Name: in vitro reconstitution of self-organizing protein patterns on supported lipid bilayers
Uploaded: 2018-07-28T14:45:00
Duration: 8 min 10 s
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Agradecemos a Michael Heymann e Frank Siedler para produção de silício wafers, Core Facility MPI-B para obter assistência na purificação de proteínas e Simon Kretschmer e Leon Harrington para comentários sobre o manuscrito.

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	<li>Soh, S., Byrska, M., Kandere-Grzybowska, K., Grzybowski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction-diffusion+systems+in+intracellular+molecular+transport+and+control.">Reaction-diffusion systems in intracellular molecular transport and control.</a> Angew Chemie Int Ed. 49 (25), 4170-4198 (2010).</li><li>Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ParA/MinD+family+puts+things+in+their+place.">The ParA/MinD family puts things in their place.</a> Trends Microbiol. 20 (9), 411-418 (2012).</li><li>Shih, Y. -. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-bound+MinDE+complex+acts+as+a+toggle+switch+that+drives+Min+oscillation+coupled+to+cytoplasmic+depletion+of+MinD.">Membrane-bound MinDE complex acts as a toggle switch that drives Min oscillation coupled to cytoplasmic depletion of MinD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), E1479-E1488 (2016).</li><li>Kretschmer, S., Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+modulation+of+reconstituted+Min+protein+patterns+and+gradients+by+defined+mutations+in+MinE's+membrane+targeting+sequence.">Large-scale modulation of reconstituted Min protein patterns and gradients by defined mutations in MinE's membrane targeting sequence.</a> PLoS One. 12 (6), e0179582 (2017).</li><li>Schweizer, J., Loose, M., Bonny, M., Kruse, K., Monch, I., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometry+sensing+by+self-organized+protein+patterns.">Geometry sensing by self-organized protein patterns.</a> Proc Natl Acad Sci. 109 (38), 15283-15288 (2012).</li><li>Martos, A., Raso, A., Jim&#233;nez, M., Petr&#225;&#353;ek, Z., Rivas, G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+polymers+tethered+to+the+membrane+by+ZipA+are+susceptible+to+spatial+regulation+by+min+waves.">FtsZ polymers tethered to the membrane by ZipA are susceptible to spatial regulation by min waves.</a> Biophys J. 108 (9), 2371-2383 (2015).</li><li>Vecchiarelli, A. G., Li, M., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+affinities+of+MinD+and+MinE+to+anionic+phospholipid+influence+Min+patterning+dynamics+in+vitro.">Differential affinities of MinD and MinE to anionic phospholipid influence Min patterning dynamics in vitro.</a> Mol Microbiol. 93 (3), 453-463 (2014).</li><li>Glock, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+a+biological+reaction-diffusion+system.">Optical control of a biological reaction-diffusion system.</a> Angew Chemie Int Ed. 57 (9), 2362-2366 (2018).</li><li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+pole-to-pole+oscillations+of+min+proteins+in+microengineered+polydimethylsiloxane+compartments.">Reconstitution of pole-to-pole oscillations of min proteins in microengineered polydimethylsiloxane compartments.</a> Angew Chemie Int Ed. 52 (1), 459-462 (2013).</li><li>Miyagi, A., Ramm, B., Schwille, P., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed+Atomic+Force+Microscopy+Reveals+the+Inner+Workings+of+the+MinDE+Protein+Oscillator.">High-Speed Atomic Force Microscopy Reveals the Inner Workings of the MinDE Protein Oscillator.</a> Nano Lett. 18 (1), 288-296 (2017).</li><li>Ramirez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treadmilling+analysis+reveals+new+insights+into+dynamic+FtsZ+ring+architecture.">Treadmilling analysis reveals new insights into dynamic FtsZ ring architecture.</a> PLoS Biol. 16 (5), e2004845 (2018).</li><li>Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+motors+fragment+and+compact+membrane-bound+actin+filaments.">Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments.</a> Elife. 2, e00116 (2013).</li><li>Zieske, K., Schweizer, J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+topology+assisted+alignment+of+Min+protein+waves.">Surface topology assisted alignment of Min protein waves.</a> FEBS Lett. 588 (15), 2545-2549 (2014).</li><li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Herold, C., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Min+protein+patterns+emerge+from+rapid+rebinding+and+membrane+interaction+of+MinE.">Min protein patterns emerge from rapid rebinding and membrane interaction of MinE.