Name: quantification of efferocytosis by single-cell fluorescence microscopy
Uploaded: 2018-08-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Denna studie har finansierats av Canadian Institutes of Health Research (CIHR) löpande Grant MOP-123419, naturvetenskap och Engineering Research rådet av Kanada upptäckt Grant 418194, och en Ontario ministeriet för forskning och Innovation tidigt Research Award till BH. DGW bidragit bilder fram, för optimering av protokollen och författande av manuskript; Han har finansierats av en pump-priming bidrag från universitetet i Liverpool. CY finansieras av en Vanier Graduate stipendium och CIHR MD/PhD UNIVERSITETSSTIPENDIUM. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut om att offentliggöra eller beredning av manuskriptet.

Insamling av blod från friska frivilliga godkändes av etikprövningsnämnd Health Science forskning på University of Western Ontario. Venpunktion utfördes i enlighet med riktlinjerna i Tri-rådets politiska uttalande om mänsklig forskning.
1. kultur och förberedelse av raden THP-1 monocyt Cell
<ol><li>Kultur THP-1 monocyter som en suspension kultur i T25 kolvar vid 37 ° C + 5% CO2. Cellerna bör odlas i 5 mL Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) + 10% fetalt bovi...

De metoder som anges i detta protokoll aktiverar imaging och kvantifiering av processen dynamisk efferocytic med metoder som både fast-cell och live-cell. Dessa metoder erbjuder flera fördelar över vanligt sysselsatta flöde flödescytometri-baserade metoder23,24. Användningen av inifrån-ut färgning med fasta prover ger en mer robust och exakt kvantifiering av hastigheten och omfattningen av efferocytosis — faktiskt många flöde flödescytometri-baserade...

