Name: a proximal culture method to study paracrine signaling between cells
Uploaded: 2018-08-28T14:30:00
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これらの実験の組織コレクションに参加するため患者さんにお世話になっております。国防総省 OCRP 卵巣癌アカデミー賞 (W81XWH-15-0253) および Anirban k. ミトラにコリーンの夢財団からパイロット賞は、この研究をサポートしました。

プロトコルは、インディアナ大学の制度的規制委員会のガイドラインに従います。
1. セル準備
<ol><li>
ひと中皮細胞の分離と培養
	<ol>
<li>分離ひと中皮細胞 (HPMCs)17,18を前述とのそれらを育てる人間の大網から完了成長培地 [ダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) 10% 牛胎児血清 1% を含むペニシリン-ストレプトマイ...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessories+to+the+crime:+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment.">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).</li><li>Cupedo, T., Mebius, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+interactions+in+lymph+node+development.">Cellular interactions in lymph node development.</a> The Journal of Immunology. 174 (1), 21-25 (2005).</li><li>Suvas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Substance+P+Neuropeptide+in+Inflammation,+Wound+Healing,+and+Tissue+Homeostasis.">Role of Substance P Neuropeptide in Inflammation, Wound Healing, and Tissue Homeostasis.</a> The Journal of Immunology. 199 (5), 1543-1552 (2017).</li><li>Gnecchi, M., Danieli, P., Malpasso, G., Ciuffreda, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+Mechanisms+of+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Tissue+Repair.">Paracrine Mechanisms of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Repair.</a> Methods in Molecular Biology. , 123-146 (2016).</li><li>Lionetti, V., Bianchi, G., Recchia, F. A., Ventura, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+autocrine+and+paracrine+myocardial+signals:+an+emerging+therapeutic+strategy+in+heart+failure.">Control of autocrine and paracrine myocardial signals: an emerging therapeutic strategy in heart failure.</a> Heart Failure Reviews. 15 (6), 531-542 (2010).</li><li>Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+regulation+of+angiogenesis+by+different+cell+types+in+the+aorta+ring+model.">Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model.</a> International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).</li><li>Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tackling+the+cancer+stem+cells+-+what+challenges+do+they+pose.">Tackling the cancer stem cells - what challenges do they pose.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (7), 497-512 (2014).</li><li>Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer+stem+cell+niche:+how+essential+is+the+niche+in+regulating+stemness+of+tumor+cells.">The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells.</a> Cell Stem Cell. 16 (3), 225-238 (2015).</li><li>Elenbaas, B., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotypic+signaling+between+epithelial+tumor+cells+and+fibroblasts+in+carcinoma+formation.">Heterotypic signaling between epithelial tumor cells and fibroblasts in carcinoma formation.</a> Experimental Cell Research. 264 (1), 169-184 (2001).</li><li>Wilson, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR+ligands+exhibit+functional+differences+in+models+of+paracrine+and+autocrine+signaling.">EGFR ligands exhibit functional differences in models of paracrine and autocrine signaling.</a> Growth Factors. 30 (2), 107-116 (2012).</li><li>Kopan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling.">Notch signaling.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (10), (2012).</li><li>Singh, A. B., Sugimoto, K., Harris, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Juxtacrine+activation+of+epidermal+growth+factor+(EGF)+receptor+by+membrane-anchored+heparin-binding+EGF-like+growth+factor+protects+epithelial+cells+from+anoikis+while+maintaining+an+epithelial+phenotype.">Juxtacrine activation of epidermal growth factor (EGF) receptor by membrane-anchored heparin-binding EGF-like growth factor protects epithelial cells from anoikis while maintaining an epithelial phenotype.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (45), 32890-32901 (2007).</li><li>Swartz, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microenvironment+complexity:+emerging+roles+in+cancer+therapy.">Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy.</a> Cancer Research. 72 (10), 2473-2480 (2012).</li><li>Mitra, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+reprogram+normal+fibroblasts+into+cancer-associated+fibroblasts+in+ovarian+cancer.">MicroRNAs reprogram normal fibroblasts into cancer-associated fibroblasts in ovarian cancer.</a> Cancer Discovery. 2 (12), 1100-1108 (2012).</li><li>Nieman, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocytes+promote+ovarian+cancer+metastasis+and+provide+energy+for+rapid+tumor+growth.">Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth.</a> Nature Medicine. 17 (11), 1498-1503 (2011).</li><li>Salimian Rizi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+mediates+metabolic+coupling+of+omentum-derived+adipose+stroma+to+ovarian+and+endometrial+cancer+cells.">Nitric oxide mediates metabolic coupling of omentum-derived adipose stroma to ovarian and endometrial cancer cells.</a> Cancer Research. 75 (2), 456-471 (2015).</li><li>Mitra, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment-induced+downregulation+of+miR-193b+drives+ovarian+cancer+metastasis.">Microenvironment-induced downregulation of miR-193b drives ovarian cancer metastasis.</a> Oncogene. 34 (48), 5923-5932 (2015).</li><li>Tomar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ETS1+induction+by+the+microenvironment+promotes+ovarian+cancer+metastasis+through+focal+adhesion+kinase.">ETS1 induction by the microenvironment promotes ovarian cancer metastasis through focal adhesion kinase.</a> Cancer Letters. 414, 190-204 (2018).</li><li>Ovarian Cancer Metastasis: A Unique Mechanism of Dissemination. Tumor Metastasis Available from: <a target="_blank" href="https://www.intechopen.com/books/tumor-metastasis/ovarian-cancer-metastasis-a-unique-mechanism-of-dissemination">https://www.intechopen.com/books/tumor-metastasis/ovarian-cancer-metastasis-a-unique-mechanism-of-dissemination</a> (2016)</li><li>Iwanicki, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+spheroids+use+myosin-generated+force+to+clear+the+mesothelium.">Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium.</a> Cancer Discovery. 1 (2), 144-157 (2011).</li><li>Kenny, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesothelial+cells+promote+early+ovarian+cancer+metastasis+through+fibronectin+secretion.">Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4614-4628 (2014).</li><li>Boelens, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+transfer+from+stromal+to+breast+cancer+cells+regulates+therapy+resistance+pathways.">Exosome transfer from stromal to breast cancer cells regulates therapy resistance pathways.</a> Cell. 159 (3), 499-513 (2014).</li><li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+function+of+exosomes+in+cancer.">The biology and function of exosomes in cancer.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).</li><li>Kohlhapp, F. J., Mitra, A. K., Lengyel, E., Peter, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+as+mediators+and+communicators+between+cancer+cells+and+the+tumor+microenvironment.">MicroRNAs as mediators and communicators between cancer cells and the tumor microenvironment.</a> Oncogene. 34 (48), 5857-5868 (2015).</li></ol>

