Name: quantification of efferocytosis by single-cell fluorescence microscopy
Uploaded: 2018-08-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Cette étude a été financée par les instituts de la santé (IRSC) Operating Grant MOP-123419, Sciences naturelles et ingénierie recherche Conseil de Canada Discovery Grant 418194 et un Ontario Ministère de la recherche et Innovation recherche précoce des prix à la BH. DGW a contribué à certaines des images présentées, à l’optimisation des protocoles et à la rédaction du manuscrit ; Il a été financé par une subvention de l’amorçage de l’Université de Liverpool. CY est financé par une bourse d’études supérieures Vanier et la bourse de doctorat des IRSC. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données et analyse, décision de publier ou préparation du manuscrit.

Collecte de sang des volontaires sains a été approuvé par la Health Sciences Research Ethics Board de l’Université de Western Ontario. Ponction veineuse a été effectuée conformément aux directives de l’énoncé de politique des trois conseils sur la recherche humaine.
1. culture et préparation de la lignée Monocyte THP-1
<ol><li>Monocytes THP-1 de la culture comme une culture en suspension dans des flacons de T25 à 37 ° C + 5 % de CO2. Les cellules doivent être cu...

Les méthodes décrites dans le présent protocole permettent l’imagerie et la quantification du processus dynamique d’efferocytic, en utilisant des approches tant fixe-cellules et cellules vivantes. Ces approches offrent plusieurs avantages par rapport aux flux couramment utilisés méthodes axées sur la cytométrie en flux23,24. L’utilisation de dedans-dehors la coloration avec des échantillons fixes permet une quantification plus robuste et plus préci...

L’apoptose ou mort cellulaire programmée, est un processus physiologique fortement réglementé qui se produit dans la plupart des organismes pluricellulaires et est essentiel pour leur développement et l’homéostasie du1. En plus d’être impliqué dans le renouvellement cellulaire normale et le développement embryonnaire, l’apoptose permet l’élimination des cellules infectées ou endommagées, des tissus et peut être déclenchée en réponse à l’infection, inflammation, cancer et aussi par des interventions médicales comme la radiothérapie ou stéroïdes1. Exposent les cellules apoptotiques « manger-moi » sur leur surface des cellules, des signaux qui sont reconnues par les récepteurs sur un éventail de phagocytes professionnels et non professionnels, appelés « efferocytes ». L’engagement de ces récepteurs induit la captation et la dégradation de la cellule apoptotique de l’efferocyte par un processus appelé efferocytosis2,3. Phosphatidylsérine est le meilleur caractérisés manger-me signal conduite efferocytosis. Il se limite normalement au feuillet interne de la membrane plasmique, avec l’apoptose activant un scramblase de lipides qui perturbe cette asymétrie de la membrane, exposant ainsi la phosphatidylsérine à la surface cellulaire4. Phosphatidylsérine se trouve sur la surface extracellulaire de certaines cellules non-apoptotique, tels que les macrophages matures et activation des plaquettes. Cependant, ces cellules ne sont pas efferocytosed en raison de la présence de « ne me mangez pas » signaux comme CD47, sur leur cellule surface5,6,7. Phosphatidylsérine exposée est reconnu par un tableau d’efferocytic récepteurs exprimés par efferocytes. La liaison de ces récepteurs de phosphatidylsérine, soit directement, soit par le biais de l’aide des opsonines, active des voies de signalisation qui favorisent l’enlisement de la cellule apoptotique dans une vacuole de membrane-bondissent, nommée l’efferosome8, 9 , 10 , 11 , 12. l’efferosome fusibles séquentiellement avec les endosomes et les lysosomes, qui fournissent les mécanismes moléculaires nécessaires pour acidifier l’efferosome et de dégrader l’apoptose cellulaire fret13,14. Une fois dégradée, les matériaux de culture cellulaire apoptotique sont victimes de la traite à l’endosome recyclage — un processus qui limite la réponse immunitaire aux antigènes de culture cellulaire apoptotique, et qui peut permettre la récupération des éléments nutritifs de l’apoptose cellulaire13, 15. Un échec en efferocytosis résultats de la clairance réduite de cellules apoptotiques ; ces cellules désamorcées subissent finalement une nécrose secondaire. Les cellules nécrotiques libèrent pro-inflammatoires contenu cytosolique, des pathogènes et des antigènes dans le milieu extracellulaire, conduisant ainsi une gamme de maladies infectieuses, inflammatoires et autoimmunes16,17. Ensemble, l’apoptose et efferocytosis facilitent l’élimination des cellules mourantes et morts et permettent le maintien de l’homéostasie tissulaire.
Étudie les mécanismes moléculaires sous-jacents efferocytosis nécessite des méthodes qui fournissent une quantification claire de l’apport des cellules apoptotic. Cette quantification est compliquée par le fait que contrairement aux autre absorption des mécanismes tels que l’endocytose et phagocytose18,19, efferocytosis ne peuvent conduire à l’enlisement de la cellule cible intactes, ce qui entraîne l’absorption au coup par coup de la cellule apoptotique de la efferocyte20. Le protocole décrit ci-après décrit une analyse d’efferocytosis in vitro qui prévoit la délimitation précise de l’intériorisée par rapport à des portions non intériorisé de cellules apoptotiques individuels et peut être combiné avec une variété de cellules fixes et approches de la microscopie des cellules vivantes. Dosages traditionnels phagocytose ajouter des anticorps spécifiques à la cible phagocytaire à la fin de l’expérience afin d’étiqueter les cibles non-internalisés, alors que notre méthode se distingue par l’étiquetage la cible apoptotique avec biotine covalente21 , 22. alors que les anticorps spécifiques des cellules apoptotic peuvent être utilisés dans cet essai, l’approche biotinylation permet n’importe quelle cible portant des protéines doivent être étiquetées et évite les problèmes potentiels avec réaction croisée des anticorps secondaires si immunostaining est effectuée . Plus précisément, nous exposons la préparation de cellules Jurkat apoptotiques qui ont été à double marquage avec un colorant de repérage des cellules et la biotine. La cellule colorant de repérage permet pour les matériaux de culture cellulaire apoptotique devant être suivi lors du efferocytosis, tandis que la surface biotinylation permettant la discrimination des intériorisé à des parties non intériorisé d’efferocytosed les cellules apoptotiques. Nous décrivons également la culture et la préparation des lignées de cellules J774.2 et THP-1 pour utilisation comme efferocytes murins et humains, les macrophages dérivés de monocytes de M2 à titre d’exemple de cellules primaires efferocytosis et cellules Jurkat pour utilisation en tant que cibles efferocytic. Ces méthodes peuvent facilement être appliquées à d’autres lignées cellulaires ou de cellules primaires, pour cibler les cellules subissant toute forme de mort cellulaire (apoptosepar exemple , une nécrose et necroptosis) et imite taille micron qui simulent les cellules apoptotiques par les revêtements de lipides ou revêtement avec des ligands spécifiques à un récepteur d’efferocytic d’intérêt.
La méthode décrite dans le présent protocole présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes écoulement cytometry basé couramment utilisés dans le champ23,24. Par imagerie directement l’interaction cellule phagocyte-apoptotiques, combinée à un étiquetage clair des deux matériau à cellules apoptotic total et non intériorisé, mesures quantitatives des efferocytosis sont possibles. En outre, l’utilisation de fluorophores insensible à pH limite des facteurs confondants tels que la suppression de la fluorescence FITC et GFP à pH lysosomal qui confond certaines méthodes alternatives25. Enfin, ne pas décrite en détail, ces méthodes peuvent être employées à l’aide d’efferocytes exprimant des transgènes fluorescent marqué, ou avec l’immunomarquage après fixation, afin de permettre à la quantification de l’activité de la molécule de signalisation et de surveillance de la processus cellulaires au cours de l’efferocytosis.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Media</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>3500-000-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Media</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>080-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm circular glass coverslips #1.5 thickness</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72290-08</td>
			<td>Size and shape of coverslip is not critical, but 18 mm fit into the wells of a standard 12-well plate which simplifies cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>81590</td>
			<td>Dissolve in DMSO at 1 mM (1,000x stock solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V-Alexa 488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R37174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link NHS-Biotin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20217</td>
			<td>Store in a dessicator. Do not prepare a stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace FarRed</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C34572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace Orange</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-Streptavadin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SA1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lympholyte-poly cell sepration medium</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>CL5071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-4</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J774.2 Macrophage Cell Line</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85011428-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 Human Monocyte Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jurkat T Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of efferocytosis by single-cell fluorescence microscopy