Apoptos är, programmerad celldöd, en starkt reglerade fysiologisk process som förekommer i de flesta flercelliga organismer och är avgörande för deras utveckling och homeostas1. Förutom att vara involverad i normala cellförnyelse och embryoutveckling, apoptos möjliggör eliminering av infekterade eller skadade celler från vävnader och kan utlösas som svar på infektion, inflammation, cancer, och också av medicinska åtgärder till exempel strålbehandling eller steroider1. Apoptotiska celler exponerar ”äta-mig” signaler på sin cellyta som erkänns av receptorer på en rad professionella och icke-professionella fagocyter, kollektivt refereras till som ”efferocytes”. Engagemang av dessa receptorer inducerar de upptag och nedbrytning av apoptotiska cellen genom efferocyte genom en process som kallas efferocytosis2,3. Fosfatidylserin är bäst kännetecknas äta-mig signalerar drivande efferocytosis. Det är normalt begränsad till de inre bipacksedeln av plasmamembranet, med apoptos aktivera en lipid-scramblase som stör denna membran asymmetri, därmed utsätta fosfatidylserin på cell surface4. Fosfatidylserin finns på extracellulära ytan av vissa icke-apoptotiska celler, såsom mogen makrofager och aktiverade trombocyter. Dessa celler är dock inte efferocytosed på grund av ”inte Ät mig” signaler, såsom CD47, för på deras cell surface5,6,7. Exponerade fosfatidylserin är erkänd av en array av efferocytic receptorer uttrycks av efferocytes. Bindning av dessa receptorer att fosfatidylserin, aktiverar antingen direkt eller genom hjälp av opsonins, signalvägar som främjar omvälvning av den apoptotiska cellen till en membran-bundna vakuol kallas den efferosome8, 9 , 10 , 11 , 12. efferosome säkringar sekventiellt med endosomes och lysosomer, som levererar den molekylära maskinen som nödvändigt att syrsätt efferosome och försämra apoptotiska cell Last13,14. När förstörd, apoptotiska cell-derived material smugglas till den återvinning endosome – en process som begränsar immunsvar mot apoptotiska cell-derived antigener, och som kan möjliggöra återvinning av näringsämnen från den apoptotiska celler13, 15. Ett misslyckande i efferocytosis resulterar i nedsatt clearance av apoptotiska celler; dessa ej godkänd celler genomgår så småningom sekundära nekros. Nekrotiska celler släppa pro-inflammatoriska cytosoliska innehållet, patogener och autoantigener i den extracellulära miljön, vilket driver en rad infektiös, inflammatoriska och autoimmuna sjukdomar16,17. Tillsammans, apoptos och efferocytosis underlätta avlägsnande av döende och döda celler och möjliggör upprätthållandet av vävnad homeostas.
Undersöka de molekylära mekanismerna bakom efferocytosis kräver metoder som ger en tydlig kvantifiering av apoptotiska celler upptag. Denna kvantifiering kompliceras av det faktum att till skillnad från andra upptag mekanismer såsom endocytos och fagocytos18,19, efferocytosis inte kan leda omvälvning av intakt målcellen, vilket resulterar i det planlösa upptaget apoptotiska cellen av de efferocyte20. Protokollet beskrivs häri beskriver en in vitro- efferocytosis analysmetod som ger korrekt avgränsning av de internaliserade kontra icke-internaliserat delar av enskilda apoptotiska celler och kan kombineras med en mängd fast-cell och Live-cell mikroskopi metoder. Traditionella fagocytos analyser lägga till antikroppar som är specifika för fagocytos målet i slutet av experimentet för att märka icke-internaliserat mål, där som vår metod skiljer sig genom märkning apoptotiska målet med kovalent-länkade biotin21 , 22. medan apoptotiska celler specifika antikroppar kan användas i denna analys, metoden med biotinylation möjliggör alla protein-bärande mål att vara märkta och undviker eventuella problem med sekundär antikropp korsreaktivitet om immunfärgning utförs . Specifikt, redogöra vi för beredning av apoptotiska Jurkat celler som har dual-fläckade både en cell tracking färgämne och biotin. Cellen spårning dye tillåter att apoptotiska cell-derived material kan vara spåras under efferocytosis, medan ytan biotinylation tillåter diskriminering av internaliserat från icke-internaliserat delar av efferocytosed apoptotiska celler. Vi beskriver också kultur och beredning av J774.2 och THP-1 cellinjer användas som murina och mänskliga efferocytes, monocyt-derived M2 makrofager som ett exempel på primär cell efferocytosis, och Jurkat celler för användning som efferocytic mål. Dessa metoder kan enkelt appliceras till andra cellinjer och primära celler, målceller som genomgår någon form av celldöd (e.g. apoptos, nekros och necroptosis) och micron stora härmar som simulerar apoptotiska celler genom lipid beläggningar eller beläggning med ligander specifikt för en efferocytic receptor av intresse.
Den metod som anges i detta protokoll har flera fördelar jämfört med de flöde flödescytometri baserade metoder som vanligen används i fält23,24. Genom direkt imaging fagocytsystemet-apoptotiska celler interaktionen, kombinerat med tydlig märkning av både totalt och icke-internaliserat apoptotiska cell material, kan kvantitativa åtgärder av efferocytosis göras. Dessutom begränsar användningen av pH-okänsliga fluorophores störfaktorer såsom förtryck av FITC och god Jordbrukarsed fluorescens vid lysosomal pH som förvirrar några alternativa metoder25. Slutligen, medan inte beskrivas i detalj, dessa metoder kan vara anställda använder efferocytes uttrycker fluorescently-märkt transgener, eller med efter fixering immunfärgning, att möjliggöra kvantifiering av signalering molekyl verksamhet och övervakning av den cellulära processer under efferocytosis.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Media</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>3500-000-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Media</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>080-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm circular glass coverslips #1.5 thickness</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72290-08</td>
			<td>Size and shape of coverslip is not critical, but 18 mm fit into the wells of a standard 12-well plate which simplifies cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>81590</td>
			<td>Dissolve in DMSO at 1 mM (1,000x stock solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V-Alexa 488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R37174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link NHS-Biotin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20217</td>
			<td>Store in a dessicator. Do not prepare a stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace FarRed</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C34572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace Orange</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-Streptavadin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SA1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lympholyte-poly cell sepration medium</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>CL5071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-4</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J774.2 Macrophage Cell Line</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85011428-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 Human Monocyte Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jurkat T Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of efferocytosis by single-cell fluorescence microscopy