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (5), 577-583 (2011).</li><li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+geometry-modulated+protein+patterns+in+membrane+compartments.">Reconstituting geometry-modulated protein patterns in membrane compartments.</a> Methods Cell Biol. 128, 149-163 (2015).</li><li>Gruenberger, A., Probst, C., Heyer, A., Wiechert, W., Frunzke, J., Kohlheyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+picoliter+bioreactor+for+microbial+single-cell+analysis:+fabrication,+system+setup,+and+operation.">Microfluidic picoliter bioreactor for microbial single-cell analysis: fabrication, system setup, and operation.</a> J Vis Exp. (82), e50560 (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Loose, M., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+self-organization:+Lessons+from+the+min+system.">Protein self-organization: Lessons from the min system.</a> Annu Rev Biophys. 40, 315-336 (2011).</li><li>Arumugam, S., Petra&#353;ek, Z., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MinCDE+exploits+the+dynamic+nature+of+FtsZ+filaments+for+its+spatial+regulation.">MinCDE exploits the dynamic nature of FtsZ filaments for its spatial regulation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1192-E1200 (2014).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Descrevemos um protocolo para a reconstituição em vitro de auto-organização MinCDE em planar suportadas bilayers do lipid e em lipídios BICAMADA coberto estruturas 3D, usando o exemplo de microestruturas PDMS de forma cilíndrica. A fim de obter dados valiosos destes ensaios, os fatores mais importantes para o controle são proteínas e membrana de qualidade.
Para garantir a qualidade da proteína, proteína em massa deve ser confirmada usando SDS-PAGE e espectrometria de massa. Além disso, deve ser verificado que as proteínas são solúveis e não agregados, usando analítico gel filtração ou difusão dinâmica da luz. Filtração de gel pode ser usada para remover qualquer fração de agregados de proteínas. Ajuste do pH cuidado e qualidade de nucleotídeos adicionados é crítico, como a adição de nucleótidos não-ajustadas ou parcialmente degradados à proteína estoques ou ensaios de auto-organização é suficiente para eliminar a atividade da proteína, abolindo, portanto auto-organização.
Ao lado da qualidade de proteína, qualidade da membrana é mais crítica e formação inadequada da membrana é frequentemente a causa para a auto-organização defeituosa e a origem das estruturas de superfície artefactual.
Ao executar o protocolo pela primeira vez, é útil rotular os bilayers do lipid suportados, incluindo lipídios rotulados como Atto-655-DOPE ou DiI em baixas percentagens de molares (0.05%). Assim, as propriedades e a qualidade da membrana podem ser julgados diretamente. Usando o FRAP, a fluidez da membrana pode ser avaliada. Além disso, um diretamente pode avaliar a qualidade da lavagem do SLB, pois lá será demais vesículas, sem membrana fluida ou sem membrana, se ele foi lavado. A abordagem de câmara aberta permite lavar rigorosamente a membrana e, portanto, também para remover as vesículas que estão furando na superfície do SLB. Os fatores mais cruciais para a obtenção de fluido e homogénea com suporte lipid bilayers são a limpeza e a Hidrofilia da superfície de apoio e o tamanho correto e homogeneidade de SUvs pode ser útil verificar o tamanho SUV e distribuição de tamanho usando Difusão dinâmica da luz. Para distribuições de tamanho estreito, recomendamos expulsando as vesículas ao invés de sonicating-los. Outros métodos de limpeza de lamelas, por exemplo, tratamentos com bases fortes, detergentes básicos ou usando lamelas diretamente após a lavagem com água, podem produzir bons resultados, dependendo da mistura do aplicativo e lipídios.
A primeira metade do protocolo apresentado aqui, em vitro reconstituição na bilayers planar lipid suportados nas câmaras de aberto, tem a vantagem de renderização da superfície acessível para microscopies ópticas, tais como TIRF microscopia30, FRAP análise6,34, bem como técnicas de sonda de superfície tais como a microscopia de força atômica26de rastreamento único-partícula. A grande área homogênea permite melhores estatísticas em concentrações definidas. Além da abordagem câmara aberta permite para controlar com precisão a concentração de proteína e uma adição rápida e simples de mais componentes, permitindo, portanto, para dosear a concentração de proteína em uma única câmara de20. O ensaio também pode ser expandido através da adição de outros componentes, divisome bacteriana como FtsZ22,35, ZipA22 ou o quimérico proteína FtsZ-YFP-MTS10,35.
