Name: quantification of efferocytosis by single-cell fluorescence microscopy
Uploaded: 2018-08-18T14:00:00
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Este estudio fue financiado por los institutos canadienses de Health Research (CIHR) operación Grant MOP-123419, ciencias naturales, ingeniería investigación Consejo de Canadá Discovery Grant 418194 y Ontario Ministerio de investigación e innovación temprana investigación Premio a BH. DGW contribuido algunas de las imágenes presentadas, a la optimización de los protocolos y a la escritura del manuscrito; él fue financiado por una subvención de cebado de la bomba de la Universidad de Liverpool. CY es financiado por una beca postgrado Vanier y beca de MD/PhD de CIHR. Las agencias de financiación no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos y análisis, publicación o preparación del manuscrito.

Colección de sangre de voluntarios sanos fue aprobado por la Junta de ética de investigación de ciencia de salud de la Universidad de Ontario Occidental. Venopunción fue realizada siguiendo las directrices de la declaración de política Tri-Consejo de investigaciones en seres humanos.
1. cultura y preparación de la línea de celular del monocito THP-1
<ol><li>Monocitos de THP-1 de cultura como una cultura de suspensión en frascos T25 a 37 ° C + 5% CO2. Las células deben c...

Los métodos establecidos en este protocolo permiten la proyección de imagen y cuantificación del proceso dinámico efferocytic, utilizando enfoques células fijas y células vivas. Estos enfoques ofrecen varias ventajas sobre los métodos basados en citometría de flujo comúnmente empleadas23,24. El uso de adentro hacia fuera manchas con muestras fijadas proporciona una cuantificación más robusta y precisa de la tasa y el grado de efferocytosis, de hecho, m...

Apoptosis o muerte celular programada, es un proceso fisiológico altamente regulado que ocurre en la mayoría de los organismos multicelular y es crucial para su desarrollo y homeostasis1. Además de estar involucrado en el recambio celular normal y el desarrollo embrionario, la apoptosis permite la eliminación de las células infectadas o dañadas de los tejidos y puede activarse en respuesta a infección, inflamación, cáncer y también por las intervenciones médicas como radioterapia o esteroides1. Células apoptóticas exponen "comer-me" señales en su superficie celular que son reconocidas por receptores en una gama de los fagocitos profesionales y no profesionales, denominadas colectivamente como "efferocytes". Participación de estos receptores induce la captación y degradación de la célula apoptótica por el efferocyte a través de un proceso conocido como efferocytosis2,3. Fosfatidilserina es el mejor caracterizado comer-me efferocytosis conducción de la señal. Normalmente se limita a la hoja interna de la membrana plasmática, con apoptosis activando un scramblase lípidos que interrumpe esta asimetría de la membrana, exponiendo fosfatidilserina en la superficie de la célula4. Fosfatidilserina se encuentra en la superficie extracelular de algunas células no apoptóticas, tales como los macrófagos maduros y activa las plaquetas. Sin embargo, estas células no son efferocytosed debido a la presencia de "no me come" señales, como la CD47, en sus células superficiales5,6,7. Fosfatidilserina expuesto es reconocido por una variedad de receptores de efferocytic de efferocytes. Unión de estos receptores a fosfatidilserina, ya sea directamente o a través de la ayuda de opsoninas, activa vías de señalización que promueven la inmersión de la célula apoptótica en una vacuola membrana-limitan como el efferosome8, 9 , 10 , 11 , 12. el efferosome funde secuencialmente con endosomas y lisosomas, que entregan la maquinaria molecular necesaria para acidificar el efferosome y degradar la apoptosis de la célula de carga13,14. Una vez degradado, los materiales derivados de la célula apoptótica son traficados para el endosome reciclaje — un proceso que limita la respuesta inmune a antígenos derivados de células apoptóticas, y que pueden permitir la recuperación de nutrientes de la apoptosis de la célula13, 15. Un fracaso en los resultados de la efferocytosis en la separación deteriorada de células apoptóticas; Estas células someterse eventualmente a necrosis secundaria. Células necróticas liberan contenido citosólico pro-inflamatoria, patógenos y autoantígenos en el medio extracelular, así el conducir una variedad de enfermedades infecciosas, inflamatorias y autoinmunes16,17. Juntos, apoptosis y efferocytosis facilitan la eliminación de células muertas y moribundas y permiten el mantenimiento de la homeostasis del tejido.
Investigar los mecanismos moleculares subyacentes a efferocytosis requiere de métodos que permiten una cuantificación clara de captación de apoptosis celular. Esta cuantificación es complicada por el hecho de que a diferencia de la absorción de otros mecanismos tales como endocitosis y fagocitosis18,19, efferocytosis no pueden resultar en la inmersión de la célula objetivo intacto, dando por resultado la absorción gradual de la célula apoptótica por el efferocyte20. El protocolo descrito en este documento describe un ensayo en vitro efferocytosis que proporciona la delineación exacta de la internalizada versus no internalizan las porciones de células apoptóticas individuales y se puede combinar con una variedad de células fijas y métodos de microscopía de células vivas. Ensayos de fagocitosis tradicional añadir anticuerpos específicos al objetivo fagocítico al final del experimento para objetivos no interiorizado, la etiqueta donde como nuestro método diferencia por etiquetado el objetivo de la apoptosis con biotina covalentemente ligado21 , 22. mientras que los anticuerpos específicos de la célula apoptótica pueden ser utilizados en este análisis, el enfoque de Biotinilación permite para que cualquier destino de proteína lleva a etiquetarse y evita posibles problemas con reactividad cruzada del anticuerpo secundario si se realiza inmunotinción . En particular, describiremos la preparación de las células de Jurkat apoptotic que han sido doble tinción con un colorante de seguimiento de la célula y la biotina. La célula de seguimiento de tinte permite apoptotic mástil-célula-derivados materiales rastreados en efferocytosis, mientras que permite la discriminación de Biotinilación superficial internalizado desde porciones no interiorizada de las células apoptotic efferocytosed. También describimos la cultura y la preparación de líneas celulares de J774.2 y THP-1 para uso como efferocytes murino y humano, macrófagos derivados de monocitos de M2 como un ejemplo de celulares primarios de células efferocytosis y células de Jurkat para el uso como blancos de efferocytic. Estos métodos pueden aplicarse fácilmente a otras líneas celulares o células primarias, células diana sometidos a cualquier forma de muerte celular (por ejemplo , la necrosis y la apoptosis necroptosis) e imitadores de tamaño micrométrico que simulan células apoptóticas a través de capas de lípidos o capa con ligandos específicos de un receptor de efferocytic de interés.
El método descrito en el presente Protocolo tiene varias ventajas sobre los métodos de flujo cytometry basado comúnmente utilizados en el campo23,24. Por proyección de imagen directamente la interacción de la célula fagocito-apoptotic, combinada con un etiquetado claro de tanto material total y no interiorizados apoptotic de la célula, se pueden hacer medidas cuantitativas de efferocytosis. Por otra parte, el uso de fluoróforos pH insensible limita factores de confusión tales como la supresión de la fluorescencia de GFP y FITC a pH lisosomal que confunde algunos métodos alternativos25. Por último, aunque no se describe en detalle, estos métodos pueden emplearse utilizando efferocytes expresar transgenes marcada con fluorescencia, o con inmunotinción posteriores a la fijación, para permitir la cuantificación de la actividad de la molécula de señalización y control de la procesos celulares durante la efferocytosis.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Media</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>3500-000-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Media</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>080-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm circular glass coverslips #1.5 thickness</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72290-08</td>
			<td>Size and shape of coverslip is not critical, but 18 mm fit into the wells of a standard 12-well plate which simplifies cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>81590</td>
			<td>Dissolve in DMSO at 1 mM (1,000x stock solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V-Alexa 488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R37174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link NHS-Biotin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20217</td>
			<td>Store in a dessicator. Do not prepare a stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace FarRed</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C34572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace Orange</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-Streptavadin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SA1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lympholyte-poly cell sepration medium</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>CL5071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-4</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J774.2 Macrophage Cell Line</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85011428-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 Human Monocyte Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jurkat T Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of efferocytosis by single-cell fluorescence microscopy

