Name: assessment of the synaptic interface of primary human t cells from peripheral blood and lymphoid tissue
Uploaded: 2018-07-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue at JoVE.com

Detta arbete stöddes av R01AI118694 NIH bidraget till Michael R. Betts, vilket inkluderar sub award 566950 till Yuri Sykulev. Vi tackar Sidney Kimmel Cancer Center Bioimaging delade resursen för deras utmärkta stöd.

Denna studie genomfördes i enlighet med Helsingforsdeklarationen. Skriftligt informerat samtycke erhållits från alla deltagare, och prover av blod och lymfkörtel förvärvades med godkännande av den institutionella Review Board vid University of Pennsylvania (IRB #809316, IRB # 815056). Alla försökspersoner var vuxna. Sladden blodprov var vänligen tillhandahållen av arbetskraft och leverans av avdelningen för obstetrik & gynekologi vid Thomas Jefferson University. Alla prover var avidentifierade.
<p class="...

<ol>
	<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285, 221-227 (1999).</li><li>Somersalo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T+lymphocytes+form+an+antigen-independent+ring+junction.">Cytotoxic T lymphocytes form an antigen-independent ring junction.</a> Journal of Clinical Investigation. 113, 49-57 (2004).</li><li>Beal, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+theta+regulates+stability+of+the+peripheral+adhesion+ring+junction+and+contributes+to+the+sensitivity+of+target+cell+lysis+by+CTL.">Protein kinase C theta regulates stability of the peripheral adhesion ring junction and contributes to the sensitivity of target cell lysis by CTL.</a> The Journal of Immunology. 181, 4815-4824 (2008).</li><li>Beal, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+early+T+cell+receptor+signaling+regulate+the+pathway+of+lytic+granule+delivery+to+the+secretory+domain.">Kinetics of early T cell receptor signaling regulate the pathway of lytic granule delivery to the secretory domain.</a> Immunity. 31, 632-642 (2009).</li><li>Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+planar+bilayers+for+study+of+the+immunological+synapse.">Supported planar bilayers for study of the immunological synapse.</a> Current Protocols in Immunology. , (2007).</li><li>Reuter, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-Specific+CD8(+)+T+Cells+Exhibit+Reduced+and+Differentially+Regulated+Cytolytic+Activity+in+Lymphoid+Tissue.">HIV-Specific CD8(+) T Cells Exhibit Reduced and Differentially Regulated Cytolytic Activity in Lymphoid Tissue.</a> Cell Reports. 21, 3458-3470 (2017).</li><li>Buggert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+immune+surveillance+in+lymphoid+tissue+by+cytolytic+CD4++T+cells+during+health+and+HIV+disease.">Limited immune surveillance in lymphoid tissue by cytolytic CD4+ T cells during health and HIV disease.</a> PLoS Pathogens. 14, e1006973 (2018).</li><li>Carrasco, Y. R., Fleire, S. J., Cameron, T., Dustin, M. L., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LFA-1/ICAM-1+interaction+lowers+the+threshold+of+B+cell+activation+by+facilitating+B+cell+adhesion+and+synapse+formation.">LFA-1/ICAM-1 interaction lowers the threshold of B cell activation by facilitating B cell adhesion and synapse formation.</a> Immunity. 20, 589-599 (2004).</li><li>Anikeeva, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+role+of+lymphocyte+function-associated+antigen-1+in+mediating+effective+cytolytic+activity+by+cytotoxic+T+lymphocytes.">Distinct role of lymphocyte function-associated antigen-1 in mediating effective cytolytic activity by cytotoxic T lymphocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 6437-6442 (2005).</li><li>Steblyanko, M., Anikeeva, N., Campbell, K. S., Keen, J. H., Sykulev, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+Influence+the+Size+and+Dynamics+of+Signaling+Microclusters+in+a+Pyk2-dependent+Manner.">Integrins Influence the Size and Dynamics of Signaling Microclusters in a Pyk2-dependent Manner.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290, 11833-11842 (2015).</li><li>Anikeeva, N., Lebedeva, T., Sumaroka, M., Kalams, S. A., Sykulev, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+HIV-specific+T-cell+receptor:+expression,+purification+and+analysis+of+the+specificity.">Soluble HIV-specific T-cell receptor: expression, purification and analysis of the specificity.</a> Journal of Immunological Methods. 277, 75-86 (2003).</li><li>Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells.">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395, 82-86 (1998).</li><li>Riddell, S. R., Greenberg, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+anti-CD3+and+anti-CD28+monoclonal+antibodies+to+clone+and+expand+human+antigen-specific+T+cells.">The use of anti-CD3 and anti-CD28 monoclonal antibodies to clone and expand human antigen-specific T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 128, 189-201 (1990).</li><li>Lin, S. J., Yu, J. C., Cheng, P. J., Hsiao, S. S., Kuo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+interleukin-15+on+anti-CD3/anti-CD28+induced+apoptosis+of+umbilical+cord+blood+CD4++T+cells.">Effect of interleukin-15 on anti-CD3/anti-CD28 induced apoptosis of umbilical cord blood CD4+ T cells.</a> European Journal of Haematology. 71, 425-432 (2003).</li><li>Anikeeva, N., Sykulev, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+controlling+granule-mediated+cytolytic+activity+of+cytotoxic+T+lymphocytes.">Mechanisms controlling granule-mediated cytolytic activity of cytotoxic T lymphocytes.</a> Immunologic Research. 51, 183-194 (2011).</li><li>Huppa, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR-peptide-MHC+interactions+in+situ+show+accelerated+kinetics+and+increased+affinity.">TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity.</a> Nature. 463, 963-967 (2010).</li></ol>

