkel og lett å håndtere og kan også utføres av laboratorier som ikke er utstyrt med spesialiserte microfluidics utstyr og rent-rom fasiliteter.
Her presenterer vi en eksperimentell protokoll for gjenoppbygge MinCDE mønster formasjon på støttes lipid bilayers i vitro bruker en åpen kammer som gir kontroll over alle komponenter og enkel tilgang av optisk mikroskopi og, med mindre endringer, er også tilpasses overflaten-sonden teknikker26. Ved planar støttes lipid bilayers, vi også vise hvordan protein confinement kan være får enkel mønstret støttes lipid bilayers på stav-formet PDMS microstructures. Disse analyser, kan selv om optimalisert for MinCDE systemet, også overføres til andre protein-systemer som kommuniserer på en lignende måte med membran, som FtsZ27 eller en minimal begrepsordbok cortex28.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPG</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli polar lipid extract</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>100600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt trihydrate</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-diphosphate monopotassium salt dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5285-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27810.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9277.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCl</td>
			<td>Termo Fisher Scientific</td>
			<td>20491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Diamine Tetraacetate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.08418.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid 98%</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>173163.1611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide 50%</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>147064.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>05288.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102950</td>
			<td>Uvasol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol 86%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2316.x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atto-655-DOPE</td>
			<td>Atto Tec</td>
			<td>AD 655-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS base</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td></td>
			<td>SYLGARD 184</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS crosslinker</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Glue</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>6801</td>
			<td>#68 and #63 both work well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips #1.5 24x24 mm</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips #1 24x24 mm</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td></td>
			<td>used only for PDMS microstructures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml reaction tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;0030123301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>culture flask 2L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>e.g. 734-1905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-Trap HP</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfiltration column: HiLoad Superdex 75 PG or 200 PG</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac 10DG desalting column prepacked column</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7322010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis device: Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 0.1 - 0.5 mL or 0.5-3 mL</td>
			<td>Termo Fisher Scientific</td>
			<td>66333 or 66330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>razor blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure water: Milli-Q Type 1 Ultrapure Water Systems</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>automated protein purification system: &#196;kta Pure</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bath sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td>e.g. Model 1510</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARE-250 mixer</td>
			<td>Thinky Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner Zepto</td>
			<td>Diener electronic</td>
			<td></td>
			<td>use oxygen as process gas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>positive displacement pipettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td></td>
			<td>Transferpettor models with glass tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM780 confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Fitted with Zeiss C-Apochromat 40X/1.20 water-immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28a-His-MinD_MinE</td>
			<td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td>
			<td></td>
			<td>plasmid encoding His-MinD and non-tagged MinE to improve yield</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28a-His-MinE</td>
			<td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td>
			<td></td>
			<td>plasmid encoding His-MinE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28a-His-EGFP-MinD</td>
			<td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td>
			<td></td>
			<td>plasmid encoding His-EGFP-MinD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28a-His-mRuby3-MinD</td>
			<td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td>
			<td></td>
			<td>plasmid encoding His-mRuby3-MinD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28a-His- MinC</td>
			<td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td>
			<td></td>
			<td>plasmid encoding His-MinC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro reconstitution of self-organizing protein patterns on supported lipid bilayers

Mange aspekter av grunnleggende spatiotemporal organiseringen av celler er underlagt reaksjon-diffusjon type systemer. In vitro rekonstituering av slike systemer gir detaljerte studier av deres underliggende mekanismene som ikke ville være mulig i vivo. Her gir vi en protokoll for i vitro rekonstituering av MinCDE systemet Escherichia colisom plasserer den celledeling septum midt cellen. Analysen er utformet for å levere bare de nødvendige komponentene for selvstendig organisasjon, nemlig en membran, to proteiner sinn og gruve og energi i form av ATP. Vi har derfor dikte en åpen reaksjon kammer på en dekkglassvæske, som en støttet lipid bilayer er dannet. Den åpne konstruksjonen av kammeret gir optimal utarbeidelse av lipid bilayer og kontrollert manipulering av bulk innholdet. To proteiner, sinn og MinE, samt ATP, legges deretter i bulk volum over membranen. Tenkelig er mulig med mange optisk microscopies, design støtter AC confocal, wide-field og TIRF mikroskopi alike. I en variasjon av protokollen, er lipid bilayer dannet på en mønstret støtte, på celle-formet PDMS microstructures, i stedet for glass. Senke bulk løsningen på kanten av seksjonene omslutter reaksjonen i et mindre rom og gir grenser at mimicking i vivo oscillasjon atferd. Sammen beskrive vi for å gjeninnføre MinCDE systemet både med og uten romlige confinement, slik at forskere til nettopp styre alle aspekter påvirke mønster formasjonen, som konsentrasjon områder og tillegg av andre faktorer eller proteiner, og systematisk øke systemet kompleksiteten i en relativt enkel eksperimentelle oppsett.