Outros grupos têm tido uma abordagem similar para reconstituir o Min sistema em vitro, mas o uso de um fluxo de células em vez de uma câmara aberta17,18,19. Fluxo-as células têm certas vantagens, em especial quando um ambiente 3D totalmente fechado é necessário18, a influência do fluxo17,19,23 ou membrana composição23 sobre os padrões de MinCDE investigado, ou se os padrões de proteína devem ser observados sob proteína limitar condições19. No entanto, o controle local das concentrações moleculares é mais difícil. Componentes de proteínas, especialmente a mente, fortemente ligam à membrana encontram primeiro18,19. Em nossa experiência, as proteínas frequentemente exibem inespecificas de tubulação, enseadas, seringas e outras partes de microfluidic. Daí, as concentrações de proteína locais diferem das concentrações de entrada18 e também variam ao longo do comprimento da célula-fluxo, resultando em uma variedade de padrões diferentes de proteína na membrana entre entrada e saída, como observado por outros19.
A segunda metade do protocolo apresentado aqui, a reconstituição em vitro em microestruturas de forma cilíndrica, re-utilizando a abordagem de câmara aberta num suporte modelado coberto por lipídios bilayers permite uma simples mímica de comportamento de proteína na vivo controle preciso sobre as concentrações de proteína, embora seja perdido devido à remoção de tampão. Observe que porque o comprimento de onda de MinDE é sobre uma ordem de magnitude maior em vitro do que in vivo as microcompartments em forma de haste são também sobre uma ordem de magnitude maior (10 x 30 µm) do que uma haste em forma de e. coli célula.
Em geral, este protocolo permite o controle preciso de todas as condições, incluindo a concentração de proteína, composição de tampão e propriedades da membrana. O uso do 3D suporta estruturada permite que a reação a ser estudado sob confinamento espacial, imitando o comportamento na vivo sem a necessidade de equipamento de microfluídica complexo.

Spatiotemporal padrões são essenciais na natureza, regulação de tarefas complexas no nível celular e multicelular, da morfogênese regulamentado divisão celular1,2. Sistemas de reação-difusão desempenham um papel importante no estabelecimento desses padrões, mas são ainda não bem compreendidos. Um exemplo de um sistema de reação-difusão e o melhor sistema biológico caracterizado até agora é a Escherichia coli MinCDE sistema3,4,5,6,7. O sistema MinCDE oscila de polo de célula para polo de célula em Escherichia coli para determinar o meio da célula, como o site da divisão futura. Este sistema baseia-se na mente da ATPase, a activação da proteína, mina e a membrana como uma reação espacial matriz8ATPase. MinC não é parte do mecanismo de formação do teste padrão, mas é o agente funcional real: um inibidor da divisome principal proteína FtsZ5,6. MinC vincula-se à mente e, portanto, segue as oscilações, resultando em um gradiente de concentração de proteína a média de tempo que é máxima nos polos da célula e mínimas, quando no meio da célula, permitindo apenas FtsZ polimerizar em midcell9,10 . O sistema MinCDE é parte da maior família de Walker A ATPases que são fundamentais para a organização spatiotemporal em bactérias2, de posicionamento e transporte de proteína complexos11 e plasmídeos12 e para a regulação da célula Divisão13 cromossomo segregação e14. Portanto, o sistema de reação-difusão de MinCDE não só representa um sistema de reação-difusão arquetípica, mas também tem atraído a atenção por causa de sua relevância para a organização spatiotemporal em bactérias.