Den nya teknik som beskrivs här använder liknande reagenser som krävs för att bygga planar lipidmonolager i konventionella flöde cell5 och framgångsrikt kan användas för att utföra avbildning av primära human T cell – lipidens gränssnitt3,4 ,15. Tekniken erbjuder en betydande minskning i den fluorescerande molekyler användningen och kräver 10 – 20 x färre T-celler jämfört med en flöd...

Vetenskapliga kunskapen om strukturella drag hos T-cell immun synapser och deras koppling till den funktionella aktiviteten av T-celler har genererats främst från studien av cellinjer och kloner härledda från PB. Till vilken grad dessa fynd avser primära T-celler som erhållits från oklar blod eller mänskliga lymfoida vävnader, eftersom de synaptiska gränssnitt av T-celler som är bosatta i lymfoida och andra vävnader inte har analyserats hittills. Ännu viktigare, tyder framväxande data på att vävnaden boförälder och lymfoida organ-härledda T-celler kan ha betydande skillnader i deras fenotyp och funktionell aktivitet jämfört med dem i PB6,7. Detta stelnat ytterligare behovet av att bättre förstå funktionerna i T-cell synaptic gränssnittet i primära humant T-celler.
För detta ändamål har vi utvecklat en ny mini skala strategi att utnyttja lipid lipidmonolager inbyggt flerkanaligt flöde bilder gör det möjligt för oss att utföra avbildning av T-cell/lipidens gränssnitt med mindre än 105 primära T celler isolerade från mänskliga PB och LN. Denna nya teknik gör studien av primära humant T-cell synaptic gränssnitt för att bättre modell och förstå i vivo cell-cell interaktioner biofysiska egenskaper.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD4 T cell isolation kit, human</td>
			<td>Miltenyl Biotec</td>
			<td>130-096-533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8 T cells Isolation Kit, human</td>
			<td>Miltenyl Biotec</td>
			<td>130-096-495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOGS NTA</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>790528C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinyl Cap PE</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>870273C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin</td>
			<td>Octapharma USA</td>
			<td>NDC 68982-643-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sticky-Slide VI 0.4</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips for sticky-Slides</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioptech FCS2 Chamber</td>
			<td>Bioptech</td>
			<td>060319-2-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD3 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16-0037-81</td>
			<td>OKT3 clone, hybridoma cells are available from ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- CD28 antibody</td>
			<td>Genetex</td>
			<td>GTX14664</td>
			<td>9.3 clone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEO4-NHS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 protein labeling kit with column for labeled protein purification</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 protein labeling kit with column for labeled protein purification</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Cy5 NHS Ester</td>
			<td>GE Life Science</td>
			<td>PA15101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMT/V5-His A, B, C Drosophila Expression Vectors</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>V412020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcopneo, G418 Drosophila expression vector for positive selection</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>37409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum free Drosophial media Insect-XPRESS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-730Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridoma YN1/1.7.4</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL1878</td>
			<td>The hybridoma secrets antibody against ICAM-1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanogen bromide-activated-Sepharose 4B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9142</td>
			<td>Utilized for preparation of Sepharose with covelently bound anti-ICAM antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MasterFlex tangential flow concentrator</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>77601-60 7592-40</td>
			<td>Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centramate Lab Tangential Flow Systems</td>
			<td>Pall Laboratory</td>
			<td>FS002K10 OS010T12 FS005K10</td>
			<td>Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Spectra/Por</td>
			<td>131384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain from papaya latex</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human antibody against CD107a</td>
			<td>BD Bioscences</td>
			<td>555798</td>
			<td>Clone H4A3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ansell Natural Blue Gloves</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-014-539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Polypropylene Scissor-Type Forceps</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>6320-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>ProZyme</td>
			<td>SA10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Nikon TiE inverted microscope equipped with PFS for long-term image stability control, 60x oil objectives, 4 lasers with excitation lines at 405, 458, 488, 514, 561, and 640 nm, 2 GaAsP detectors and 2 high sensitivity PMTs, DIC transmitted light, Programmable X,Y,Z stage for multiple positions and stitching of large areas, time lapse functions, Tokai-Hit temperature and CO2-controlled chamber for live imaging, and anti-vibration isolation table</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIRF microscope</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>Andor Revolution XD system equipped with Nikon TIRF-E illuminator, Lasers with 405,488,561 and 640 lines, DIC transmitted light, Yokogawa CSU-X1 spinning disk head for confocal imaging, 100/1.49 NA objective, Andor iXon X3 EM-CCD camera, objective heater, and a piezoelectric motorized stage with Perfect Focus System (PFS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph Premier Image Analysis Software</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of the synaptic interface of primary human t cells from peripheral blood and lymphoid tissue

