Name: quantification of efferocytosis by single-cell fluorescence microscopy
Uploaded: 2018-08-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Denne studien ble finansiert av kanadiske Institutes of Health Research (CIHR) opererer Grant MOPP-123419, naturvitenskap og Engineering Research Council for Canada Discovery Grant 418194, og en Ontario departementet for forskning og innovasjon tidlig forskning prisen til BH. DGW bidro noen av bildene presentert, optimalisering av protokollene og skrivingen av manuskriptet; Han ble finansiert av en disposisjon stipend fra Universitetet i Liverpool. CY er finansiert av en Vanier Graduate Scholarship og CIHR MD/PhD Studentship. Virkemiddelapparat ikke hadde noen rolle i studien design, innsamling og analyse, beslutningen om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet.

Samling av blod fra friske frivillige ble godkjent av helse vitenskap forskning etikk styret av University of Western Ontario. Venipuncture ble utført i samsvar med retningslinjene i Tri-rådet policyutsagnet på menneskelig forskning.
1. kultur og utarbeidelse av THP-1 Monocyte celle linjen
<ol><li>Kultur THP-1 reaksjoner som en suspensjon kultur i T25 flasker på 37 ° C + 5% CO2. Celler bør dyrkes i 5 mL Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) + 10% fosterets Bovine ...

Metodene som er nevnt i denne protokollen Aktiver bildebehandling og kvantifisering av dynamisk efferocytic prosessen, bruke både fast-celle og live-celle tilnærminger. Disse metodene har flere fordeler sammenlignet med vanlig ansatt flyt cytometri-baserte metoder23,24. Bruk av innsiden ut flekker med fast prøver gir en mer robust og nøyaktig kvantifisering av hastighet og omfanget av efferocytosis-faktisk mange flyt cytometri-baserte metoder bare etiketten a...