Protein rensing etter våre Protokoll skal gi Min proteiner tilstrekkelig renhet. Som henvisning gir figur 1 et SDS-side bilde av sinn, fluorescently merket sinn, MinE og MinC. De individuelle trinnene av fremgangsmåten for å utføre en MinDE Self-Organization analysen på ikke-mønstret støttes lipid bilayers er beskrevet i figur 2. Bruker denne protokollen, kan vanlig MinDE reiser overflatebølger observeres gjennom kammeret (Figur 3). Bølgelengden kan variere noe innenfor kammeret, men generelt mønstre ligne. Kantene av kammeret bør ikke brukes for kvantitative sammenligninger, som membraner at skjemaet på UV limet synes å ha andre egenskaper enn på glasset overflaten (se Figur 3 c). Reiser overflatebølger kan analyseres ved å plotte intensiteten forplantning retning (figur 3B). Mens sinn fluorescens flyer ganske fort fra forkanten av bølgen og reduseres deretter kraftig på den etterfølgende kanten, MinE fluorescens øker nesten lineært fra starten av MinD wave og når sitt maksimum etter sinn på etterfølgende kanten, der det faller kraftig6.
Ved siden av protein kvalitet er kvaliteten på støttede lipid bilayers mest avgjørende for en vanlig selv-organisering av MinCDE. På den ene siden hvis membranen vasket for overdrevet eller underliggende overflaten er renset og dermed belastet for sterkt, hull kan danne i membranen (figur 6A, topp). På den annen side hvis membranen ikke er vasket skikkelig ikke eller underliggende overflaten rengjort/hydrophilized, blemmer vil holde seg til membranen eller membran flyt blir kompromittert (figur 6A, bunnen). Selv om ikke så tydelig som når observere membranen direkte via merket lipider, disse problemene kan også bli oppdaget fra sinn fluorescens signalet, som mønstre er ikke vanlige og fluorescens i maxima er ikke homogen, men inneholder "hull" eller lyspunkter som vist i midtre panelet i figur 6A.
For MinDE selv organisasjonen i stav-formet PDMS microstructures summeres prosedyren i Figur 4. Flere protokollen trinn trenger ikke gjentas, som proteiner og lipider kan gjenbrukes. Som ikke-mønstret underlag, underlaget er renset og hydrophilized (av plasma-rengjøring), en støttet lipid bilayer er dannet på PDMS og Self-Organization analysen er satt opp i et volum på 200 µL. For å kontrollere at en skikkelig membran har dannet og MinDE selv organiserer på membranen, er kamrene fotografert. Når en riktig membran har blitt dannet, MinDE skjemaer vanlig reise overflaten bølger på overflaten av PDMS mellom de individuelle microstructures og selv organiserer også nederst på microstructures bølger kan fritt flytte over hele membranen dekkes overflate (figur 5A). Etter buffer fjerning, bør overflaten mellom seksjonene ikke vise noen spre MinDE mønstre (figur 5B), som det skal være helt tørr. Hvis MinDE mønstre er fortsatt, må mer bufferen fjernes. Proteiner er nå begrenset i stav-formet microcompartments membran-kledd PDMS og luft i øvre grensesnittet (figur 5C), som de selv organiserer. Under disse forholdene kan to proteinene utføre Pol-til-Pol svingninger som vist i figur 5 d. Som en brøkdel og min er alltid membran-bundet, også er under buffer fjerning, konsentrasjonen etter buffer fjerning ikke sammenlignbare å input konsentrasjoner. På grunn av denne effekten variere konsentrasjonen også mellom individuelle microstructures på den samme dekkglassvæske som de er avhengig av plasseringen av mønstrene før bufferen fjerning. Silisium wafer produksjon eller PDMS molding fra silicon kjeks kan resultere i ufullstendige microstructures som ikke kan brukes for analyse (figur 6B). Videre, på grunn av bufferen fjerning microstructures kan tørke ut under prosessen, og derfor bør utelukkes fra videre analyse (figur 6B). Resultatet viser bare en brøkdel av microstructures i et kammer ønsket Pol-til-Pol svingninger. Analysere protein dynamikk i microstructures, kan en kymograph fås ved å tegne et utvalg over hele strukturen (figur 5E). Da MinCDE svinge fra pole-til-Pol, vil MinC og sinn vise en gjennomsnittlige konsentrasjon gradient med maksimal konsentrasjon ved kupé polene og minimal konsentrasjon i batterirommet (figur 5F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig1.jpg"> Figur 1: SDS-siden viser siste produkter av protein renselser. Hans sinn (33.3 kDa), hans-eGFP-sinn (60.1 kDa), hans-mRuby3-sinn (59.9 kDa), hans-MinE (13.9 kDa) og hans-MinC (28.3 kDa) vises i rekkefølge. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig2.jpg"> Figur 2: prosessflyten diag viser de individuelle trinnene og timing av protokollen for et selv-organisering på ikke-mønstret støttes lipid bilayers (trinn 1-6). Stiplede bokser angir at en av disse to alternativene kan brukes for rengjøring. Pilene preget av sirkler angir hvor protokollen kan midlertidig og fortsette senere. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig3.jpg"> Figur 3: Imaging MinDE analysen av AC confocal mikroskopi. A) vanlig Min spiral, fra hvilken bølge overføring hastighet og intensitet tomten hastighet målinger kan oppnås. Konsentrasjoner brukes: 0.6 µM sinn (30% eGFP-sinn), 1,8 µM hans-MinE (30% hans-min-Alexa647) B) eksempel normalisert intensitet tomten for regionen merket i A. C) oversikt over hele analysen kammer (skala bar: 1 mm, samme protein konsentrasjoner som over). Spiraler slå begge retninger samt målet mønstre kan observeres. Det forstørrede området viser hvordan bølgemønstre forskjellig på UV-limet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig4.jpg"> Figur 4: prosessflyten diag viser de individuelle trinnene og timing av protokollen for selvstendig organisasjon i stav-formet microstructures (trinn 1-5, 7, 8). Grå bokser angir trinn der produkter kan gjenbrukes fra protokollen på ikke-mønstret støttes lipid bilayers. Pilene preget av sirkler angir hvor protokollen kan midlertidig og fortsette senere. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig5.jpg"> Figur 5: representant resultater for MinDE mønster dannelse i stav-formet PDMS microcompartments. A) MinDE selv organisere på overflaten av PDMS danner reiser overflatebølger (1 µM sinn (30% EGFP-sinn), 2 µM MinE og 2,5 ATP). B) når bufferen er senket til høyden på microstructures, protein selv-organisering stopper på planar overflaten mellom microcompartments. C) skjematisk av en stav-formet microcompartment. D) representant bilder av MinDE Pol-til-Pol svingninger etter buffer fjerning. E) Kymograph av svingninger langs den uthevede linjen vist i D). F) bildet og profil av gjennomsnittlig fluorescens intensiteten av tiden-serien vist i D) tydelig viser protein graderingen maksimal på microcompartment polakkene og minimal ved kupé. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig6.jpg"> Figur 6: eksempler på negative eksperimentelle resultater. A) over vasket membraner samle hull, mens suboptimal vesicle forberedelser og lipid komposisjoner føre til stikker blemmer. To center panelene viser en kombinasjon av både problemer og hvordan de blir synlige når observere Min svingninger. Membraner var merket med 0,05% Atto655-DOPE. (skala barer: 50 µm) B) toppanelet: tørket ut microcompartments kan skyldes mye buffer fjerning eller når bufferen fordamper over tid. Nedre panelet: ufullstendig avdelinger kan dannes under wafer produksjon eller PDMS molding. (skala barer: 30 µm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig6large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Supplerende filen 1: Plasmider kart for hans sinn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/01_pET28a-MinD-MinE.gb%20" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende filen 2: Plasmider kart for hans-EGFP-sinn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/02_pET28a-EGFP-MinD.gb" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende filen 3: Plasmider kart for hans-mRuby3-sinn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/03_pET28a-mRuby3-MinD.gb" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende filen 4: Plasmider kart for hans-MinE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/04_pET28a-MinE.gb" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende fil 5: Plasmider kart for hans MinC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/05_pET28a-MinC.gb" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende filen 6: CAD-filen for silisium wafer av stav-formet microcompartments. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/JoVe_wafer_rod-like-structures_3x3.dwg" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers at JoVE.com

