Name: live-cell imaging assays to study glioblastoma brain tumor stem cell migration and invasion
Uploaded: 2018-08-29T13:30:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion at JoVE.com

המחברים תודה [שחקן מפורסם משחק] Orsolya Cseh לתמיכה טכנית שלהם. פרויקט זה נתמך בחלקה על ידי מענקים מקרן קנדה עבור חדשנות (כדי Luchman ד ר שלום פליסר הרברט סמואל וייס), רשתות תאי גזע של קנדה (גם ל ה ד ר שלום פליסר Luchman ו סמואל וייס).

1. תאי גזע המוח גידול culturing בעבר נגזר דגימות גליובלסטומה אנושי
הערה: תרבויות BTSC הוקמו בעבר בין האדם GBM דגימות החולה6,7,8,9,10.
<ol><li>הפשרת בקבוקון של BTSCs cryogenically משומר בתוך המכיל 70% אתנול, ממוקמים בתוך אמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס, רק עד האחרון של הקרח יש הקרת. לדלל התאים המופשרים 10 מ"ל של התקשורת צינור חרוטי 15 מ"ל, centrifuge את התאים ב 150 יחסי כוח צנטריפוגלי (RCF) במשך 7 דקות. הערה: בכל רחבי פרוטוקולים אלה, התקשורת מלאה מתייחס סטנדרטיים מדיה נהגה תרבות BTSCs (שתואר קודם לכן על ידי קלי. et al.) 6, בדרך כלל עם גורמי גדילה הנוכחי. מדיה ללא גורמי גדילה מתייחס התקשורת הבסיס עם כל הרכיבים, אך ללא כל גורמי גדילה בתוספת.</li>
	<li>תשאף התקשורת resuspend התאים 8 מ של מדיה להשלים, להעביר את התאים ואת התקשורת בקבוקון T25.</li>
	<li>אחרי שבוע 1 של culturing בתנאים שאינם מחסידי, לנטר את הבקבוקון מדי יום, שמשלימה את התוכן עם 1-2 מ ל מדיה מלאה לפי הצורך, אם התקשורת מתחיל לרוקן או מתחיל להיות חומצי כמו שצוין על-ידי שינוי צבע כתום-צהוב. מעבר תאים כאשר neurospheres להגיע בקוטר של-250 μm, בדרך כלל בין 10-14 d (איור 1). הערה: זמן ההכפלה של תרבויות שונות BTSC משתנה באופן נרחב. Neurosphere גודל ניתן למדוד באמצעות מיקרומטר עינית.</li>
	<li>את המעבר BTSCs, לאסוף את המדיה ואת neurospheres על ידי pipetting התקשורת את פני השטח של הבקבוק על מנת לאסוף את כל neurospheres, להעביר אותם ל צינור חרוטי 15 מ"ל, centrifuge את הצינור במשך 7 דקות ב 150 RCF. הערה: ניתן לבדוק מבחנות תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח כי כל neurospheres שנאסף. ושטוף נוספים עם 5 מ של פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) או מדיה שניתן לבצע כדי לאסוף את כל neurospheres שנותרו לפי הצורך.</li>
	<li>לנתק את neurospheres BTSC לתוך תאים בודדים, תשאף התקשורת להוסיף 1 מ"ל של פתרון ניתוק התא מראש ומחוממת, דגירה כי ב 37 מעלות צלזיוס במשך 7 דקות Triturate BTSC ההשעיה x 40 עם P1, 000 micropipette שוכן בגובה 800 μL. הערה: תאים יכולים להיות מודגרות כבר ב 37 ° C אם neurospheres לא לבטל.</li>
	<li>הוסף 5 מ של PBS (עם האנטיביוטיקה פניצילין, סטרפטומיצין) BTSCs dissociated, centrifuge את התאים ב 150 RCF במשך 7 דקות.</li>
	<li>וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend את BTSCs ב 1-4 מ"ל של התקשורת מלאה, בהתאם לגודל בגדר התא. הערה: התליה תא צריך לדלל עוד יותר אם הריכוז הוא מעבר למגבלת איתור מדויק עבור ספירה מדויקת התא.</li>
