Name: in vitro reconstitution of self-organizing protein patterns on supported lipid bilayers
Uploaded: 2018-07-28T14:45:00
Duration: 8 min 10 s
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Agradecemos a Michael Heymann y Frank Siedler para la producción de silicio obleas, Core instalación MPI-B ayuda en la purificación de la proteína y Simon Kretschmer y Leon Harrington para comentarios sobre el manuscrito.

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	<li>Soh, S., Byrska, M., Kandere-Grzybowska, K., Grzybowski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction-diffusion+systems+in+intracellular+molecular+transport+and+control.">Reaction-diffusion systems in intracellular molecular transport and control.</a> Angew Chemie Int Ed. 49 (25), 4170-4198 (2010).</li><li>Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ParA/MinD+family+puts+things+in+their+place.">The ParA/MinD family puts things in their place.</a> Trends Microbiol. 20 (9), 411-418 (2012).</li><li>Shih, Y. -. 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G., Li, M., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+affinities+of+MinD+and+MinE+to+anionic+phospholipid+influence+Min+patterning+dynamics+in+vitro.">Differential affinities of MinD and MinE to anionic phospholipid influence Min patterning dynamics in vitro.</a> Mol Microbiol. 93 (3), 453-463 (2014).</li><li>Glock, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+a+biological+reaction-diffusion+system.">Optical control of a biological reaction-diffusion system.</a> Angew Chemie Int Ed. 57 (9), 2362-2366 (2018).</li><li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+pole-to-pole+oscillations+of+min+proteins+in+microengineered+polydimethylsiloxane+compartments.">Reconstitution of pole-to-pole oscillations of min proteins in microengineered polydimethylsiloxane compartments.</a> Angew Chemie Int Ed. 52 (1), 459-462 (2013).</li><li>Miyagi, A., Ramm, B., Schwille, P., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed+Atomic+Force+Microscopy+Reveals+the+Inner+Workings+of+the+MinDE+Protein+Oscillator.">High-Speed Atomic Force Microscopy Reveals the Inner Workings of the MinDE Protein Oscillator.</a> Nano Lett. 18 (1), 288-296 (2017).</li><li>Ramirez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treadmilling+analysis+reveals+new+insights+into+dynamic+FtsZ+ring+architecture.">Treadmilling analysis reveals new insights into dynamic FtsZ ring architecture.</a> PLoS Biol. 16 (5), e2004845 (2018).</li><li>Vogel, S. 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Los autores no tienen nada que revelar.

Hemos descrito un protocolo para la reconstitución en vitro de MinCDE uno mismo-organización en planar bicapas de lipidos y en lípidos bicapa cubiertas estructuras 3D, utilizando el ejemplo de microestructuras en forma de PDMS. Para obtener valiosos datos de estos ensayos, los factores más importantes a controlar son proteínas y membrana de calidad.
Para garantizar la calidad de proteína, proteína de masa debe confirmarse mediante SDS-PAGE y espectrometría de masas. Además, debe verificarse que las proteínas son solubles y no agregados, mediante filtración de gel analítica o dispersión de luz dinámica. Filtración de gel puede utilizarse para quitar cualquier fracción de agregados de proteínas. Ajuste del pH cuidado y calidad de agregado nucleótidos es crítica, como la adición de nucleótidos parcialmente degradadas o no ajustados a la proteína de stocks o ensayos de auto-organización es suficiente para eliminar la actividad de la proteína, por lo tanto, supresión uno mismo-organización.
Junto a la calidad de la proteína, membrana de calidad es más crítica y formación inadecuada de la membrana suele ser la causa de la defectuosa organización autónoma y el origen de estructuras superficiales artefactuales.
Cuando se realiza el Protocolo por primera vez, es útil etiquetar las bicapas lipídicas soportadas mediante la inclusión de lípidos etiquetados como Atto-655-droga o DiI en bajos porcentajes molares (0.05%). Así las propiedades y la calidad de la membrana pueden medirse directamente. Con el FRAP, la fluidez de la membrana puede ser evaluada. Además, directamente uno puede evaluar la calidad de lavado de la SLB, como habrá o bien ser muchas vesículas, no hay membrana fluida o sin membrana, si ha sido lavada. El enfoque de la cámara abierto permite lavar rigurosamente la membrana y por lo tanto, también para eliminar las vesículas que se están pegando en la superficie de la SLB. Los factores más importantes para la obtención homogénea lipídicas bicapas son la limpieza y la hidrofilia de la superficie de apoyo y el correcto tamaño y homogeneidad de SUfrente puede ser útil comprobar tamaño SUV y el uso de distribución de tamaño dispersión ligera dinámica. Distribuciones de tamaño estrechas, se recomienda sacar las vesículas en lugar de les sonicando. Otros métodos de limpieza cubreobjetos, por ejemplo, tratamientos con bases fuertes, detergentes base o utilizando cubre-objetos directamente tras el enjuague con agua, pueden producir buenos resultados, dependiendo de la mezcla de aplicación y de los lípidos.