Estudos detalhados de funcionais do MinCDE sistema na vivo são complicados, como manipulação de exclusão proteínas e gene normalmente resultar em defeitos de divisão celular. Além disso, alterando a composição da membrana ou as propriedades do citosol na vivo é muito desafiador15,16. Mudanças para o sistema e influenciando fatores são difíceis de interpretar no complexo ambiente da célula, ainda mais se ele é meio louco em uma função tão essencial como a divisão celular. Nós e os outros têm, portanto, virou-se para uma abordagem reconstituição in vitro , reduzindo o sistema para seus componentes principais: mente, minha, ATP como fonte de energia e a bicamada lipídica com suporte como uma reação matriz6,17, 18. esta abordagem bottom-up permite sondar o mecanismo de auto-organização em detalhes sem a complexidade de uma célula viva. A forma de proteínas viajando superfície ondas6 e outros tipos de padrões de17,19 sob essas condições, embora com um comprimento de onda, que é geralmente sobre uma magnitude maior do que na vivo. O uso de uma câmara aberta facilita um controle preciso sobre todos os aspectos que influenciam a formação do teste padrão: as concentrações de proteína6, proteína propriedades20, membrana composição10, composição de tampão e concentração de ATP 6, bem como a adição de outros factores como apinhamento agentes21 e outras proteínas de divisome22. Em comparação, a reconstituição em vitro do sistema em uma pilha de fluxo18,19,23 MinCDE pode ser usada para investigar a influência do fluxo17,23, proteína limitar as condições19, membrana composição19 e confinamento 3D completo18 em padrões de proteína, mas processa um controle exato da concentração de proteína/componente e componente sequencial adição muito mais complicado.
Usando esta câmara aberta, nós também modelado o apoio dos bilayers do lipid planar pelo qual um pode sondar como geométricos limites influência padrão formação21, um fenômeno que tem recentemente sido também investigados na vivo usando bactérias moldado em microestruturas7. Também utilizamos este ensaio para investigar as mutações como definidas no meu afeto padrão de formação do sistema20. Além disso, o mesmo formato básico do ensaio foi empregado para investigar como formação padrão pode ser controlada pela luz, apresentando um peptídeo de mina azobenzeno-quitosana para o ensaio e imagem latente com TIRF microscopia24.
Nós achamos que, a fim de replicar o padrão de MinDE formação observados na vivo em um confinamento de sistema, em vitro foi chave. Usar microcompartments de forma cilíndrica, com dimensões ajustadas para o maior comprimento de onda de MinDE em vitro (10 x 30 µm), folheados ou chapeados de uma bicamada lipídica com suporte permitiu a reconstituição das oscilações de polo a polo de MinDE e formação de gradiente de proteína 10,25. Neste ensaio, os bilayers do lipid suportados são depositados sobre um substrato PDMS padronizado que contém várias centenas réplicas de microcompartments de forma cilíndrica que permanecem abertos na parte superior. Por isso, a reação pode ser configurada numa câmara aberta, e posteriormente o buffer é abaixado até a borda do microcompartments, confinando, assim, a reação a um volume pequeno. Mesmo que estes compartimentos têm uma interface ar-tampão de um lado e, portanto, não representam um confinamento 3D por membrana, a dinâmica da proteína imitada no vivo oscilações10,25. Comparado ao confinamento totalmente 3D, que mostra muito semelhante resultados18, o ensaio aberto microestruturas é relativamente simples e fácil de manipular e também pode ser realizada por laboratórios que não estejam equipados com equipamentos especializados microfluídica e instalações de salas limpas.