Studera regleringen av efferocytosis kräver metoder som har möjlighet att exakt kvantifiera upptaget av apoptotiska celler och sond signalering och cellulära processer som styr efferocytosis. Denna kvantifiering kan vara svårt att utföra eftersom apoptotiska celler är ofta efferocytosed bit för bit, vilket kräver metoder som exakt kan avgränsa mellan den efferocytosed delen av ett apoptotiska mål kontra resterande unengulfed cellular fragment. Det synsätt som beskrivs häri använder tredjeparts dual-märkning angreppssätt för att exakt kvantifiera dynamiken i efferocytosis och efferocytic kapacitet efferocytes såsom makrofager. Cytosolen i apoptotiska cellen är märkt med ett cell-tracking färgämne till möjliggöra övervakning av alla apoptotiska cell-derived material, medan ytan biotinylation av cellen apoptotiska möjliggör differentiering mellan internaliserade och icke-internaliserat apoptotiska celler fraktioner. Efferocytic kapacitet efferocytes bestäms genom att ta fluorescerande bilder av levande eller fasta celler och kvantifiera mängden bundna kontra internaliserade mål, som differentieras efter streptividin färgning. Denna metod erbjuder flera fördelar jämfört med metoder såsom flödescytometri, nämligen den korrekt avgränsningen av icke-efferocytosed kontra efferocytosed apoptotiska celler fraktioner, förmågan att mäta efferocytic dynamics av live-cell mikroskopi, och den kapacitet att utföra studier på cellulär signalering i celler som uttrycker fluorescently-märkt transgener. Kombinerat, ligga de metoder som anges i detta protokoll till grund för en flexibel experimentella tillvägagångssätt som kan användas för att exakt kvantifiera efferocytic aktivitet och förhöra cellulära signalvägar som är aktiva under efferocytosis.

Övernattning kultur av Jurkat celler med 1 µM staurosporine resultat i apoptos av > 95% av celler, som kan bekräftas med Annexin V färgning (figur 1). Andra celltyper kan användas för dessa experiment, men koncentrationen av staurosporine och staurosporine behandlingstiden kommer att behöva optimeras för varje cellinje. För tillförlitlig detektering och kvantifiering av efferocytosis, > 80% av celler bör vara apoptotiska innan du lägger till dem t...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Efferocytosis, att fagocytos av apoptotiska celler, krävs för att upprätthålla homeostas och underlättas av receptorer och signalvägar som tillåter erkännandet, omvälvning och internalisering av apoptotiska celler. Häri, presenterar vi ett fluorescence mikroskopi protokoll för kvantifiering av efferocytosis och aktiviteten av efferocytic signalvägar.

Kvantifiering av Efferocytosis av Single-cell fluorescensmikroskopi

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Mikrovågsassisterad snabb diagnos av växtsjukdomar virus genom transmissionselektronmikroskopi

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Encelliga Analys av Bacillus subtilis Biofilmer Använda fluorescensmikroskopi och flödescytometri

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Visualisering av bakterietoxin Inducerade svar Använda Live Mikroskopi Cell Fluorescens

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Single Cell Mätningar av vakuolär Ruptur Orsakas av intracellulära patogener

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Fluorescensmikroskopi Metoder för att fastställa livskraft bakterier i föreningen med däggdjursceller

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Bedöma Antifungal aktivitet av isolerat alveolära makrofager av konfokalmikroskopi

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Kvantifiering av cytosoliska vs. vakuolär<em&gt; Salmonella</em&gt; I primära makrofager genom Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Mätning Phagosome pH genom Propportionell fluorescensmikroskopi

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

En enkel fluorescensanalys för kvantifiering av Canine neutrofila Extracellulär Trap Release

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...