Apoptose, eller programmert celledød, er en sterkt regulert fysiologisk prosess som skjer i de fleste multicellular organismer og er avgjørende for deres utvikling og homeostase1. I tillegg til å være involvert i normal celle omsetning og embryonale utvikling, apoptose gjør fjerning av infiserte eller skadede celler fra vev og kan utløses svar på infeksjon, betennelse, kreft, og også av medisinske tiltak for eksempel strålebehandling eller steroider1. Apoptotisk celler avsløre "spise-meg" signaler på celleoverflaten deres som gjenkjennes av reseptorer på en rekke profesjonelle og ikke-profesjonell phagocytes, kollektivt referert til som "efferocytes". Engasjement i disse reseptorene induserer opptak og nedbrytning av apoptotisk cellen ved efferocyte gjennom en prosess som kalles efferocytosis2,3. Fosfatidylserin er best preget spise-meg signal kjøring efferocytosis. Det er vanligvis begrenset til indre heftet av plasma membranen, med apoptose aktivere en lipid scramblase som forstyrrer denne membranen asymmetri, dermed utsette fosfatidylserin på celle overflaten4. Fosfatidylserin finnes på ekstracellulære overflaten av noen ikke-apoptotisk celler, for eksempel eldre makrofager og aktivert blodplater. Disse cellene er imidlertid ikke efferocytosed av «ikke spise meg» signaler, for eksempel CD47, på deres cellen overflaten5,6,7. Utsatte fosfatidylserin gjenkjennes av en rekke efferocytic reseptorer uttrykt av efferocytes. Binding av disse reseptorene til fosfatidylserin, aktiverer enten direkte eller ved hjelp av opsonins, signalveier som fremmer engulfment til apoptotisk-cellen i en membran-bundet vacuole kalt efferosome8, 9 , 10 , 11 , 12. efferosome sikringer sekvensielt med endosomes og lysosomer, som leverer den molekylære maskineriet å surheten i efferosome og svekke apoptotisk cellen Last13,14. Når degradert, apoptotisk celle-avledet materiale smugles til gjenvinning endosome – en prosess som begrenser immunreaksjoner mot apoptotisk celle-avledet antigener, og som kan tillate for utvinning av næringsstoffer fra den apoptotisk celle13, 15. Feil i efferocytosis fører til svekket klarering av apoptotisk celler. disse innskuddet cellene gjennom til slutt sekundære nekrose. Nekrotisk celler slipper pro-inflammatoriske cytosolic innholdet, patogener og autoantigens i det ekstracellulære miljøet, dermed kjørte en rekke infeksiøs, provoserende og autoimmune sykdommer16,17. Sammen apoptose og efferocytosis lette fjerning av døende og døde celler og tillate for vedlikehold av vev homeostase.
Undersøker molekylære mekanismer underliggende efferocytosis krever metoder som gir en klar kvantifisering av apoptotisk celle opptak. Denne kvantifisering er komplisert av det faktum at i motsetning til andre opptaket mekanismer som endocytose og fagocytose18,19, efferocytosis ikke kan resultere i engulfment av intakt målcellen, noe som resulterer i stykkevis opptaket apoptotisk cellen av efferocyte20. Protokollen beskrevet her beskriver i vitro efferocytosis analysen som gir nøyaktige avgrensning av den internalisert versus ikke-internalisert deler av personlige apoptotisk celler og kan kombineres med en rekke fast-celle og Live-celle mikroskopi tilnærminger. Tradisjonelle fagocytose analyser legge antistoffer spesifikke phagocytic målet på slutten av eksperimentet for å merke ikke-internalisert mål, mens vår metode forskjellig merking apoptotisk målet med covalently er koblet biotin21 , 22. mens apoptotisk celle spesifikke antistoffer kan brukes i denne analysen biotinylation tilnærmingen gir noe protein-bærende mål merkes og unngår potensielle problemer med sekundær antistoff kryssreaktivitet hvis immunostaining er utført . Spesielt skissere vi utarbeidelsen av apoptotisk Jurkat celler som har vært dobbelt-farget med både celle sporing fargestoff og biotin. Cellen sporing fargestoff tillater apoptotisk celle-avledet materiale sporet under efferocytosis, mens overflaten biotinylation tillater diskriminering av internalisert fra ikke-internalisert deler av efferocytosed apoptotisk celler. Vi beskriver også kultur og utarbeidelse av J774.2 og THP-1 linjer for bruk som murine og menneskelig efferocytes, monocytt-avledet M2 makrofager som et eksempel på primære cellen efferocytosis og Jurkat celler for bruk som efferocytic mål. Disse metodene kan lett brukes på andre linjer eller primære celler, målcellene gjennomgår noen form for celledød (f.eks apoptose, nekrose og necroptosis) og mikron-størrelse imiterer som simulere apoptotisk celler gjennom lipid belegg eller belegg med ligander gjelder for en efferocytic reseptor rundt.
Metoden skissert i denne protokollen har flere fordeler sammenlignet med flyt cytometri basert metoder som vanligvis brukes i feltet23,24. Ved direkte imaging phagocyte-apoptotisk celle samhandling, kombinert med Fjern merking av både total og ikke-internalisert apoptotisk celle materiale, kan kvantitative tiltak av efferocytosis gjøres. Videre begrenser bruk av pH-ufølsom fluorophores forvirrende faktorer som undertrykkelse av FITC og GFP fluorescens ved lysosomale pH som forundrer noen alternative metoder25. Til slutt, mens ikke beskrevet i detalj, disse metodene kan brukes med efferocytes uttrykke fluorescently-merket effekter av transgener, eller med post fiksering immunostai-, å tillate for kvantifisering Signalering molekyl aktivitet og oppfølging av den cellulære prosesser under efferocytosis.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Media</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>3500-000-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Media</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>080-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm circular glass coverslips #1.5 thickness</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72290-08</td>
			<td>Size and shape of coverslip is not critical, but 18 mm fit into the wells of a standard 12-well plate which simplifies cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>81590</td>
			<td>Dissolve in DMSO at 1 mM (1,000x stock solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V-Alexa 488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R37174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link NHS-Biotin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20217</td>
			<td>Store in a dessicator. Do not prepare a stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace FarRed</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C34572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace Orange</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-Streptavadin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SA1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lympholyte-poly cell sepration medium</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>CL5071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-4</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J774.2 Macrophage Cell Line</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85011428-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 Human Monocyte Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jurkat T Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of efferocytosis by single-cell fluorescence microscopy

