Name: quantification of efferocytosis by single-cell fluorescence microscopy
Uploaded: 2018-08-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy at JoVE.com

تم تمويل هذه الدراسة بالمعاهد الكندية للصحة البحوث (استوفوا) العاملة بمنحه اجتماع الأطراف-123419، والعلوم الطبيعية والهندسة بحوث المجلس من كندا اكتشاف منحة 418194، ووزارة أونتاريو للبحوث والابتكار جائزة البحوث المبكرة للبوسنة والهرسك. الورشة ساهمت بعض الصور المعروضة، لتعظيم الاستفادة البروتوكولات وكتابة المخطوطة؛ أنه بتمويل من منحة مضخة فتيلة من جامعة ليفربول. وتمول قبرصي فانييه الدراسات العليا المنح الدراسية، واستوفوا MD/الدكتوراه سنهم. وكان وكالات التمويل أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات والتحليل، وقرار نشر أو إعداد المخطوطة.

واعتمد المجلس أخلاقيات بحوث العلوم الصحية من جامعة أونتاريو الغربية جمع الدم من المتطوعين صحية. وأجرى فينيبونكتوري وفقا للمبادئ التوجيهية "بيان السياسة العامة" ثلاثي-مجلس البحوث البشرية.
1-الثقافة وإعداد خط الخلية الوحيدات THP-1
<ol><li>الثقافة وحيدات THP-1 كثقافة وقف في قوارير T2...

الأساليب المذكورة في هذا البروتوكول يمكن تصوير والتحديد الكمي لعملية افيروسيتيك الحيوية، واستخدام نهج ثابت-خلية وخلية يعيش. هذه النهج توفر العديد من المزايا على مدى تدفق العاملين عادة الأساليب المستندة إلى الخلوي23،24. ويوفر استخدام التلوين من الداخل إلى ا...

