Name: use of hematopoietic stem cell transplantation to assess the origin of myelodysplastic syndrome
Uploaded: 2018-10-03T14:30:00
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इस कार्य के लिए राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (अनुदान संख्या जिया अनुसूचित जाति ०१०३७८ और बीसी ०१०९८३) के अंदर अनुसंधान कार्यक्रम का समर्थन किया गया.

पशु इस लेख में वर्णित प्रक्रियाओं बेथेस्डा पशु देखभाल और उपयोग समिति में राष्ट्रीय कैंसर संस्थान द्वारा अनुमोदित किया गया है, और मानवीय देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग पर सार्वजनिक स्वास्थ्य से?...

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	<li>Corey, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelodysplastic+syndromes:+the+complexity+of+stem-cell+diseases.">Myelodysplastic syndromes: the complexity of stem-cell diseases.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (2), 118-129 (2007).</li><li>Garcia-Manero, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelodysplastic+syndromes:+2015+Update+on+diagnosis,+risk-stratification+and+management.">Myelodysplastic syndromes: 2015 Update on diagnosis, risk-stratification and management.</a> American Journal of Hematology. 90 (9), 831-841 (2015).</li><li>Heaney, M. L., Golde, D. 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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOD/SCID+mice+transplanted+with+marrow+from+patients+with+myelodysplastic+syndrome+(MDS)+show+long-term+propagation+of+normal+but+not+clonal+human+precursors.">NOD/SCID mice transplanted with marrow from patients with myelodysplastic syndrome (MDS) show long-term propagation of normal but not clonal human precursors.</a> Leukemia Research. 27 (5), 425-436 (2003).</li><li>Medyouf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelodysplastic+cells+in+patients+reprogram+mesenchymal+stromal+cells+to+establish+a+transplantable+stem+cell+niche+disease+unit.">Myelodysplastic cells in patients reprogram mesenchymal stromal cells to establish a transplantable stem cell niche disease unit.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 824-837 (2014).</li><li>Chung, Y. J., Choi, C. W., Slape, C., Fry, T., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+a+myelodysplastic+syndrome+by+a+long-term+repopulating+hematopoietic+cell.">Transplantation of a myelodysplastic syndrome by a long-term repopulating hematopoietic cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14088-14093 (2008).</li><li>Pietras, E. 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हालांकि mds एक क्लोन टेम स्टेम कोशिका विकार हैं, mds "स्टेम", या कोशिकाओं की शुरुआत, अभी तक विशेषता नहीं किया गया है । हम पहले दिखा दिया है कि MDS WT चूहों NHD13 चूहों से HSCT द्वारा अस्थि मज्जा का उपयोग करने के लिए प्रत्?...