La primera mitad del protocolo presentado aquí, en vitro de la reconstitución en bicapas lipídicas planares en cámaras abiertas, tiene la ventaja de representar la superficie accesible de Microscopías ópticas, como TIRF microscopia30, FRAP Análisis6, solo-partícula seguimiento34, así como técnicas de sonda de superficie como de microscopía de fuerza atómica26. La gran superficie homogénea permite mejores estadísticas a concentraciones definidas. Además el enfoque de cámara abierta permite para controlar con precisión la concentración de proteína y una rápida y simple adición de otros componentes, permitiendo por lo tanto, para valorar la concentración de proteína en un solo compartimiento20. El ensayo también puede ser ampliado por la adición de otros componentes de la divisome bacteriana FtsZ22,35, ZipA22 o la proteína quimérica FtsZ-YFP-MTS10,35.
Otros grupos han adoptado un enfoque similar a reconstituir el Min sistema en vitro, pero uso una celda de flujo en lugar de un compartimiento abierto17,18,19. Células de flujo tienen ciertas ventajas, en particular cuando un entorno 3D totalmente cerrado es necesario18, la influencia de flujo17,19,23 o membrana composición23 patrones de MinCDE investigado, o si los patrones de proteína deben ser observadas bajo limitación de condiciones19de proteína. Sin embargo, el control local de la concentración molecular es más difícil. Componentes de proteína, especial mente, se unen fuertemente a la membrana se encuentra primero con18,19. En nuestra experiencia, las proteínas exhiben con frecuencia la Unión no específica a la tubería, entradas, jeringas y otras partes de microfluidos. Por lo tanto, las concentraciones de proteína local difieren de las concentraciones de entrada18 y también varían a lo largo de la célula de flujo, resultando en una variedad de patrones diferentes de proteínas en la membrana entre entrada y salida, según lo observado por otros19.
La segunda mitad del protocolo presentado aquí, la reconstitución en vitro en volver a utilizar el enfoque de la cámara abierto sobre un soporte con motivos cubierto por lípidos de microestructuras en forma bicapas permite un simple imitador en vivo el comportamiento de la proteína Aunque un control preciso sobre las concentraciones de la proteína se pierde debido a retiro de búfer. Tenga en cuenta que debido a la longitud de onda de MinDE es aproximadamente un orden de magnitud mayor en vitro que in vivo las microcompartments en forma son también sobre un orden de magnitud más grande (10 x 30 μm) que una en forma de e. coli de la célula.
En general, este protocolo permite el control preciso de todas las condiciones incluyendo la concentración de proteína, tampón composición y propiedades de la membrana. El uso de soportes estructurados 3D permite la reacción a estudiar bajo confinamiento espacial, imitando el comportamiento en vivo sin necesidad de equipos complejos de microfluídica.

Patrones espacio-temporales son esenciales en la naturaleza, regulación de tareas complejas a nivel celular y pluricelular, de morfogénesis a división celular regulada1,2. Reacción-difusión sistemas juegan un papel importante en el establecimiento de estos patrones, pero son todavía no bien entendidos. Un ejemplo de un sistema de reacción-difusión y el mejor sistema biológico caracterizado hasta ahora es la Escherichia coli MinCDE sistema3,4,5,6,7. El sistema MinCDE oscila entre polos de la célula al polo de la célula de e. coli para determinar el centro de la célula como el sitio de la futura división. Este sistema se basa en la mente de la ATPasa, la ATPasa proteína activadora, mina y la membrana como una matriz espacial de reacción de8. MinC no es parte del mecanismo de formación de patrón, pero es el real agente funcional: un inhibidor de la proteína FtsZ5,6del divisome principal. MinC se une a la mente y por lo tanto sigue las oscilaciones, lo que resulta en un gradiente de concentración de proteína promedio de tiempo que es máxima en los polos celulares y mínima en el centro de la célula, permitiendo sólo FtsZ polimerizar en midcell9,10 . El sistema de MinCDE es parte de la familia más grande de Walker A ATPases que son claves para la organización espacio-temporal en bacterias2, para la colocación y transporte de proteínas complejos plásmidos de11 y12 y para la regulación de la célula División13 y cromosoma segregación14. Por lo tanto, el sistema de reacción-difusión de MinCDE no sólo representa un sistema reacción-difusión arquetipo, sino que también ha atraído la atención debido a su importancia para la organización espacio-temporal en las bacterias.
