Name: quantification of efferocytosis by single-cell fluorescence microscopy
Uploaded: 2018-08-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Este estudo foi financiado pelos institutos canadenses de saúde (CIHR) de pesquisa operacional Grant MOP-123419, ciências naturais e engenharia pesquisa Conselho de Canadá Discovery Grant 418194 e um Ontario Ministério da investigação e inovação início Research Award para BH. DGW contribuiu com algumas das imagens apresentadas, para a otimização dos protocolos e a escrita do manuscrito; Ele foi financiado por um subsídio de escorva da bomba da Universidade de Liverpool. CY é financiado por uma bolsa de pós-graduação de Vanier e CIHR MD/PhD Studentship. Agências de fomento não tinham qualquer papel no projeto de estudo, coleta de dados e análise, a decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Coleta de sangue de voluntários saudáveis foi aprovada pelo Conselho de ética de saúde ciência pesquisa da Universidade de Western Ontario. Foi realizada punção venosa em conformidade com as orientações da instrução de diretiva Tri-Conselho na pesquisa humana.
1. cultura e preparação da linha celular THP-1 monócito
<ol><li>Monócitos THP-1 de cultura como uma cultura de suspensão em frascos T25 em 37 ° C + 5% de CO2. Células devem ser cultivadas em 5 mL de Roswell...

Os métodos descritos neste protocolo permitem que a imagem e a quantificação do processo de efferocytic dinâmico, com abordagens tanto fixo-célula e célula viver. Essas abordagens oferecem diversas vantagens sobre os métodos baseados em citometria de fluxo comumente empregados23,24. O uso de coloração de dentro para fora com amostras fixas fornece uma quantificação mais robusta e precisa da taxa e a extensão da efferocytosis — de fato, muitos métod...

Apoptose, ou morte celular programada, é um processo fisiológico que ocorre na maioria dos organismos multicelulares e é crucial para seu desenvolvimento e homeostase1altamente regulamentados. Além de estar envolvido na renovação celular normal e o desenvolvimento embrionário, apoptose permite a eliminação de células infectadas ou danificadas de tecidos e pode ser acionado em resposta à infecção, inflamação, câncer e também por intervenções médicas como a radioterapia ou esteroides1. Células apoptóticas expõem "coma-me" sinais em sua superfície celular, que são reconhecidos pelos receptores em um intervalo de fagócitos profissionais e não profissionais, referidos coletivamente como "efferocytes". Engajamento desses receptores induz a absorção e a degradação da célula apoptótica pelo efferocyte através de um processo conhecido como efferocytosis2,3. A fosfatidilserina é o melhor caracterizadas comer-me sinal de condução efferocytosis. Normalmente é pequeno para o folheto interno da membrana plasmática, com apoptose ativando um scramblase de lipídios que interrompe esta assimetria da membrana, expondo assim a fosfatidilserina na superfície celular4. A fosfatidilserina é encontrada na superfície de algumas células não-apoptotic, tais como os macrófagos maduros extracelular e ativado plaquetas. No entanto, estas células não são efferocytosed devido à presença de sinais "não me coma", tais como CD47, na sua célula superfície5,6,7. Exposta a fosfatidilserina é reconhecida por uma matriz de receptores efferocytic expressado por efferocytes. Vinculação destes receptores de fosfatidilserina, directamente ou através da ajuda de opsoninas, ativa vias de sinalização que promovem a absorção da célula apoptótica em um vacuole membrana-limite denominado o efferosome8, 9 , 10 , 11 , 12. o efferosome funde-se sequencialmente com endossomos e lisossomos, que entregam a maquinaria molecular necessária acidificar o efferosome e degradar a apoptose de células carga13,14. Uma vez degradados, os materiais de derivado de células apoptóticas são traficados para o endossomo reciclagem — um processo que limita a respostas imunes aos antígenos de apoptotic derivado de células, e que podem permitir recuperação de nutrientes do apoptose celular13, 15. Uma falha no efferocytosis resulta em prejudicada afastamento de pilhas apoptotic; Estas células não compensadas eventualmente sofrem necrose secundária. Necróticas células versão pro-inflamatórios conteúdo citosólico, patógenos e auto-antigénios para o meio extracelular, assim, conduzir a uma gama de doenças infecciosas, inflamatórias e auto-imunes16,17. Juntos, apoptose e efferocytosis facilitar a remoção de células moribundos e mortas e permitir a manutenção da homeostase do tecido.
Investigar os mecanismos moleculares subjacentes efferocytosis requer métodos que fornecem uma clara quantificação da captação de células apoptóticas. Esta quantificação é complicada pelo fato de que, ao contrário de outra absorção mecanismos como endocitose e fagocitose18,19, efferocytosis não podem resultar no engulfment da célula-alvo intacta, tendo por resultado a absorção por etapas da célula apoptótica pelo efferocyte20. O protocolo descrito neste documento descreve um em vitro ensaio de efferocytosis que fornece a delimitação exata do interiorizado versus não-internalizada porções de pilhas apoptotic individuais e pode ser combinado com uma variedade de células fixas e abordagens de microscopia de viver-pilha. Ensaios de fagocitose tradicional Acrescente os anticorpos específicos para o destino fagocitária ao final do experimento para rotular alvos não-internalizada, onde, como nosso método diferem pela rotulagem o alvo de apoptotic com biotina covalentemente ligados21 , 22. enquanto os anticorpos específicos de apoptose celular podem ser usados neste ensaio, a abordagem biotinylation permite qualquer alvo de proteína-rolamento a ser rotulados e evita possíveis problemas com reactividade cruzada do anticorpo secundário se immunostaining é executada . Especificamente, descrevem a preparação de pilhas apoptotic Jurkat que foram dual-manchada com uma tintura de seguimento de célula e biotina. A célula de tintura de rastreamento permite apoptotic materiais derivados de célula a ser controlados durante a efferocytosis, Considerando que a superfície biotinylation permite a discriminação de internalizada de partes não-internalizada de pilhas apoptotic de efferocytosed. Também descrevemos a cultura e a preparação das linhas de células J774.2 e THP-1 para uso como efferocytes murino e humano, derivados de monócitos os macrófagos M2 como um exemplo de célula primária efferocytosis e células Jurkat para uso como alvos de efferocytic. Esses métodos podem ser facilmente aplicados para outras linhas de célula ou células primárias, submetidos a qualquer forma de morte celular (por exemplo, apoptose, necrose e necroptosis) nas células-alvo e imita micro-empresas que simulam células apoptóticas através de revestimentos de lipídios ou revestimento com ligantes específicos a um receptor de efferocytic de interesse.
O método descrito neste protocolo tem várias vantagens sobre os métodos de fluxo cytometry baseado comumente usados no campo23,24. Por imagem diretamente a interação da célula de fagócito-apoptotic, combinada com rotulagem clara de ambos material de célula apoptótica total e não-internalizada, medidas quantitativas de efferocytosis podem ser feitas. Além disso, o uso de pH-insensível fluorophores limita confundimento fatores tais como a supressão da fluorescência FITC e GFP no pH dos lisossomos que confunde alguns métodos alternativos de25. Por último, embora não descrito em detalhe, esses métodos podem ser empregados usando efferocytes expressar transgenes fluorescente-etiquetadas, ou com pós-fixação imunocoloração, para permitir a quantificação da atividade da molécula de sinalização e controlo da processos celulares durante efferocytosis.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Media</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>3500-000-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Media</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>080-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm circular glass coverslips #1.5 thickness</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72290-08</td>
			<td>Size and shape of coverslip is not critical, but 18 mm fit into the wells of a standard 12-well plate which simplifies cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>81590</td>
			<td>Dissolve in DMSO at 1 mM (1,000x stock solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V-Alexa 488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R37174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link NHS-Biotin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20217</td>
			<td>Store in a dessicator. Do not prepare a stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace FarRed</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C34572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace Orange</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-Streptavadin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SA1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lympholyte-poly cell sepration medium</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>CL5071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-4</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J774.2 Macrophage Cell Line</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85011428-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 Human Monocyte Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jurkat T Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of efferocytosis by single-cell fluorescence microscopy