Myelodysplastic सिंड्रोम (MDS) अप्रभावी hematopoiesis, dysplasia के सुघड़ सबूत, और तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल)1,2 के लिए परिवर्तन के लिए एक प्रवृत्ति के द्वारा विशेषता क्लोनल रक्त विकारों के एक विविध सेट का प्रतिनिधित्व ,3,4. अप्रभावी hematopoiesis अस्थि मज्जा में एक परिपक्वता गिरफ्तारी के रूप में मांयता प्राप्त है, और परिधीय रक्त cytopenias में एक hypercellular अस्थि मज्जा1,3के बावजूद परिणाम । mds की घटना को विभिंन १००,००० प्रति वर्ष संयुक्त राज्य अमेरिका में व्यक्तियों के रूप में 2-12 मामलों के रूप में अनुमानित किया गया है, और mds की घटनाओं उंर के साथ बढ़ जाती है, यह एक महत्वपूर्ण शर्त बनाने के लिए उंर बढ़ने अमेरिका की आबादी3दिया समझ बना, 5. हालांकि mds के अधिकांश मामलों में कोई स्पष्ट एटियलजि है, mds के कुछ मामलों में ज्ञात genotoxic एजेंटों के लिए जोखिम के कारण होने लगा रहे हैं, जैसे बेंजीन, और कैंसर कीमोथेरेपी6के रूप में सॉल्वैंट्स सहित ।
mds रोगियों आमतौर पर mds कोशिकाओं7में उत्परिवर्तनों का अधिग्रहण किया है । हालांकि अपेक्षाकृत असामांय, MDS रोगियों की संख्या संतुलित गुणसूत्र जैसे NUP98, EVI1, RUNX1, और MLL (http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman) के रूप में जीन शामिल अनुवादन प्राप्त कर लिया है । हमारी प्रयोगशाला गुणसूत्र अनुवादन, जो NUP98 जीन8शामिल में एक लंबे समय से रुचि है । ट्रांसजेनिक चूहों कि एक NUP98-HOXD13 (NHD13) transgene प्रवर्तक और बढ़ाने के तत्वों द्वारा विनियमित Vav1 एक्सप्रेस MDS की प्रमुख विशेषताओं के सभी प्रदर्शित परिधीय रक्त cytopenias, सुघड़ के dysplasia सबूत, और परिवर्तन एएमएल 9 के लिए शामिल .
हालांकि mds ६० से अधिक वर्षों के लिए मांयता प्राप्त किया गया है10, और एक क्लोनिंग स्टेम सेल विकार माना जाता है, immunodeficient चूहों में मानव mds सेल engraft करने के प्रयास काफी हद तक असफल रहे हैं, क्योंकि mds कोशिकाओं engraft खराब11, 12,13,14 और चूहों में नैदानिक रोग का विकास नहीं होता है । एक जो टेम कोशिकाओं MDS संचारित कर सकते है की पहचान करने के प्रयास में, हम NHD13 मॉडल में बदल गया, और पता चला है कि हम एक रोग इकाई है कि मानव mds के कार्डिनल सुविधाओं के सभी दिखाया परिधीय रक्त cytopenias, dysplasia सहित, के रूप में engraft mds सकता है और परिवर्तन एएमएल15। इस रिपोर्ट में, हम इन प्रयोगों की तकनीकी जानकारी के साथ ही आगे fractionate टेम स्टेम और अग्रदूत कोशिकाओं (HSPC) के दृष्टिकोण, MDS-प्रारंभिक कोशिकाओं की पहचान करने के प्रयास में प्रस्तुत करते हैं ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>14 mL round bottom tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-527F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD45.2 antibody</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>1800-15</td>
			<td>LOT# A077-T044O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Syringe</td>
			<td>Monoject</td>
			<td>8881513934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27-G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lineage Cocktail</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-858</td>
			<td>LOT# 5170418221</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin antibodies</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-113-288</td>
			<td>LOT# 5171109046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>Excelint</td>
			<td>26027</td>
			<td>Insulin Syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Lamp</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E70001901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS machine</td>
			<td>Cytec</td>
			<td>FACScan</td>
			<td>2 lasers, 5 color detectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS sorting instrument</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>MOFLO ASTRIOS</td>
			<td>5 lasers, 23 parameters, 6 population sorting simulteneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P3566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma Irradiator</td>
			<td>Best Theratronics</td>
			<td>Gammacell 40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tube</td>
			<td>RAM scientific</td>
			<td>76011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recipient mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>B6-LY5.1/Cr, CD45.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NUP98-HOXD13 mice</td>
			<td>n/a</td>
			<td>C57Bl/6, CD45.2</td>
			<td>Colony maintained at NIH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL round bottom tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of hematopoietic stem cell transplantation to assess the origin of myelodysplastic syndrome