Studere regulering av efferocytosis krever metoder som er nøyaktig kvantifisere opptaket av apoptotisk celler og undersøke signalnettverk og cellulær prosessene som styrer efferocytosis. Denne kvantifisering kan være vanskelig å utføre apoptotisk celler er ofte efferocytosed stykkevis, dermed nødvendiggjør metoder som kan nøyaktig avgrense mellom den efferocytosed delen av en apoptotisk mål mot gjenværende unengulfed mobilnettet fragmenter. Tilnærmingen skissert heri utnytter dual-merking tilnærminger til å tallfeste nøyaktig dynamikken i efferocytosis og efferocytic antall efferocytes som makrofager. Stoffer til apoptotisk-cellen er merket med en celle-sporing fargestoff aktivere overvåking av alle apoptotisk celle-avledet materiale, mens overflaten biotinylation apoptotisk cellen tillater differensiering mellom internalisert og ikke-internalisert apoptotisk celle fraksjoner. Efferocytic kapasitet på efferocytes bestemmes av tar fluorescerende bilder av live eller fast celler og kvantifisere mengden bundet versus internalisert mål, som atskilte av streptavidin flekker. Denne tilnærmingen gir flere fordeler sammenlignet med metoder som flowcytometri, nemlig nøyaktig avgrensning av ikke-efferocytosed mot efferocytosed apoptotisk celle fraksjoner, muligheten til å måle efferocytic dynamics live-celle mikroskopi, og kapasitet til å utføre studier av mobilnettet signalering i celler som uttrykker fluorescently-merket effekter av transgener. Kombinert, tjene metodene som er nevnt i denne protokollen som grunnlag for en fleksibel eksperimentelle tilnærming som kan brukes til nøyaktig kvantifisere efferocytic aktivitet og undersøke mobilnettet signalveier aktive under efferocytosis.

Natten kultur av Jurkat celler med 1 µM staurosporine gir apoptose av > 95% av celler som kan bekreftes med Annexin V flekker (figur 1). Andre celletyper, kan brukes av disse eksperimentene, men konsentrasjonen av staurosporine og staurosporine behandling varighet må være optimalisert for hver celle linje. For pålitelig gjenkjenning og kvantifisering av efferocytosis, > 80% av cellene skal apoptotisk før du legger dem til i efferocytes. Andre indusere av...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Efferocytosis, phagocytic fjerning av apoptotisk celler, er nødvendig for å opprettholde homeostase og er tilrettelagt av reseptorer og signalveier at for anerkjennelse, engulfment og internalisering av apoptotisk celler. Her presenterer vi en fluorescens mikroskopi protokoll for kvantifisering av efferocytosis og aktiviteten til efferocytic signalveier.

Kvantifisering av Efferocytosis av encellede fluorescens mikroskopi

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-celle Analyse av Bacillus subtilis Biofilm Bruke fluorescensmikroskopi og flowcytometrisystemer

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Visualisering av bakteriell Toxin Utførte Responses ved hjelp av Live Cell fluorescensmikroskopi

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Encellete Målinger av vacuolar Rupture forårsaket av intracellulære patogener

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Fluorescensmikroskopi metoder for å bestemme levedyktigheten til bakterier i foreningen med pattedyrceller

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Vurdere Anti-sopp aktivitet av isolerte alveolære makrofager ved konfokalmikroskopi

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Kvantifisering av cytosolisk vs. vacuolar<em&gt; Salmonella</em&gt; I Primær Makrofager av Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Måling Phagosome pH ved Proporsjonellekspansjon Fluorescensmikroskopi

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

En enkel Fluorescens analyse for Kvantifisering av Canine nøytrofile ekstracellulær felle utløsning

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...