Aqui, apresentamos um protocolo experimental para reconstituir MinCDE formação padrão em suporte lipid bilayers em vitro usando uma câmara aberta que permite o controle de todos os componentes e fácil acesso por microscopia óptica e, com menor modificações, também é adaptável para técnicas de superfície-sonda26. Ao lado de bilayers planar com suporte lipídico, mostramos também como o confinamento de proteína pode ser obtido usando bilayers simples estampados com suporte lipídico na forma de microestruturas PDMS. Estes ensaios, apesar de otimizado para o sistema de MinCDE, também podem ser transferidos para outros sistemas de proteínas que interagem de forma semelhante com a membrana, tais como FtsZ27 ou um mínimo de actina córtex28.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPG</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli polar lipid extract</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>100600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt trihydrate</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-diphosphate monopotassium salt dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5285-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27810.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9277.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCl</td>
			<td>Termo Fisher Scientific</td>
			<td>20491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Diamine Tetraacetate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.08418.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid 98%</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>173163.1611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide 50%</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>147064.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>05288.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102950</td>
			<td>Uvasol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol 86%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2316.x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atto-655-DOPE</td>
			<td>Atto Tec</td>
			<td>AD 655-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS base</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td></td>
			<td>SYLGARD 184</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS crosslinker</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Glue</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>6801</td>
			<td>#68 and #63 both work well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips #1.5 24x24 mm</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips #1 24x24 mm</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td></td>
			<td>used only for PDMS microstructures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml reaction tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;0030123301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>culture flask 2L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>e.g. 734-1905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-Trap HP</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfiltration column: HiLoad Superdex 75 PG or 200 PG</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac 10DG desalting column prepacked column</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7322010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis device: Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 0.1 - 0.5 mL or 0.5-3 mL</td>
			<td>Termo Fisher Scientific</td>
			<td>66333 or 66330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>razor blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure water: Milli-Q Type 1 Ultrapure Water Systems</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>automated protein purification system: &#196;kta Pure</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bath sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td>e.g. Model 1510</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARE-250 mixer</td>
			<td>Thinky Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner Zepto</td>
			<td>Diener electronic</td>
			<td></td>
			<td>use oxygen as process gas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>positive displacement pipettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td></td>
			<td>Transferpettor models with glass tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM780 confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Fitted with Zeiss C-Apochromat 40X/1.20 water-immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28a-His-MinD_MinE</td>
			<td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td>
			<td></td>
			<td>plasmid encoding His-MinD and non-tagged MinE to improve yield</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28a-His-MinE</td>
			<td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td>
			<td></td>
			<td>plasmid encoding His-MinE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28a-His-EGFP-MinD</td>
			<td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td>
			<td></td>
			<td>plasmid encoding His-EGFP-MinD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28a-His-mRuby3-MinD</td>
			<td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td>
			<td></td>
			<td>plasmid encoding His-mRuby3-MinD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28a-His- MinC</td>
			<td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td>
			<td></td>
			<td>plasmid encoding His-MinC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro reconstitution of self-organizing protein patterns on supported lipid bilayers

Muitos aspectos da organização spatiotemporal fundamental das células são regidos por sistemas do tipo de reação-difusão. In vitro a reconstituição desses sistemas permite estudos detalhados de seus mecanismos subjacentes que não seria viáveis in vivo. Aqui, nós fornecemos um protocolo para a reconstituição em vitro do sistema MinCDE de Escherichia coli, que posiciona o septo de divisão celular no meio celular. O ensaio é projetado para fornecer apenas os componentes necessários para a auto-organização, ou seja uma membrana, as duas proteínas mente e minas e energia sob a forma de ATP. Nós, portanto, fabricar uma câmara de reação aberta sobre uma lamela, no qual é formada uma bicamada lipídica com suporte. O projeto aberto da câmara permite a preparação ideal da bicamada lipídica e manipulação controlada do conteúdo em massa. As duas proteínas, mente e minas, bem como ATP, é adicionado para o volume em massa acima da membrana. Imagem é possível por muitos microscopies ópticos, como o projeto suporta confocal, campo largo e microscopia TIRF igual. Em uma variação do protocolo, a bicamada lipídica é formada num suporte padronizado, na forma de célula microestruturas PDMS, em vez de vidro. Reduzindo a solução em massa até a borda desses compartimentos inclui a reação em um compartimento de menor e fornece os limites que permitem imitar na vivo comportamento oscilatório. Tomados em conjunto, descrevemos os protocolos para reconstituir o sistema de MinCDE com e sem confinamento espacial, permitindo que pesquisadores precisamente controlar todos os aspectos que influenciam a formação de padrão, tais como intervalos de concentração e adição de outros factores ou proteínas e sistematicamente aumentar a complexidade do sistema em uma instalação experimental relativamente simples.