Myelodysplastic सिंड्रोम (MDS) टेम कोशिका विकारों कि अप्रभावी hematopoiesis, परिधीय रक्त cytopenias, dysplasia द्वारा परिभाषित कर रहे हैं, और तीव्र ल्यूकेमिया के लिए परिवर्तन के लिए एक प्रवृत्ति के एक विविध समूह हैं । NUP98-HOXD13 (NHD13) ट्रांसजेनिक चूहों परिधीय रक्त दोहराऊंगा, cytopenias, और तीव्र ल्यूकेमिया के लिए परिवर्तन के मामले में मानव MDS dysplasia । हम पहले से प्रदर्शन किया है कि mds mds अस्थि मज्जा nucleated कोशिकाओं (BMNC) के प्रत्यारोपण से जंगली प्रकार के प्राप्तकर्ताओं के लिए एमडीए के साथ एक आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस से स्थानांतरित हो सकता है । अधिक स्पष्ट रूप से मूल के MDS सेल समझने के लिए, हम विशिष्ट प्रत्यारोपण के दृष्टिकोण विकसित किया है, immunophenotypically टेम उपसमुच्चय परिभाषित. इस अनुच्छेद में, हम अलग और टेम स्टेम और जनक कोशिकाओं की विशिष्ट आबादी प्रत्यारोपण की प्रक्रिया का वर्णन । प्रत्यारोपण के बाद, हम प्रत्यारोपण और दाता MDS कोशिकाओं के हठ की दक्षता का आकलन करने के दृष्टिकोण का वर्णन ।

हम कई प्रयोगों के परिणामों के लिए प्रतिनिधि आंकड़े दिखाते हैं । चित्रा 1 एक प्रतिनिधि प्रवाह cytometry छँटाई प्रयोग से पता चलता है. सामांय टेम भेदभाव के दौरान, के रूप में कोशिकाओं को एक...

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Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

Myelodysplastic सिंड्रोम की उत्पत्ति का आकलन करने के लिए टेम स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण का उपयोग

हम आनुवंशिक रूप से इंजीनियर टेम कोशिकाओं की घातक क्षमता का आकलन करने के लिए टेम स्टेम सेल ट्रांसप्लांटेशन (HSCT) के उपयोग का वर्णन । HSCT vivo में विभिंन घातक टेम कोशिकाओं के मूल्यांकन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से myelodysplastic सिंड्रोम के साथ चूहों का एक बड़ा पलटन पैदा करने के लिए उपयोगी है (MDS) या के लिए उपंयास चिकित्सा का मूल्यांकन ल्यूकेमिया ।

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...