Detallados estudios funcionales de la MinCDE sistema en vivo son complicados, como manipulación de eliminación de proteínas y genes típicamente resultan en defectos de la división celular. Además, es muy difícil cambiar la composición de la membrana o las propiedades de cytosol en vivo 15,16. Los cambios en el sistema y que influyen en factores son difíciles de interpretar en el ambiente complejo de la célula, más aún si se disturba en una función tan esencial como la división celular. Nosotros y otros hemos convertido, por tanto, a un enfoque de reconstitución en vitro , reducir el sistema a sus componentes: mente, mina, ATP como fuente de energía y la bicapa lipídica compatibles como una reacción matriz6,17, 18. este enfoque bottom-up permite investigar el mecanismo de la uno mismo-organización en detalle sin la complejidad de una célula viva. La forma de las proteínas viajando superficie ondas6 y otras clases de patrones17,19 bajo estas condiciones, aunque con una longitud de onda que está generalmente sobre una magnitud más grande que en vivo. El uso de una cámara abierta facilita un control preciso sobre todos los aspectos que influyen en la formación de patrones: las concentraciones de proteína6, proteína propiedades20, membrana composición10, tampón composición y concentración de ATP 6, así como la adición de otros factores como la aglomeración de agentes21 y otros de proteínas de divisome22. En comparación, en vitro la reconstitución del sistema MinCDE en una celda de flujo18,19,23 puede utilizarse para probar la influencia de flujo17,23, proteína limitación de las condiciones19, membrana composición19 y confinamiento 3D18 patrones de proteína, pero representa un control exacto de la concentración de proteína o componente y además componente secuencial mucho más complicado.
Usando esta cámara abierta, también modelado el apoyo de las bicapas de lípidos planar por que uno puede probar cómo geométrica límites influencia patrón formación21, un fenómeno que recientemente ha sido también investigado en vivo utilizando bacterias moldeado en microestructuras7. También se empleó este ensayo para investigar cómo definidas mutaciones en mina afecta formación de patrones del sistema20. Además, el mismo formato básico del ensayo se ha empleado para investigar cómo la formación puede ser controlada por luz, introducir un péptido de mina azobenzene-reticulado en el análisis y proyección de imagen de microscopía TIRF24.
Encontramos que, con el fin de replicar el modelo MinDE observa formación en vivo en un confinamiento de sistema, en vitro fue clave. Permite el uso de bastoncillos microcompartments, con dimensiones de ajustar la longitud de onda mayor de MinDE en vitro (10 x 30 μm), revestido de una bicapa lipídica compatibles la reconstitución de MinDE oscilaciones de polo a Polo y la formación de gradiente de la proteína 10,25. En este ensayo, las bicapas lipídicas soportadas son depositados sobre un substrato PDMS modelado que contiene varios cientos réplicas de microcompartments barra-formado que permanecen abiertas en la parte superior. Por esto, la reacción se puede configurar en una cámara abierta, y posteriormente el tampón se baja hasta el borde de la microcompartments, confinando así la reacción a un pequeño volumen. A pesar de estos compartimientos tienen una interfaz de aire-buffer en un lado y por lo tanto no representan un confinamiento completamente en 3D por la membrana, la dinámica de la proteína mímico en vivo oscilaciones10,25. En comparación con el confinamiento completamente en 3D, que muestra muy similar resultados18, el análisis de microestructuras abierto es relativamente simple y fácil de manejar y pueden ser realizadas por laboratorios que no cuentan con equipo especializado de la microfluídica y instalaciones de sala limpia.