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Vi tilbyr en protokoll for i vitro Self-Organization analyser og MinE på en støttet lipid bilayer i en åpen kammer. I tillegg beskriver vi hvordan du setter analysen i lipid-kledd PDMS microcompartments å etterligne i vivo forhold av reaksjon confinement.

In Vitro Rekonstituering selv organisere Protein mønstre på støttede Lipid Bilayers

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Bruke Stillas liposomer for å rekonstituere Lipid-proksimale Protein-protein interaksjoner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrospray-ionisering Hydrogen-deuterium Veksling massespektrometri for å studere Protein struktur og dynamikk

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

In Vitro Av F-utgangen på tidlig Endosomes

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Vaskemiddel uten lynraske rekonstituering membran proteiner i Lipid Bilayers bruker Fusogenic komplementære-ladet Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rensing og rekonstituering av TRPV1 for Spectroscopic analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry å studere Binding dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til Solid-støttet Lipid Bilayers bruker et Quartz-Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse av proteinfolding, Transport og nedbrytning i levende celler av radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Vaskemiddel-assistert rekonstituering av rekombinant Drosophila Atlastin til liposomer for lipid-miksing analyser

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Bruk av mikroskala termoforese for å måle protein-lipid interaksjoner

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolering av aktiv caenorhabditt elegans kjernefysisk ekstrakt og rekonstituering for in vitro transkripsjon

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...