यह विधि एक कोशिका के लक्षण वर्णन के बारे में द्रोह क्षेत्र की विधि में कुछ सवालों के जवाब देने में मदद कर सकती है जो द्रोह शुरू करता है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह इन कैंसर स्टेम सेल के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए एक नींव प्रदान करता है। इस तकनीक के निहितार्थ जहां myelodysplastic सिंड्रोम या एमडीएस की चिकित्सा के लिए विस्तार, क्योंकि यह कोशिकाओं की शुरुआत रोग की पहचान में सहायता कर सकते हैं ।दत्तक हस्तांतरण के लिए प्राप्तकर्ताओं को तैयार करने के लिए, प्रत्यारोपण से एक सप्ताह पहले एक विशिष्ट, रोगजनक मुक्त पशु सुविधा में सात दिनों के लिए genic प्राप्तकर्ता जानवरों को कांग्रेस के लिए सिप्रोफ्लोक्सेसिन के प्रति लीटर १०० मिलीग्राम के साथ पूरक बाँझ पानी प्रदान करते हैं । सातवें दिन, एक प्रशिक्षित, प्रमाणित सीज़ियम 17 ऑपरेटर ने प्रति मिनट कुल शरीर गामा विकिरण के 70 सेंटीग्रे को वितरित करने के लिए सीज़ियम स्रोत उपकरण सेट किया है। एक कस्टम डिजाइन धारक में 10 चूहों रखें।धारक को विकिरण कक्ष में डालें, 13 मिनट में 9 ग्रे कुल शरीर विकिरण वितरित करें। फिर जानवरों को उनके पिंजरों में वापस कर दें। अगली सुबह, एक पूरे दो से छह पतंग पुराने C57 काले छह माउस पर 70 प्रतिशत इथेनॉल स्प्रे और टखने के लिए श्रोणि से त्वचा को दूर करने के लिए कैंची का उपयोग करें।फेमोरा और टिबिया को हटाने के लिए कैंची से संदंश का प्रयोग करें। हड्डियों से मांसपेशियों को सफाई से ट्रिम करें। टिबिया के लिए समीपस्थ और डिस्टल सिरों को काटें और संदंश के साथ एक टिबिया उठाएं।बोन मैरो गुहा में 27 पण सुई से लैस तीन मिलीलीटर सिरिंज डालें और बोन मैरो को 14 मिलीलीटर राउंड बॉटम ट्यूब में फ्लश करें जिसमें 2.5 मिलीलीटर हैंक्स बफर खारा समाधान 2% भ्रूण गोजातीय सीरम या एचएफ 2 के साथ पूरक होता है। जब सभी मज्जा एकत्र किया गया है, 20 पण सुई टिप के माध्यम से कई बार ऊतक aspirate को गिनती के लिए एक ही निलंबन में मज्जा द्रव्यमान तितर-बितर । प्रवाह छंटाई के लिए बोन मैरो न्यूक्लियेटेड कोशिकाओं, या बीएमएनसी को लेबल करने के लिए, अपकेंद्रित्रीकरण द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें और एचएफ2 एकाग्रता के 90 माइक्रोलीटर प्रति सातवें बीएमएनसी को एक बार दस बार में गोली को फिर से निलंबित करें।इसके बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन 20 मिनट के लिए सेल निलंबन के लिए एक बायोटिनाइलेटेड, एंटी-लाइनेज एंटीबॉडी कॉकटेल के दस माइक्रोलीटर जोड़ें। पीबीएस के तीन मिलीलीटर में एक अपकेंद्रित्र धोने के बाद । एचएफ2 के 100 माइक्रोलीटर प्रति एक बार दस गुना सातवीं कोशिकाओं में गोली को फिर से निलंबित करें।सेकेंडरी रूप से कोशिकाओं को एपीसी कंफ्यूज्ड एंटी बायोटिन एंटीबॉडी के दो माइक्रोलीटर के साथ लेबल करें। चार डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के बाद, प्रकाश से संरक्षित, ताजा PBS के तीन मिलीलीटर में कोशिकाओं को धोते हैं । बर्फ पर प्रोपिडियम आयोडाइड के 0.2 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर के साथ 0.2 माइक्रोग्राम पूरक एचएफ 2 में गोली को फिर से निलंबित करें।अब प्रत्येक डिटेक्टर की रैखिक सीमा के भीतर फोटोमुलिटेपियर ट्यूब, स्कैटर और फ्लोरेसेंस पैरामीटर के सभी अनुकूलन के लिए अन दागदार कोशिकाओं का उपयोग करके प्रवाह साइटोमेट्री सेल सॉर्टर को कैलिब्रेट करें। अवेलेबल, पीआई लेबलेड और एंटी वंश एपीसी लेबल कोशिकाओं के लिए 10, 000 कोशिकाओं के तीन नमूने प्राप्त करें। तरह के अंत में, क्रमबद्ध कोशिकाओं की शुद्धता और व्यवहार्यता की पुष्टि करने के लिए प्रत्येक नमूने से 1, 000 कोशिकाओं का विश्लेषण करें।