	<li>באמצעות צבע שתואמות תאים מתים, כגון trypan blue, לספור את מספר התאים קיימא, זרע את BTSCs לתוך הבקבוק או צלחת של עניין – בדרך כלל, 200,000-300,000 בתאים 8 מ של התקשורת מלאה בקבוקון T25.</li>
</ol>2. המוח גידול תאי גזע ההעברה Assay
<ol><li>תאי זרע 200,000 בבקבוקון T25 ב 8 מ של מדיה מלאה 1-2 שבועות לפני המתכננים ביצוע וזמינותו של ההעברה. הערה: הזמן בין ציפוי ביצוע וזמינותו משתנה בהתאם קצב הצמיחה של התרבות BTSC בשימוש.<ol>
<li>כדי לבדוק את ההשפעה של טיפול תרופתי על הגירה, pretreat את התאים עם הרכב המתאים, כגון דימתיל סולפוקסיד סמים עניין על-ידי הוספת ישים כרכים של המניה הרכב או סמים ישירות לתוך בארות נפרדים של מדיה המכילות את התאים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכן את הצלחת ההעברה כימוטקסיס (איור 2 א) על ידי ציפוי אותה עם שכבה דקה של קולגן.<ol>
<li>לחשב את מספר בארות של צלחת כימוטקסיס 96-ובכן, זה יצטרך להיות מצופה קולגן. כוללים לפחות משלוש בארות שכפל עבור כל תנאי.</li>
		<li>שתדללו 5 מ"ג/מ"ל של מניות של סוג אני קולגן ל 0.2 מ"ג/מ"ל חומצה אצטית טהור מדולל 0.14% במים כיתה תרבות.</li>
		<li>פיפטה 0.2 מ"ג/מ"ל של קולגן הבארות הוספה ממברנה והן הבארות מאגר התחתון נמצאים בשימוש. הערה: המאגרים התחתון של הצלחת לדרוש 225 µL, הבארות הוספה ממברנה דורשת µL 75 של קולגן לציפוי נאותה.</li>
		<li>המקום לצלחת ההעברה בתוך אינקובטור ב 37 ° C עבור ה 1 וארוקן את הפתרון קולגן מן הבארות מבלי לשרוט את ציפוי קולגן.</li>
		<li>לשטוף את הבארות 2 x עם PBS x 1 סטרילי. אם הצלחת אינו בשימוש מיד, וארוקן את PBS ואחסן אותו ב 4 ° C עד 2 שבועות. לפני השימוש, לחמם את הצלחת ההעברה כימוטקסיס לטמפרטורת החדר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנת המאגר התחתון של צלחת ההעברה כימוטקסיס.<ol>
<li>פיפטה 225 µL של התקשורת (ללא גורמי גדילה), בתוספת 10% FBS כמו chemoattractant, כדי הבארות מאגר התחתון של הלוח ההעברה כימוטקסיס.</li>
		<li>הנח בעדינות את תותב ממברנה לתוך המאגר התחתונה בזווית כדי להימנע מיצירת בועות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>צלחת התאים לתוך הקרום הכנס של צלחת ההעברה כימוטקסיס.<ol>
<li>Resuspend הפומבית BTSCs בתקשורת (ללא גורמי גדילה)-תא צפיפות של תאים למ"ל 50,000. להוסיף תרופות לכלי התקשורת אם הערכת ההעברה במהלך טיפולים תרופות שונות. לחלופין, זרע מספר שווה של תאים שטופלו מראש ותאים הבקרה, תוך שמירה על ריכוז התרופה הסופי כאשר ציפוי.</li>
		<li>צלחת µL 50 של BTSCs מהשלב 2.4.1 לבאר כל צלחת ההעברה תחת התנאים הטיפול הרצוי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תמונת ההעברה כימוטקסיס.<ol>
<li>להציב את הצלחת ההעברה כימוטקסיס לתוך מערכת הדמיה לחיות תאים ולהגדיר התוכנה הדמיה אוטומטית כדי לרכוש תמונות מיקרוסקופיות של הצלחת כל ה 1-2 עבור עד 72 ה' באמצעות תוכנה מסחרית (ראו טבלה של חומרים), לחץ לחיצה ימנית על ציר הזמן, להגדיר מרווח הזמן סריקה כדי כל שעתיים במשך 24 שעות ביממה. הערה: מרווח הזמן ואת הזמן שחלף הכולל משתנים בין תרבויות BTSC להשתמש; להתחיל עם מרווחי 2 h 72 h עד צברה ניסיון עם תרבויות BTSC בודדים. אם מערכת הדמיה אוטומטית אינה זמינה, ואז תמונות של שדה הראייה אותו ניתן לרכוש באופן ידני עם מיקרוסקופ, מצלמה מחובר תוכנת הדמיה.</li>