المبرمج، أو موت الخلية المبرمج، هو الغاية-وينظم عملية فسيولوجية التي تحدث في معظم الكائنات الحية متعددة الخلايا، وهو أمر حاسم ل التنمية والتوازن على1. بالإضافة إلى اشتراكها في دوران الخلية الطبيعية والتنمية الجنينية، المبرمج يمكن القضاء على الخلايا المصابة أو التالف من الأنسجة ويمكن أن تسبب استجابة للعدوى، والتهاب، والسرطان، وأيضا بالتدخلات الطبية مثل العلاج بالأشعة أو المنشطات1. الكشف عن الخلايا أبوبتوتيك "أكل-لي" إشارات على سطحها الخلية التي تعترف بها مستقبلات على طائفة من البالعات المهنية وغير المهنية، يشار إليها باسم "افيروسيتيس". مشاركة هذه المستقبلات الحث على الإقبال وتدهور الخلية أبوبتوتيك التي افيروسيتي من خلال عملية تعرف باسم افيروسيتوسيس،من23. فوسفاتيديلسيريني هو الأفضل تتسم أكل-لي إشارة افيروسيتوسيس القيادة. عادة ما تقتصر على النشرة الداخلية من غشاء البلازما، مع المبرمج تفعيل سكرامبلاسي دهن الذي يعطل هذا التفاوت الغشاء، مما يعرض فوسفاتيديلسيريني على سطح الخلية4. ويوجد على سطح بعض الخلايا غير أبوبتوتيك، مثل الضامة الناضجة خارج الخلية فوسفاتيديلسيريني وتنشيط الصفائح الدموية. ومع ذلك، ليست هذه الخلايا افيروسيتوسيد بسبب وجود إشارات "لا يأكلون لي"، مثل CD47، في تلك الخلية السطحية5،6،7. فوسفاتيديلسيريني المكشوفة المسلم من صفيف مستقبلات افيروسيتيك أعرب عن طريق افيروسيتيس. ملزم لهذه المستقبلات إلى فوسفاتيديلسيريني، أما مباشرة أو من خلال المعونة من أوبسونينس، ينشط مسارات الإشارات التي تعزز الإحاطة الخلية apoptotic إلى المنقبضة غشاء زمنياً وصف افيروسومي8، 9 , 10 , 11 , 12-افيروسومي الصمامات تسلسلياً مع اندوسوميس و lysosomes، التي توفر الآلية الجزيئية الضرورية أسيديفي في افيروسومي وتتحلل في أبوبتوتيك الخلية الشحن13،14. مجرد المتدهورة، يتم الاتجار بالمواد المستمدة من الخلايا أبوبتوتيك إلى دخلول إعادة التدوير – عملية مما يحد من الاستجابات المناعية المستضدات المشتقة من الخلايا أبوبتوتيك، والتي قد تسمح لاسترداد المواد الغذائية من خلية أبوبتوتيك13، 15. فشل في نتائج افيروسيتوسيس في إزالة البصر من الخلايا أبوبتوتيك؛ تخضع هذه الخلايا التي لم تتم إزالتها في نهاية المطاف نخر الثانوية. نخرية الخلايا الإفراج عن محتويات سيتوسوليك برو--التهابات ومسببات الأمراض، وأوتوانتيجينس في الوسط خارج الخلية، وهكذا يقود مجموعة من الأمراض المعدية والالتهابات والمناعة الذاتية16،17. معا، المبرمج وافيروسيتوسيس تيسير إزالة خلايا الموت والميت والسماح للحفاظ على التوازن الأنسجة.
يتطلب التحقيق في الآليات الجزيئية الكامنة وراء افيروسيتوسيس الأساليب التي تتيح إجراء تقييم كمي واضح لامتصاص الخلية أبوبتوتيك. هذا التحديد الكمي معقد من حقيقة أنه خلافا لامتصاص أخرى لا ينتج آليات مثل الالتقام والبلعمه،من1819، افيروسيتوسيس في الإحاطة للخلية الهدف سليمة، أدى إلى استيعاب تدريجي خلية أبوبتوتيك افيروسيتي20. البروتوكول الموضحة هنا وصف في المختبر افيروسيتوسيس مقايسة التي توفر ترسيم دقيق المدخلة مقابل عدم استيعاب أجزاء من الخلايا الفردية أبوبتوتيك ويمكن دمجها مع مجموعة متنوعة من خلايا ثابتة و النهج مجهرية تعيش الخلية. فحوصات البلعمه التقليدية إضافة أجسام مضادة محددة الهدف متجولة في نهاية هذه التجربة من أجل تسمية أهدافا غير مستوعبة، حيث أنه لدينا أسلوب يختلف عن طريق الوسم الهدف أبوبتوتيك مع البيوتين مرتبطة تساهميا21 , 22-بينما apoptotic الخلية أجسام مضادة محددة يمكن أن تستخدم في هذا التحليل، النهج بيوتينيليشن الذي يسمح لأي هدف الحاملة للبروتين يكون المسمى ويتجنب المشاكل المحتملة مع الجسم المضاد الثانوي ه إذا أجرى إيمونوستينينج . على وجه التحديد، فإننا مخطط إعداد الخلايا جوركات أبوبتوتيك التي كانت ملطخة المزدوج مع كل خلية تتبع صبغ والبيوتين. خلية تتبع صبغة يسمح للمواد المستمدة من الخلايا apoptotic تعقبها أثناء افيروسيتوسيس، بينما يسمح بيوتينيليشن السطحية للتمييز لاستيعابه من الأجزاء غير مستوعبة من الخلايا أبوبتوتيك افيروسيتوسيد. كما يصف لنا في الثقافة وإعداد خطوط الخلايا J774.2 و THP-1 للاستخدام افيروسيتيس مورين والبشرية، والمشتقة من الوحيدات الضامة M2 كمثال على افيروسيتوسيس الخلايا الأولية والخلايا جوركات لاستخدامها كأهداف افيروسيتيك. يمكن بسهولة تطبيق هذه الأساليب على خطوط الخلية أو الخلايا الأولية، إلى خلايا الهدف تمر بأي شكل من موت الخلية (مثل المبرمج ونخر نيكروبتوسيس)، وإلى يقلد ميكرون الحجم التي تحاكي apoptotic الخلايا عن طريق الطلاء الدهني أخرى أو طلاء مع يغاندس محددة لمستقبلات افيروسيتيك اهتمام.
الطريقة المبينة في هذا البروتوكول له العديد من المزايا التدفق الخلوي على أساس الأساليب استخداماً في الميدان23،24. قبل التصوير مباشرة التفاعل خلية بلعمية-أبوبتوتيك، جنبا إلى جنب مع وضع العلامات واضحة كل المواد خلية apoptotic التام وغير مستوعبة، يمكن إجراء قياسات كمية افيروسيتوسيس. وعلاوة على ذلك، يحد استخدام fluorophores غير متحسسة للأس الهيدروجيني العوامل المؤثرة الأخرى مثل قمع fluorescence فيتك والتجارة والنقل على درجة الحموضة الليزوزومية أن يفند بعض الأساليب البديلة25. وأخيراً، حين لا يصف بالتفصيل، هذه الأساليب يمكن أن تستخدم باستخدام افيروسيتيس الإعراب عن المتسلسلات المسمى فلوريسسينتلي، أو مع إيمونوستينينج بعد انتهاء التثبيت، للسماح للتحديد الكمي ليشير إلى نشاط الجزيء ورصد العمليات الخلوية أثناء افيروسيتوسيس.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Media</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>3500-000-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Media</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>080-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm circular glass coverslips #1.5 thickness</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72290-08</td>
			<td>Size and shape of coverslip is not critical, but 18 mm fit into the wells of a standard 12-well plate which simplifies cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>81590</td>
			<td>Dissolve in DMSO at 1 mM (1,000x stock solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V-Alexa 488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R37174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link NHS-Biotin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20217</td>
			<td>Store in a dessicator. Do not prepare a stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace FarRed</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C34572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace Orange</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-Streptavadin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SA1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lympholyte-poly cell sepration medium</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>CL5071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-4</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J774.2 Macrophage Cell Line</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85011428-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 Human Monocyte Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jurkat T Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of efferocytosis by single-cell fluorescence microscopy