अपकेंद्रित्र में नमूनों को नीचे स्पिन करें। फिर मतगणना के लिए एचएफ2 के 0.5 मिलीलीटर में छर्रों को फिर से निलंबित करें। सॉर्ट कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण के लिए, बाँझ HF2 में एक कॉन जेनिक प्राप्तकर्ता जानवर से पांचवें जंगली प्रकार बीएमएनसी के लिए दो बार के १०० माइक्रोलीटर मिश्रण ।दो से पांच गुना दस के १०० माइक्रोलीटर के साथ चौथे को एक माइक्रो अपकेंद्रित्र ट्यूब प्रति प्राप्तकर्ता पशु में बाँझ HF2 में ब्याज की छंटाई दाता BMNC । एक मिलीलीटर सिरिंज लोड करें, जो कोशिकाओं के 200 माइक्रोलीटर के साथ प्रति प्राप्तकर्ता 28 पण से लैस है। फिर, प्राप्तकर्ता चूहों को पूंछ नस फैलाव को प्रेरित करने के लिए एक गर्मी दीपक के नीचे रखें।पूंछ नस के माध्यम से प्रत्येक घातक विकिरणित प्राप्तकर्ता जानवर को सेल मिश्रण वितरित करें। के रूप में स्टेम सेल आत्म नवीकरण वंश नकारात्मक जंगली प्रकार BMNC, वंश नकारात्मक, कम वंश सकारात्मक, और उच्च वंश सकारात्मक कोशिकाओं को हल कर रहे है और जंगली प्रकार प्राप्तकर्ताओं में प्रत्यारोपित करने के लिए प्रत्येक सेल आबादी की आत्म नवीकरण क्षमता निर्धारित करने के लिए सीमित है । दत्तक द्वारा प्रत्यारोपित दाता ट्रांस आनुवंशिक बीएमएनसी एमडीएस मॉडल जानवरों से उनके CD45.2 सेल सतह मार्कर अभिव्यक्ति द्वारा पूर्व वीवो प्रतिष्ठित किया जा सकता है ।वंश नकारात्मक BNMC, या ट्रांसजेनिक एमडीएस दाता जानवरों से अनसोर्ट बीएमएनसी के प्रत्यारोपण के बाद 16 सप्ताह तक, ट्रांसजेनिक कोशिकाओं बाहर जंगली प्रकार की कोशिकाओं के रूप में CD45.2 सकारात्मक दाता कोशिकाओं की बढ़ती प्रतिशत का सबूत है, घातक irradiated प्राप्तकर्ता जानवरों के परिधीय रक्त में मनाया प्रतिस्पर्धा । यहां ट्रांसजेनिक एमडीएस कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित माउस से ल्यूकेमिक ट्रांसफॉर्मेशन से कोशिकाओं को दिखाया जाता है। कई विस्फोटों और अपरिपक्व रूपों की उपस्थिति पर ध्यान दें।प्रक्रिया का प्रयास करते समय, पूर्व वीवो हेरफेर के समय को सीमित करना याद रखना महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह कोशिकाओं पर अनुचित तनाव रख सकता है, जिसके परिणामस्वरूप सेल मृत्यु या कार्यात्मक हानि होती है। इसके विकास के बाद इस तकनीक क्षेत्र कार्यक्रम में शोधकर्ताओं के लिए मार्ग प्रशस्त, द्रोह में डालने के लिए आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों में रोग के स्रोत का पता लगाने के लिए ।

Research

JoVE Journal

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Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

लाइव इमेजिंग द्वारा माउस और उनके विज़ुअलाइज़ेशन में मानवहित अस्थि मरो माइक्रोएवावरमेंट्स बायोइंजिनिअरिंग

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Detection of Residual Donor Erythroid Progenitor Cells after Hematopoietic Stem Cell Transplantation for Patients with Hemoglobinopathies

Hemoglobinopathies के साथ रोगियों के लिए टेम स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण के बाद अवशिष्ट दाता Erythroid जनक कोशिकाओं का पता लगाने

The presence of incomplete chimerism is noted in a large proportion of patients following bone marrow transplant for thalassemia major or sickle cell ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

भ्रूण टेम के क्लोनल विश्लेषण स्टेम सेल Endothelial सेल आला सह संस्कृति के साथ संयुक्त छंटाई एकल कोशिका सूचकांक का उपयोग कर पुरोगामी

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

पराबैंगनी-सी (यूवी-सी) क्षति के जवाब में प्राथमिक माउस नेत्र सतह कोशिकाओं/स्टेम सेल में ऑक्सीडेटिव क्षति का आकलन

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...