Estudiar la regulación de la efferocytosis requiere de métodos que son capaces de cuantificar con precisión la absorción de células apoptóticas y los procesos de señalización y celulares que controlan el efferocytosis la punta de prueba. Esta cuantificación puede ser difícil de realizar como células apoptóticas son a menudo efferocytosed paulatinamente, así que los métodos que se pueden delinear con precisión entre la porción efferocytosed de un objetivo de apoptosis versus residual celular unengulfed los fragmentos. El enfoque descrito en el presente documento utiliza doble etiquetado enfoques para cuantificar con precisión la dinámica de la capacidad efferocytosis y efferocytic de efferocytes tales como los macrófagos. El citosol de la célula apoptótica se etiqueta con un tinte de seguimiento de la célula para permitir el seguimiento de todos los apoptóticos mástil-célula-derivados materiales, mientras Biotinilación superficial de la célula apoptótica permite diferenciar entre internalizada y no internalizan fracciones de la célula apoptótica. La capacidad de efferocytic de efferocytes se determina tomando imágenes fluorescentes de células vivas o fijas y cuantificar la cantidad de consolidados versus objetivos internalizados, como diferenciadas por la coloración de estreptavidina. Este enfoque ofrece varias ventajas sobre los métodos tales como la citometría de flujo, es decir, la delineación precisa de no efferocytosed versus efferocytosed apoptóticos fracciones celulares, la capacidad de medir la dinámica efferocytic por microscopía de células vivas y la capacidad para realizar estudios de señalización celular en las células que expresan los transgenes marcada con fluorescencia. Combinados, los métodos establecidos en este protocolo sirven como base para un enfoque experimental flexible que puede utilizarse para cuantificar con precisión la actividad efferocytic e interrogar vías de señalización celulares activas durante efferocytosis.

Noche de cultura de células Jurkat con resultados de estaurosporina de 1 μm en la apoptosis de > 95% de las células, que pueden confirmarse con anexina V tinción (figura 1). Otros tipos de células pueden ser utilizados para estos experimentos, aunque la concentración de estaurosporina y la duración del tratamiento de estaurosporina necesitará optimizarse para cada línea celular. Para la detección confiable y cuantificación de efferocytosis, > 80% d...

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Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Efferocytosis, la eliminación fagocítica de células apoptóticas, es necesaria para mantener la homeostasis y es facilitada por receptores y vías de señalización que permiten el reconocimiento, la inmersión y la internalización de células apoptóticas. Adjunto, presentamos un protocolo de microscopía de fluorescencia para la cuantificación de efferocytosis y la actividad de vías de señalización de efferocytic.

Cuantificación de Efferocytosis por microscopía de fluorescencia unicelular

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

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