Purificação de proteínas, a seguir o nosso protocolo deve produzir proteínas Min de pureza adequada. Como referência, a Figura 1 fornece uma imagem de SDS-PAGE da mente, fluorescente rotulados mente, meu e do MinC. Os passos individuais do procedimento para realizar um ensaio de auto-organização de MinDE em bilayers não-modelados com suporte lipídico são descritos na Figura 2. Usando este protocolo, MinDE regular superfície ondas viajantes pode ser observado em toda a câmara (Figura 3). O comprimento de onda pode variar ligeiramente dentro da câmara, mas em geral os padrões parecem. As bordas da câmara não devem ser usadas para comparações quantitativas, como membranas que forma sobre a cola UV parece ter propriedades diferentes do que no vidro de superfície (ver Figura 3). As ondas de superfície itinerantes podem ser analisadas através da representação gráfica da intensidade ao longo da direção de propagação (Figura 3B). Enquanto mente fluorescência platôs bastante rápido da borda esquerda da onda e em seguida, diminui acentuadamente à aresta de fuga, mina fluorescência aumenta quase linearmente, desde o início da onda de mente e atinge o seu máximo depois mente à aresta de fuga, onde ele cai acentuadamente6.
Ao lado de qualidade de proteínas, a qualidade do bilayers do lipid suportados é mais crítica para uma self-Organização regular de MinCDE. Por um lado se a membrana é lavada também excessivamente ou a superfície subjacente foi limpada e, portanto, carregada também fortemente, buracos podem formar na membrana (figura 6A, topo). Por outro lado, se a membrana não é lavada corretamente ou a superfície subjacente não é limpo/hydrophilized, vesículas vão ficar com a membrana ou a fluidez da membrana pode ser comprometida (figura 6A, inferior). Embora não tão evidente como ao observar a membrana diretamente via rotuladas lipídios, estes problemas também podem ser detectados do sinal de fluorescência da mente, como os padrões não são regulares e a fluorescência no maxima não é homogênea, mas contém "buracos" ou pontos brilhantes como mostrado no painel médio da figura 6A.
Para a auto-organização de MinDE, em forma de microestruturas PDMS, o procedimento está resumido na Figura 4. Várias etapas de protocolo não precisam ser repetidos, como proteínas e lipídios podem ser reutilizados. Como em substratos não-padronizada, o substrato é limpo e hydrophilized (por plasma-limpeza), uma com suporte lipídica é formada sobre o PDMS e o ensaio de auto-organização é criado em um volume de 200 µ l. Para verificar que formou-se uma membrana apropriada e MinDE Self organiza na membrana, são imagens de câmaras. Quando uma membrana apropriada foi formada, formas de MinDE regular superfície ondas viajantes na superfície dos PDMS entre as microestruturas individuais e auto organiza também na parte inferior das microestruturas como as ondas podem livremente mover ao longo de todo superfície coberta de membrana (Figura 5A). Após a remoção do tampão, a superfície entre os compartimentos não deve apresentar qualquer propagação padrões de MinDE (Figura 5B), como deve ser totalmente seco. Se os padrões de MinDE são ainda em movimento, mais reserva precisa ser removido. As proteínas estão confinadas na microcompartments em forma de haste pela membrana-folheados PDMS e pelo ar na interface superior (Figura 5), no qual eles Self organizará.... Nestas condições as duas proteínas podem realizar oscilações de polo a polo, conforme mostrado na Figura 5. Como uma fração da mente e o meu é sempre membrana-limite, também durante a remoção do tampão, as concentrações após a remoção do tampão não são comparáveis às concentrações de entrada. Devido a este efeito as concentrações variam também entre microestruturas individuais na mesma lamela como eles dependem da posição dos padrões antes da remoção do tampão. Produção de bolacha de silício ou moldagem de PDMS do wafer de silício pode resultar em microestruturas incompletas que não podem ser usadas para análise (Figura 6B). Além disso, devido ao buffer de microestruturas de remoção podem secar durante o processo e, portanto, devem ser excluídas mais de análise (Figura 6B). Como resultado, apenas uma fração das microestruturas em uma câmara mostra as oscilações de polo a polo desejadas. Para analisar a dinâmica da proteína nas microestruturas, um kymograph pode ser obtido por uma seleção de desenho ao longo de toda a estrutura (Figura 5E). Quando MinCDE oscilar de polo a polo, MinC e mente mostrará um gradiente de concentração-a média de tempo com concentração máxima nos polos do compartimento e concentração mínima no meio do compartimento (Figura 5F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig1.jpg"> Figura 1: mostrando os produtos finais de purificação da proteína de SDS-PAGE. Sua mente (33,3 kDa), His-eGFP-mente (60.1 kDa), His-mRuby3-mente (59,9 kDa), sua mina (13.9 kDa) e His-MinC (28,3 kDa) são