Aktuell kunskap om dynamiken och strukturella funktioner av T-cell synaptic gränssnitt har varit till stor del bestäms genom användning av glas-stödda planar lipidmonolager och in vitro--härledda T-cell kloner eller linjer1,2 ,3,4. Hur dessa fynd gäller för de primära mänskliga T cellerna isolerade från blod eller lymfoida vävnader är inte känd, delvis på grund av betydande svårigheter att få ett tillräckligt antal celler för analys5. Här kan vi bemöta detta genom utveckling av en teknik som utnyttjar flerkanaliga flöde diabilder för att bygga planar lipid lipidmonolager innehållande aktivering och vidhäftning molekyler. Den låga höjden flöde bilder främjar snabb cell sedimentering för att synkronisera cell: lipidens fastsättning, vilket innebär att forskare att studera dynamiken i synaptic gränssnitt bildandet och kinetik av granulat release. Vi tillämpar detta synsätt för att analysera synaptic gränssnittet för så få som 104 105 primära frysförvarade T celler isolerade från lymfkörtlar (LN) och perifert blod (PB). Resultaten visar att romanen planar lipid lipidens tekniken möjliggör studiet av biofysiska egenskaper av primära humant T-celler som härrör från blod och vävnader i samband med hälsa och sjukdom.

Först, Vi jämförde struktur gränssnittet synaptic bildas av aktiverade sladd-blod-härledda CD8+ T celler utsätts för lipid lipidmonolager byggd antingen i traditionella storskaliga flöde cellsystem (se Tabell av material för detaljer)1 ,2,3,4 eller i flerkanaligt flöde diabilder. Lipidmonolager innehöll lysrör-märkt anti...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue at JoVE.com

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

Bedömning av Synaptic gränssnittet för primära humant T-celler från perifert blod och lymfatisk vävnad

Protokollet beskriver en teknik för att studera primära polyklonala mänskliga T cellernas förmåga att bilda synaptic gränssnitt använder planar lipid lipidmonolager. Vi använder denna teknik för att Visa differentiell synaps bildas förmåga mänskliga primära T-celler som härrör från lymfkörtlar och perifert blod.

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Expansion, rening och Functional Assesment of Human Peripheral Blood NK-celler

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Expansion of Human Peripheral Blood  ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells using Zoledronate

Utbyggnad av Human Peripheral Blood γδ T-celler med hjälp zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

Generering av Inducerade regulatoriska T-celler från primära humana naiva och minne T-celler

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac transposon System Ändring av primära humana T-celler

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Klinisk tillämpning av<em&gt; Törnrosa</em&gt; Konstgjord och antigenpresenterande celler för att genetiskt modifiera T celler från perifert och navelsträngsblod

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Generering av Human Alloantigen-specifika T-celler från perifert blod

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Isolering av leukocyter från Human Maternal-foster Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dextran effektiviserar Lentiviral transduktion murina och mänskliga primära NK-celler

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism

Analys av människans naturliga Killer Cell Metabolism

Natural Killer (NK) cells mediate mainly innate anti-tumor and anti-viral immune responses and respond to a variety of cytokines and other stimuli to ...

Flotation-Based T Cell Isolation, Activation, and Expansion from Human Peripheral Blood Mononuclear Cell Samples Using Microbubbles

Flotationsbaserad T-cellisolering, aktivering och expansion från humant perifert blod mononukleära cellprover med hjälp av mikrobubblor

The process of isolating T cells from peripheral blood mononuclear&#160;cells (PBMCs) to establish ex vivo cultures is crucial for research, clinical ...