Aquí, presentamos un protocolo experimental para reconstituir MinCDE formación en apoyo lípidos bicapas en vitro usando una cámara abierta que permite controlar todos los componentes y fácil acceso por microscopía óptica y, con menor modificaciones, es también adaptable para técnicas de sonda de superficie de26. Al lado de bicapas lipídicas planares, mostramos también como aislamiento de proteína puede ser obtenida usando bicapas lipídicas con motivos simples de microestructuras en forma de PDMS. Estos ensayos, aunque optimizado para el sistema MinCDE, pueden también transferirse a otros sistemas de proteínas que interactúan en una manera similar con la membrana, como FtsZ27 o una corteza actina mínimo del28.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPG</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli polar lipid extract</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>100600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt trihydrate</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-diphosphate monopotassium salt dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5285-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27810.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9277.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCl</td>
			<td>Termo Fisher Scientific</td>
			<td>20491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Diamine Tetraacetate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.08418.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid 98%</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>173163.1611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide 50%</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>147064.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>05288.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102950</td>
			<td>Uvasol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol 86%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2316.x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atto-655-DOPE</td>
			<td>Atto Tec</td>
			<td>AD 655-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS base</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td></td>
			<td>SYLGARD 184</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS crosslinker</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Glue</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>6801</td>
			<td>#68 and #63 both work well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips #1.5 24x24 mm</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips #1 24x24 mm</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td></td>
			<td>used only for PDMS microstructures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml reaction tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;0030123301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>culture flask 2L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>e.g. 734-1905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-Trap HP</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfiltration column: HiLoad Superdex 75 PG or 200 PG</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac 10DG desalting column prepacked column</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7322010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis device: Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 0.1 - 0.5 mL or 0.5-3 mL</td>
			<td>Termo Fisher Scientific</td>
			<td>66333 or 66330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>razor blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure water: Milli-Q Type 1 Ultrapure Water Systems</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>automated protein purification system: &#196;kta Pure</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bath sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td>e.g. Model 1510</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARE-250 mixer</td>
			<td>Thinky Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner Zepto</td>
			<td>Diener electronic</td>
			<td></td>
			<td>use oxygen as process gas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>positive displacement pipettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td></td>
			<td>Transferpettor models with glass tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM780 confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Fitted with Zeiss C-Apochromat 40X/1.20 water-immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28a-His-MinD_MinE</td>
			<td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td>
			<td></td>
			<td>plasmid encoding His-MinD and non-tagged MinE to improve yield</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28a-His-MinE</td>
			<td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td>
			<td></td>
			<td>plasmid encoding His-MinE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28a-His-EGFP-MinD</td>
			<td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td>
			<td></td>
			<td>plasmid encoding His-EGFP-MinD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28a-His-mRuby3-MinD</td>
			<td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td>
			<td></td>
			<td>plasmid encoding His-mRuby3-MinD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28a-His- MinC</td>
			<td>Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td>
			<td></td>
			<td>plasmid encoding His-MinC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro reconstitution of self-organizing protein patterns on supported lipid bilayers

Muchos aspectos de la organización espacio-temporal fundamental de las células se rigen por sistemas de reacción-difusión. In vitro de la reconstitución de estos sistemas permite estudios detallados de sus mecanismos subyacentes que no sería factibles en vivo. Presentamos un protocolo para la reconstitución en vitro del sistema MinCDE de Escherichia coli, lo que posiciona el tabique de división celular en el centro de la célula. El ensayo está diseñado para suministrar sólo los componentes necesarios para auto-organizarse, es decir, una membrana, las dos proteínas mente y minas y energía en forma de ATP. Por lo tanto fabricamos una cámara de reacción abiertos en un cubreobjetos, en el cual se forma una bicapa lipídica compatibles. El diseño abierto de la cámara permite una óptima preparación de la bicapa lipídica y manipulación controlada de los contenidos a granel. Las dos proteínas, mente y mina, así como ATP, entonces se añade en el volumen del bulto por encima de la membrana. La proyección de imagen es posible por muchos Microscopías ópticas, como los soportes de diseño confocales, amplio campo y microscopía TIRF por igual. En una variación del Protocolo, la bicapa lipídica está formada sobre un soporte de modelado, en microestructuras PDMS en forma de células, en lugar de vidrio. La solución a granel en el borde de estos compartimentos incluye la reacción en un compartimento más pequeño y proporciona límites que mímico el de en vivo el comportamiento oscilatorio. Tomados en conjunto, se describen los protocolos para reconstituir el sistema de MinCDE con y sin confinamiento espacial, permitiendo a los investigadores controlar con precisión todos los aspectos que influyen en la formación de patrones, tales como concentración y además de otros factores o proteínas y aumentar sistemáticamente la complejidad del sistema en una configuración experimental relativamente simple.