Estudar o Regulamento de efferocytosis requer métodos que são capazes de quantificar com precisão a absorção de pilhas apoptotic e sondar os processos de sinalização e celulares que controlam o efferocytosis. Esta quantificação pode ser difícil de executar como pilhas apoptotic são frequentemente efferocytosed fragmentada, necessitando de métodos que podem delinear com precisão entre a parte de efferocytosed de um alvo de apoptotic contra residual celular unengulfed fragmentos. A abordagem descrita neste documento utiliza abordagens dual-rotulagem para quantificar com precisão a dinâmica da capacidade de efferocytosis e efferocytic de efferocytes tais como macrófagos. O citoplasma da célula apoptótica é rotulado com uma tintura de seguimento-celular para habilitar o monitoramento de todos os materiais derivado de células apoptóticas, enquanto biotinylation superfície da célula apoptótica permite a diferenciação entre interiorizado e não-internalizada fracções de células apoptóticas. A capacidade de efferocytic de efferocytes é determinada pela tomada de imagens fluorescentes de células vivas ou fixas e quantificar a quantidade de limite contra alvos interiorizados, como diferenciados pela coloração de estreptavidina. Essa abordagem oferece diversas vantagens sobre os métodos tais como citometria de fluxo, ou seja a delimitação exata de não-efferocytosed contra efferocytosed apoptotic fracções de célula, a capacidade de medir efferocytic dinâmica por microscopia de viver-pilha e o capacidade para realizar estudos de sinalização celular em células expressando transgenes fluorescente-etiquetadas. Os métodos descritos neste protocolo combinado, servem como base para uma abordagem experimental flexível que pode ser usada para quantificar com precisão a atividade efferocytic e interrogar as vias de sinalização celulares ativas durante efferocytosis.

Uma noite de cultura de células Jurkat com resultados de staurosporine de 1 µM em apoptose de > 95% das células, que podem ser confirmadas com anexina V coloração (Figura 1). Outros tipos de células podem ser usados para estas experiências, embora a concentração de staurosporine e a duração do tratamento staurosporine precisará ser otimizado para cada linha de celular. Para detecção confiável e quantificação de efferocytosis, > 80% das célul...

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Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Efferocytosis, a remoção fagocitária das células apoptóticas, é necessário para manter a homeostase e é facilitado por receptores e vias de sinalização que permitem o reconhecimento, a duração e internalização de pilhas apoptotic. Neste documento, apresentamos um protocolo de microscopia de fluorescência para a quantificação dos efferocytosis e a atividade das vias de sinalização de efferocytic.

Quantificação de Efferocytosis por microscopia de fluorescência de célula única

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Research

JoVE Journal

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