パラクリンの juxtacrine 細胞間シグナル伝達機構を理解することは、正常組織の恒常性と病気の条件7,8のよりよい知識を開発するため不可欠です。ほとんどパラクリン シグナルにより収集実施エアコンから 1 つのセルの種類とその他の細胞のタイプの治療に使用中。このメソッドでは、その本来のシンプルさの利点があります。しかし、それはない?...

がん細胞と腫瘍の進行がん微小環境との間の生産的な相互作用の役割は、定着させてきた、がん生物学1の研究の主要な焦点となっています。双方向信号のような場合、重要な創傷治癒、免疫反応、血管新生、幹細胞ニッチ中および開発2,3,4,5,6,7,8. これらのすべての生物学的プロセスに共通するテーマは、細胞が様々 な細胞の運命、組織生理学、病気の進行を決定するの細胞外のキューにその微小環境からの方法で応答します。したがって、このような細胞間コミュニケーションに関与するメカニズムの理解に向けてますますなっています。このような相互作用の大部分は、パラクリンや juxtacrine 細胞間シグナル伝達を伴います。Juxtacrine に対し9,10、それの応答をトリガー、近くの別のセルの対応する受容体によって感知される 1 つのセルによって特定のシグナル伝達因子の分泌を含むパラ分泌シグナル信号 2 つのセル関係11,12細胞成分の直接の接触が必要です。
このような信号だけでなく、腫瘍微小環境における組織の恒常性の重要なコンポーネントです。がん細胞の恩恵癌関連付けられている線維芽細胞 (CAFs)、免疫細胞、脂肪細胞13,14,,1516など、腫瘍・間質の細胞からパラクリン juxtacrine 要因。パラクリン シグナル並置配位子と Notch シグナル、またはインテグリンと、それぞれの相互作用と同様に受容体を含む juxtacrine シグナリング、成長因子、サイトカイン、ケモカインなどによって媒介されることができます。細胞外マトリックス蛋白質。我々 は、腫瘍の進展と転移14で卵巣癌のセルと CAFs との相互作用の重要性を実証しました。キーのマイクロ Rna と癌細胞転移増殖17,を促進する転写因子同様に、転移性卵巣癌細胞転移を覆う中皮細胞の相互作用を調節します。18。
パラクリン シグナル伝達に関するほとんどの研究と 2 番目のセルのタイプの治療に 1 つのセル型から収集した馴化培地の使用を含みます。このアプローチは広く使用されて、それは効果的に受容細胞の微小環境における分泌因子のローカライズされた高濃度を複製してないです。また、1 つのセルによって生成されて分泌因子の連続的な流れの動態を再現するは失敗し、隣接セルによって受信されました。パラクリン シグナル分泌因子、ソース セルの近くでのみ必要な濃度で拡散し、を希釈する距離が長くなる傾向があると短い距離で効果的です。このローカライズされた高濃度分泌因子の受容細胞の応答をトリガーに不可欠です。また、受信者の細胞応答も新しく分泌因子と劣化、バインド、および受信者のセル、ソース セルから拡散の国際化を通じて継続的な枯渇のバランスに依存しているです。馴化培地は、微小環境に存在高いローカライズされた濃度のアカウントに集中することができますが、ことは、正確な濃度を正確に複製することはできません。さらに、生産の自然動態と関与する因子の枯渇を模倣することはできません。正確にパラ分泌シグナルをレプリケートし、juxtacrine シグナリング メカニズムから分離、我々 は多孔質膜のいずれかのサーフェスの 2 つのセルのタイプを育てることを含む近位培養法を考案しました。毛穴が小さく、juxtacrine やり取りを防ぐためし、まだローカライズされた高濃度に分泌因子の交換を許可します。その方法では、このシステムは、生産の動力学とパラクライン因子の枯渇を保持します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 mm Transwell permeable support with 0.4 &#181;m Pore Polycarbonate Membrane Insert</td>
			<td>Corning (Costar)</td>
			<td>3412</td>
			<td>&#8226; 10 &#181;m thick translucent polycarbonate membrane 
			&#8226; Treated for optimal cell attachment 
			&#8226; Packaged 6 inserts in a 6 well plate, 4 plates per case 
			&#8226; Membrane must be stained for cell visibility 
			&#8226; Sterilized by gamma radiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning (Falcon)</td>
			<td>353046</td>
			<td>Flat Bottom, TC-treated, sterile, with Lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm culture dish</td>
			<td>Corning (Falcon)</td>
			<td>353025</td>
			<td>Sterile, TC-treated Cell Culture Dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning (Cellgro)</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Nonessential amino acids</td>
			<td>Corning (Cellgro)</td>