		<li>לאחר רכישת התמונה יושלם, להשיג את התמונות עבור הניסוי כולו ואת ליצור הגדרה עיבוד באמצעות תוכנה ניתוח זו מבדיל בין תאים מן הרקע של הקרום ונקבוביות ההעברה (איור 2B, מסיכת אדום) . באמצעות תוכנה מסחרית (ראה טבלה של חומרים), בחר הגדרה חדשה לעיבוד ולהגדיר את ההגדרות ההגדרה עיבוד עבור BTSCs זרע הסף 52, לגדול הסף של 85, התאמות גודל (פיקסלים) מאת-1, האזור המזערי של 200 μm2. להחיל הגדרה זו עיבוד על הצד התחתון של הקרום. שנה ניתוח זה אם זה לא מדויק להבדיל תאים לבין קרום רקע.</li>
		<li>איסוף נתונים כמו תא שטח בצד התחתון של הקרום עבור כל הבארות שכפל שלוש, אשר נחשב רק התאים הועבר דרך הנקבוביות. גרף את ההעברה של התאים μm2 (אזור של תאים הועבר) לאורך זמן (איור 2 C, איור 3). הערה: ודא כי המספר היחסי של תאים מצופה, סמכו על המשטח העליון של הקרום בנקודת-בפעם הראשונה דומים (פחות מ- 20% וריאציה על פני כל בארות) בין כל תנאי הטיפול כדי למנוע תופעות של ציפוי לא אחיד. אוסף נתונים באמצעות שהתוכנה המסחרי (ראה טבלה של חומרים) יכולה להתבצע על ידי שיגור ההגדרה עיבוד שנוצר בשלב 2.5.2, לחיצה על מדדים, ולאחר מכן על גרף/ייצוא, ולאחר מכן על ייצוא נתונים .</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. המוח גידול תאי גזע Neurosphere Assay הפלישה
<ol><li>תאי זרע 200,000 8 מ של התקשורת מלאה בקבוקון T25 1-2 שבועות לפני המתכננים ביצוע וזמינותו של פלישה. הערה: התזמון של ציפוי ביצוע וזמינותו תיקבע על קצב התפשטות של התרבות BTSC בשימוש.<ol>
<li>עבור תאים מיוחדים, להוסיף את המתחם של עניין הבקבוק בהישג הריכוז הרצויה עבור הקורס זמן מוגדרים מראש לפני neurospheres מוכנים להיות מצופה לפלישה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>המתן עד גודל neurosphere הממוצע הוא כ 150-200 μm; בדרך כלל, זה לוקח 7-14 d, בהתאם לתרבות BTSC בשימוש. הערה: זה אופייני לצפות בהתפלגות של מידות כדור. הבקבוק.</li>
	<li>עצה, בעדינות לערבב את הבקבוק עם פיפטה ולעבור 500 μL של neurospheres BTSC צינור חרוטי 1.5 mL עבור כל תנאי הטיפול; זה ישמש כדי צלחת משלוש בארות שכפל. הערה: השלבים 3.3.1 - 3.3.2 הם אופציונלי אך מומלץ לניסוי הפלישה הראשונה על תרבות BTSC חדשה.<ol>
<li>כדי לקבוע את הצפיפות של neurospheres זה יגיע בתוך הבאר, הכן צינור 1.5 mL כמו שלב 3.3. בעדינות לערבב את neurospheres העבר 100 μL לתוך צלחת 96-ובכן נפרד ומאפשרים את neurospheres להתפשר על ידי הכבידה על 5 דקות.</li>
		<li>בדוק מספר neurospheres מתחת למיקרוסקופ כדי להבטיח neurospheres מרובים הם באזור של הבאר ידומה ללא סיבות. הערה: neurospheres הפולשים לדרוש מספיק מקום לשלש בקוטר מבלי לקיים אינטראקציה עם השכנה neurospheres. ניתן להתאים את מספר neurospheres לכל טוב על-ידי ספירת מספר neurospheres לכל טוב והוספת neurospheres יותר או פחות מן הבקבוק T25 אל הצינור חרוט 1.5 mL בשלב 3.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>במקום הצינור חרוט 1.5 mL עם תאי מהשלב 3.3 על הקרח ולבצע צעדים 3.5-3.7 על קרח.</li>