mostradas em ordem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig2.jpg"> Figura 2: diagrama de fluxo de processo, mostrando os passos individuais e sincronismo do protocolo para a auto-organização na bilayers não-modelados com suporte lipídico (passos 1-6). Caixas tracejadas indicam que uma destas duas opções pode ser usada para a limpeza. Setas marcadas por círculos indicam onde o protocolo pode ser pausado e retomado mais tarde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig3.jpg"> Figura 3: imagem do ensaio de MinDE por microscopia confocal. A) Min Regular espiral, do qual velocidade de propagação da onda, a trama de intensidade e velocidade as medições podem ser obtidas. Concentrações utilizadas: 0,6 µM se importa (30% eGFP-mente), 1,8 µM sua mina-(30% sua-mina-Alexa647) B) enredo de intensidade normalizada de exemplo para a região marcada em r. C) visão geral da câmara de ensaio inteiro (barra de escala: 1 mm, as concentrações de proteína mesmo como acima). Espirais, transformando qualquer direção, bem como padrões de destino podem ser observados. A região ampliada mostra como padrões de onda diferem na UV-cola. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig4.jpg"> Figura 4: diagrama de fluxo de processo, mostrando os passos individuais e sincronismo do protocolo para auto-organização em microestruturas em forma de haste (passos 1-5, 7, 8). Caixas cinzentas indicam etapas onde os produtos podem ser reutilizados de protocolo na bilayers lipídico com suporte não-padronizada. Setas marcadas por círculos indicam onde o protocolo pode ser pausado e retomado mais tarde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig5.jpg"> Figura 5: formação em forma de PDMS microcompartments de padrão de resultados representativos para MinDE. A) MinDE se auto-organizar na superfície do PDMS formando ondas de superfície de viagem (se importa 1 µM (30% EGFP-mente), 2 µM meu e 2,5 mM ATP). B) após o buffer é reduzido para a altura das microestruturas, a auto-organização de proteína para na superfície planar entre o microcompartments. C) esquemático de um microcompartment de forma cilíndrica. D) imagens representativas das oscilações de polo a polo MinDE após a remoção do tampão. E) Kymograph das oscilações ao longo da linha realçada mostrada a D). F) imagem e perfil da intensidade média de fluorescência do tempo-série mostrada em D) mostrando claramente o gradiente de proteína que é máxima nos polos de microcompartment e mínima no meio do compartimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig6.jpg"> Figura 6: exemplos de resultados experimentais negativos. A) membranas over lavadas acumulam buracos, enquanto preparações suboptimal vesículas e composições lipídicas levam a degola de vesículas. Os painéis de dois centro mostram uma combinação de ambos os problemas e como eles se tornam visíveis quando observar oscilações de Min. Membranas foram rotuladas com 0.05% Atto655-DOPE. (barras de escala: 50 µm) B) painel superior: secou microcompartments pode ser causado por demasiado remoção de tampão ou quando o buffer evapora ao longo do tempo. Painel inferior: compartimentos incompletos podem ser formados durante a produção da bolacha ou moldagem de PDMS. (barras de escala: 30 µm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Arquivo complementar 1: Mapa do plasmídeo para sua mente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/01_pET28a-MinD-MinE.gb%20" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo complementar 2: Mapa do plasmídeo para His-EGFP-mente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/02_pET28a-EGFP-MinD.gb" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo complementar 3: Mapa do plasmídeo para His-mRuby3-mente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/03_pET28a-mRuby3-MinD.gb" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo complementar 4: Mapa do plasmídeo para sua mina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/04_pET28a-MinE.gb" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo complementar 5: Mapa do plasmídeo para His-MinC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/05_pET28a-MinC.gb" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo complementar 6: Arquivo CAD para wafer de silício de microcompartments de forma cilíndrica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/JoVe_wafer_rod-like-structures_3x3.dwg" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

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In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Nós fornecemos um protocolo para in vitro ensaios de auto-organização da mente e da minha em uma bicamada lipídica suportados numa câmara aberta. Além disso, descrevemos como delimitar o ensaio em lipídios-folheados microcompartments PDMS para imitar as condições na vivo por confinamento de reação.

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