			<td>25-025-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Vitamins</td>
			<td>Corning (Cellgro)</td>
			<td>25-020-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any make is fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any make is fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety level II cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any make is fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FN1 TaqMan Gene Expression Assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Hs01549976_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGFB1 TaqMan Gene Expression Assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Hs00998133_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDH1 TaqMan Gene Expression Assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Hs01023895_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH TaqMan Gene Expression Assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Hs99999905_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy mini RNA isolation Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>43-688-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeyA8 ovarian cancer cells</td>
			<td>Obtained from Ernst Lengyel Lab, University of Chicago</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF&#946; Neutralizing Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1835-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a proximal culture method to study paracrine signaling between cells

細胞間相互作用は、腫瘍の進行、免疫反応、血管新生、開発など多くの生物学的プロセスに重要な役割を果たします。パラクリンや juxtacrine シグナリングは、このような相互作用を仲介します。馴化培地と培養研究の使用は相互作用のこれらの 2 つのタイプを区別する最も一般的な方法です。ただし、パラクリン作用中に、微小環境における分泌因子のローカライズされた高濃度の効果は馴化培地によって正確にそうはいないと、したがって、不正確な結論につながる可能性があります。この問題を克服するために我々 は、パラクリン シグナルを研究する近位部の培養法を考案しました。2 つのセル型は、0.4 μ m 孔を持つ 10 μ m 厚ポリカーボネート膜のいずれかのサーフェスに栽培しています。毛穴は分泌因子の交換を許可して、同時に juxtacrine シグナリングを禁じる。細胞を収集、パラクリン シグナル伝達の効果を決定するエンドポイントで分離できます。分泌因子の局在の濃度勾配をできるだけでなく、この方法は長時間文化だけでなく、阻害剤の使用を含む実験を受けやすい。このメソッドを使用して、卵巣癌細胞と中皮細胞の転移のサイトで出会う彼ら間の相互作用を研究する、パラクリン シグナル、様々 な分野の研究に研究の 2 つ付着性のセル型に合わせることができます。開発、免疫学、腫瘍微小環境を含みます。

転移性卵巣癌細胞19腹腔内転移の部位に中皮細胞が発生します。成功した転移17,18,20,21 を有効にすると卵巣癌のセルの適応応答の誘導に中皮細胞の助けを借りて生産パラクリンと juxtacrine 相互作用.近位培養法の有効性をテストするため HeyA8 卵巣癌細胞と...

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A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells

傍分泌と juxtacrine 細胞間相互作用は、腫瘍の進行、免疫反応、血管新生、開発など多くの生物学的プロセスに重要な役割を果たします。ここでは、近位文化メソッドを細胞の直接接触を防止しながら分泌因子のローカライズされた濃度を維持する、パラクリン シグナル伝達研究に使用します。

パラ分泌細胞間シグナル研究に近位の培養法

Intercellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and ...

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