Étudier la régulation de l’efferocytosis exige que les méthodes qui sont en mesure de quantifier avec précision la captation des cellules apoptotiques, d’étudier les processus cellulaires et signalisation contrôlant efferocytosis. Cette quantification peut être difficile à réaliser car les cellules apoptotiques sont souvent efferocytosed fragmentaire, d'où nécessité de méthodes qui peuvent délimiter avec précision entre la partie efferocytosed d’une cible apoptose versus résiduelle cellulaire unengulfed fragments. L’approche décrite ci-après utilise double-marquage des approches afin de quantifier avec précision la dynamique de capacité efferocytosis et efferocytic des efferocytes tels que les macrophages. Le cytosol de la cellule apoptotique est marqué par un agent de la cellule de suivi pour permettre un suivi de toutes les matières de culture cellulaire apoptotique, tandis que biotinylation surface de la cellule apoptotique permet la différenciation entre intériorisée et non-internalisés fractions de cellules apoptotiques. La capacité d’efferocytic d’efferocytes est déterminée en prenant des images fluorescentes des cellules vivantes ou fixes et quantifier la quantité de lié par rapport aux cibles intériorisées, comme dissociés par coloration de streptavidine. Cette approche offre plusieurs avantages par rapport aux méthodes telles que de la cytométrie en flux, à savoir la délimitation exacte des non-efferocytosed versus efferocytosed fractions de cellules apoptotiques, la capacité de mesurer la dynamique efferocytic par microscopie des cellules vivantes et le capacité d’effectuer des études de signalisation cellulaire dans les cellules exprimant des transgènes fluorescent marqué. Les méthodes décrites dans le présent protocole combiné, servent de base pour une approche expérimentale flexible qui peut être utilisée pour quantifier avec précision l’activité efferocytic et interroger les voies de signalisation cellulaires actives au cours de l’efferocytosis.

Culture de cellules Jurkat avec résultats la staurosporine 1 µM dans l’apoptose de la nuit > 95 % des cellules, qui peuvent être confirmés avec l’annexine V, coloration (Figure 1). Autres types de cellules peuvent être utilisés pour ces expériences, même si la concentration de la staurosporine et la durée du traitement la staurosporine auront besoin d’être optimisé pour chaque lignée cellulaire. Pour une détection fiable et la quantificatio...

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Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Efferocytosis, la suppression phagocytaire des cellules apoptotiques, est nécessaire pour maintenir l’homéostasie et est facilitée par les récepteurs et les voies de signalisation qui permettent la reconnaissance, d’une durée et l’internalisation des cellules apoptotiques. Ici, nous présentons un protocole de microscopie de fluorescence pour la quantification de l’efferocytosis et l’activité des voies de signalisation d’efferocytic.

Quantification des Efferocytosis en microscopie par Fluorescence des cellules individuelles

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

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