دراسة تنظيم افيروسيتوسيس يتطلب وسائل تكون قادرة على دقة قياس امتصاص الخلايا أبوبتوتيك والتحقيق في عمليات إرسال الإشارات والخلوية التي تتحكم في افيروسيتوسيس. هذا التحديد الكمي يمكن أن يكون صعباً للقيام على النحو apoptotic الخلايا غالباً افيروسيتوسيد مجزأة، مما يستوجب الطرق التي يمكن أن تحدد بدقة بين الجزء افيروسيتوسيد من هدف أبوبتوتيك مقابل الخلوية أونينجولفيد المتبقية الشظايا. ويستخدم النهج المبين في هذه الوثيقة نهج التسمية المزدوجة لقياس دقة ديناميات القدرات افيروسيتوسيس وافيروسيتيك من افيروسيتيس مثل الضامة. يسمى سيتوسول الخلية أبوبتوتيك بصبغة خلية تتبع لتمكينها من رصد جميع المواد apoptotic المستمدة من الخلية، بينما بيوتينيليشن سطح الخلية apoptotic يسمح بالتمييز بين المدخلة وغير مستوعبة أبوبتوتيك خلية الكسور. يتم تحديد قدرة افيروسيتيك افيروسيتيس بأخذ الصور الفلورية للخلايا الحية أو ثابتة والتحديد الكمي لمقدار منضم مقابل الأهداف المدخلة، كما ميزت تلطيخ streptavidin. هذا النهج يوفر العديد من المزايا على أساليب مثل التدفق الخلوي، هما ترسيم دقيق من غير افيروسيتوسيد مقابل افيروسيتوسيد أبوبتوتيك خلية الكسور، القدرة على قياس ديناميات افيروسيتيك بالفحص المجهري خلية يعيش، القدرة على إجراء دراسات للإشارات الخلوية في الخلايا معربا عن المتسلسلات المسمى فلوريسسينتلي. جنبا إلى جنب، الأساليب المذكورة في هذا البروتوكول بمثابة الأساس لنهج مرن تجريبية التي يمكن استخدامها لدقة قياس النشاط افيروسيتيك واستجواب مسارات الإشارات الخلوية النشطة أثناء افيروسيتوسيس.

بين عشية وضحاها ثقافة خلايا جوركات مع staurosporine ميكرومتر 1 ينتج المبرمج من > 95% خلايا التي يمكن تأكيدها بالخامس Annexin تلطيخ (الشكل 1). يمكن استخدام أنواع الخلايا الأخرى لهذه التجارب، على الرغم من أن تركيز ستاوروسبوريني ومدة العلاج ستاوروسبوريني سوف تحتاج إلى أ?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

مطلوب للحفاظ على التوازن افيروسيتوسيس، إزالة متجولة للخلايا أبوبتوتيك، ويسر مستقبلات ومسارات الإشارات التي تسمح للاعتراف، والإحاطة، واستيعاب الخلايا أبوبتوتيك. وهنا، نقدم بروتوكول الفحص المجهري الأسفار لتقدير افيروسيتوسيس ونشاط مسارات إشارات افيروسيتيك.

التحديد الكمي افيروسيتوسيس بالفحص المجهري Fluorescence خلية واحدة

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

الميكروويف بمساعدة التشخيص السريع للأمراض النباتية من الفيروسات المجهر الإلكتروني ناقل

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

وحيد الخلية تحليل<emالعصوية الرقيقة> الأغشية الحيوية باستخدام المجهر الإسفار والتدفق الخلوي

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

تصور الردود السم البكتيري المستحثة عن طريق لايف مضان المجهري الخليوي

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

القياسات خلية واحدة من تمزق رغوي الناجمة عن مسببات الأمراض بين الخلايا

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

مضان المجهري طرق لتحديد الجدوى من البكتيريا في جمعية مع خلايا الثدييات

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

تقييم نشاط مضاد للفطريات المعزولة من السنخية الضامة التي كتبها متحد البؤر المجهري

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

الكمي عصاري خلوي مقابل رغوي<em&gt; السالمونيلا</em&gt; في الضامة الابتدائية التي كتبها التفاضلية Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

قياس درجة الحموضة يبلوع التي كتبها Ratiometric المجهر مضان

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

والإسفار الفحص بسيطة لالكمي من الكلاب خارج الخلية العدلات فخ الإصدار

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...