Siguiendo nuestro protocolo de purificación de proteínas debe producir proteínas Min de pureza adecuada. Como referencia, figura 1 proporciona una imagen de SDS-PAGE de la mente, fluorescencia etiquetada mente mía y MinC. Cada paso del procedimiento para realizar un análisis de la propia organización de MinDE en bicapas lipídicas con motivos no se describe en la figura 2. Mediante este protocolo, se observan MinDE regular superficie ondas viajeras a lo largo de la cámara (figura 3). La longitud de onda puede variar levemente dentro de la cámara, pero en general parecen patrones. Los bordes de la cámara no puede usarse para comparaciones cuantitativas, como las membranas que se forman en el pegamento Ultravioleta parece tener diferentes propiedades que en el cristal de la superficie (ver figura 3). Las ondas superficiales viajan pueden analizarse mediante la representación de la intensidad a lo largo de la dirección de propagación (figura 3B). Mientras que presente fluorescencia mesetas bastante rápido de la vanguardia de la ola y luego disminuye abruptamente en el borde de fuga, mina la fluorescencia aumenta casi linealmente desde el comienzo de la onda de la mente y alcanza su máximo después de la mente en el borde de fuga, donde se cae marcadamente6.
Junto a la calidad de la proteína, la calidad de las bicapas lipídicas soportadas es más crítica para una auto organización regular de MinCDE. Por un lado si la membrana se lava demasiado excesivamente o la superficie subyacente ha sido limpiada y así carga demasiado fuertemente, pueden formar agujeros en la membrana (figura 6A, parte superior). Por otro lado si la membrana no se lava correctamente o la superficie subyacente no es limpiado/hydrophilized, la vesículas se adhieren a la membrana o se verá afectada la fluidez de la membrana (figura 6A, parte inferior). Aunque no son tan evidentes al observar la membrana directamente a través de lípidos marcados, estos problemas también pueden ser detectados desde la señal de fluorescencia de la mente, como los patrones no son regulares y la fluorescencia en la maxima no es homogénea sino que contiene "huecos" o puntos brillantes como se muestra en el panel central de la figura 6A.
Para la autoorganización MinDE en microestructuras PDMS en forma el procedimiento se resume en la figura 4. Varios pasos del Protocolo no necesita ser repetido, como las proteínas y los lípidos pueden ser reutilizados. Como en los substratos no-patrón, el sustrato se limpia y hydrophilized (por limpieza de plasma), se forma una bicapa lipídica apoyado en el PDMS y el análisis de uno mismo-organización se configura en un volumen de 200 μl. Para comprobar que se ha formado una membrana apropiada y MinDE uno mismo-organiza en la membrana, son imágenes de las cámaras. Cuando una membrana apropiada se ha formado, MinDE formas regular superficie ondas viajeras en la superficie de los PDMS entre las microestructuras individuales y también uno mismo-organiza en la parte inferior de las microestructuras como las ondas pueden libremente mover en toda la superficie de membrana (figura 5A). Después del retiro de búfer, la superficie entre los compartimientos no debe presentar cualquier propagación patrones MinDE (figura 5B), debe estar completamente seco. Si sigue moviendo MinDE patrones, más buffer debe ser extirpado. Las proteínas se limitan ahora en el microcompartments barra-formado por el PDMS revestido de membrana y por el aire en la interfaz superior (figura 5), en el que se auto-organizarse. Bajo estas condiciones las dos proteínas pueden realizar oscilaciones de poste a poste como se muestra en la figura 5. Como una fracción de la mente y la mía siempre unida a la membrana, también durante la extracción del buffer, las concentraciones después de retiro del tampón no son comparables con las concentraciones de entrada. Debido a este efecto las concentraciones también varían entre microestructuras individuales sobre el mismo cubreobjetos como dependen de la posición de los patrones antes de la eliminación de búfer. Producción de la oblea de silicio o moldeado de PDMS de la oblea de silicio resulta en microestructuras incompletas que no pueden utilizarse para el análisis (Figura 6B). Además, debido al búfer de microestructuras de retiro podrían secarse durante el proceso y por lo tanto, deben excluirse del análisis (Figura 6B). Como resultado sólo una fracción de las microestructuras en una cámara de muestra las oscilaciones deseadas de polo a Polo. Para analizar la dinámica de la proteína en las microestructuras, puede obtenerse una kymograph dibujar una selección sobre toda la estructura (figura 5E). Cuando MinCDE oscilan de polo a Polo, MinC y mente mostrará un gradiente de concentración promedio de tiempo de concentración máxima en los polos del compartimiento y la concentración mínima en el compartimiento (figura 5F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig1.jpg"> Figura 1: muestra los productos finales de purificaciones de proteínas SDS-PAGE. Su mente (33,3 kDa), su-eGFP-mente (60,1 kDa), su-mRuby3-mente (59,9 kDa), su mina (13,9 kDa) y su-MinC (28,3 kDa) se muestran en orden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig2.jpg"> Figura 2: Diagrama de flujo del proceso mostrando cada paso y momento de protocolo para un auto-organizarse en bicapas lipídicas con motivos no soportadas (pasos 1-6). Cajas punteadas indican que una de estas dos opciones puede utilizar para la limpieza. Las flechas marcadas por círculos indican donde el protocolo puede ser pausado y reanudado más tarde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig3.jpg"> Figura 3: proyección de imagen de MinDE análisis mediante microscopía confocal. A) espiral Min Regular, de que velocidad de la propagación de la onda, trama de la intensidad y la velocidad pueden obtenerse mediciones. Concentraciones utilizadas: 0,6 μm mente (eGFP-mente del 30%), 1,8 μm su mina (30% su-mina-Alexa647) B) parcela de intensidad normalizada de ejemplo para la región marcada en A. C) Resumen de la cámara de ensayo completo (barra de escala: 1 m m, la misma concentración de proteína como arriba). Espirales o sentido de giro, así como se pueden observar patrones de blanco. La región ampliada muestra cómo los patrones de onda difieren sobre el pegamento Ultravioleta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig4.jpg"> Figura 4: Diagrama de flujo del proceso mostrando cada paso y momento del protocolo para la uno mismo-organización en microestructuras en forma de bastoncillos (pasos 1-5, 7, 8). Cajas gris indican pasos donde los productos pueden ser reutilizados del protocolo en bicapas lipídicas no modelado. Las flechas marcadas por círculos indican donde el protocolo puede ser pausado y reanudado más tarde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig5.jpg"> Figura 5: resultados representativos para MinDE formación en microcompartments PDMS barra-formado del patrón. A) MinDE auto-organizarse en la superficie de PDMS formando la superficie ondas viajeras (mente de 1 μm (30% EGFP-mente), 2 μm mina y mM 2,5 ATP). B) después de que el búfer se baja a la altura de las microestructuras, la autoorganización de la proteína se detiene en la superficie plana entre el microcompartments. C) esquemático de un microcompartment en forma de barra. D) imágenes representativas de MinDE oscilaciones de polo a Polo después del retiro de búfer. E) Kymograph de las oscilaciones a lo largo de la línea resaltada se muestra en D). F) imagen y Perfil de la intensidad de fluorescencia media de la serie de tiempo se muestra en D) que claramente muestra el gradiente de la proteína que es máxima en microcompartment polos y mínima en el medio del compartimiento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig6.jpg"> Figura 6: ejemplos de resultados experimentales negativos. A) membranas demasiado lavadas acumulan los agujeros, mientras que preparaciones vesícula subóptima y composiciones de lípidos llevan a pegarse las vesículas. Los paneles del dos centro muestran una combinación de problemas y cómo llegan a ser visibles al observar oscilaciones de Min. Las membranas fueron etiquetadas con 0.05% Atto655-droga. (barras de escala: 50 μm) B) panel superior: secado microcompartments puede ser causado por demasiada extracción tampón o cuando el buffer se evapora con el tiempo. Panel inferior: compartimientos incompletos pueden ser formados durante la producción de la oblea o moldeado de PDMS. (barras de escala: 30 μm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Archivo adicional 1: Mapa de plásmido para su mente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/01_pET28a-MinD-MinE.gb%20" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo adicional 2: Mapa de plásmido para su-EGFP-mente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/02_pET28a-EGFP-MinD.gb" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 3: Mapa de plásmido para la su-mRuby3-mente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/03_pET28a-mRuby3-MinD.gb" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo adicional 4: Mapa de plásmido para su mina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/04_pET28a-MinE.gb" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 5: Mapa de plásmido para su MinC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/05_pET28a-MinC.gb" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 6: Archivo CAD de la oblea de silicio de microcompartments barra-formado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/JoVe_wafer_rod-like-structures_3x3.dwg" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Proporcionamos un protocolo para in vitro ensayos de autoorganización de la mente y la mía en una bicapa lipídica apoyado en una cámara abierta. Además, se describe cómo adjuntar el ensayo en lípido-clad PDMS microcompartments imitar en vivo condiciones de confinamiento de la reacción.

In Vitro Reconstitución de la uno mismo-organización de patrones de proteínas en bicapas lipídicas soportadas

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

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