	<li>תן את neurospheres להתפשר על ידי הכבידה לתחתית הצינור חרוט 1.5 mL על 5 דקות, prechill צלחת 96-ובכן שכותרתו על קרח.</li>
	<li>Resuspend את neurospheres של החלבון מטריצה חוץ-תאית.<ol>
<li>הכנת 500 μL של 0.4 מ"ג/מ"ל מסוג קולגן פתרון על קרח עבור כל תנאי הטיפול: להוסיף μL 459 של מדיה (ללא גורמי גדילה) μL 40 של הפתרון מניות של קולגן 5 מ"ג/מ"ל, μL 0.92 של 1N סטרילי NaOH (טבלה 1). הערה: 500 μL של הפתרון קולגן נדרש לכל תנאי הטיפול: μL 100 לכל אחת הבארות שכפל 3 וμl 200 של עודף. טיפולים תרופות צריך להתווסף כאן הריכוז הסופי הרצוי, להחסירו רכיב המדיה של הפתרון. פרוטוקול זה מתאר את השימוש מסוג קולגן כמו החלבון מטריצה חוץ-תאית; עם זאת, ניתן לבדוק כל חלבון מטריצה חוץ-תאית. בנוסף, עבור BTSC תרבויות שיש המחירים איטית יותר של הפלישה, גורמי גדילה או FBS ניתן להשלים בתקשורת כדי להגביר את הקצב של פלישה.</li>
		<li>לאחר neurospheres מ שלב 3.5 התיישבו, תשאף באותה מידה של התקשורת ככל האפשר מבלי לאבד בגדר neurosphere זה יש התיישבו בחלק התחתון. Resuspend בעדינות את neurospheres ב μL 500 של הפתרון קולגן מוכן בשלב 3.6.1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להוסיף 100 μL של קולגן, neurosphere התערובת משלוש בארות שכפל של צלחת 96-ובכן על קרח. אפשר את neurospheres להתפשר על קרח על 5 דקות.</li>
	<li>להעביר את הצלחת 96-ובכן חממה 37 º C למשך 5 דקות לאפשר קולגן הפילמור.</li>
	<li>מיד היכונו תמונה את הצלחת 96-ובכן.<ol>
<li>מקם את הצלחת 96-ובכן במגש של מערכת הדמיה לחיות תאים או על הבמה של מיקרוסקופ כדי לקבל תמונה כנקודת התייחסות לגודל neurosphere בזמנו של ציפוי, לפני תחילת הפלישה.</li>
		<li>לרכוש תמונות כל שעה. עד שיעור של הפלישה ךתומדק; בדרך כלל, הדבר מתרחש בתוך 24 שעות. הערה: מרווח הזמן הדמיה ניתן לשנות בהתאם הציוד בשימוש. הזמן שחלף הדמיה, מרווח וסיכום גם יכול להיות שונה עבור תרבויות BTSC שיש להם תעריפים שונים של פלישה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לקבוע הגדלת שטח הפנים של BTSCs כפי שהם פולשים המטריקס לאורך זמן. הערה: פני השטח של תאים בזמנו של ציפוי, מחושבת הממוצע של שלוש בארות שכפל, צריך להיות דומה (פחות מ- 20% וריאציה על פני כל בארות) בין התנאים טיפול שונים על מנת להבטיח ההבדלים הפלישה BTSC אינם בחום מושפע מספר או לגודל neurospheres מצופה.<ol>
<li>עבור מערכת ניתוח לחיות תאים, השתמש מטרה X 10 לרכישת תמונות ולרכוש 4 תמונות עבור טוב עבור שלושת לשכפל בארות. כדי לקבוע את יחסיות לתאים פני השטח, שמיוצגות המפגש אחוז של הבאר, להגדיר הגדרה עיבוד מדגיש במיוחד את התאים ברקע של הבאר. באמצעות תוכנה מסחרית (ראה טבלה של חומרים), בחר הגדרה חדשה לעיבוד ולהגדיר את ההתאמה פילוח 0.8, השטח המינימלי 300 μm2ולאחר האקסצנטריות מירבי 0.99. שנה ניתוח זה, אם זה אינו מדויק מבחין תאים מהרקע. הערה: אם בשיטות אחרות לפלישה neurosphere התמונה לאורך זמן, מומלץ לקבל מבט שדות מרובים עבור שלושת לשכפל בארות לאורך זמן. עם זאת, לא הדמיה מדויקת באותו שדה הראייה בכל פרק זמן יגדל השגיאה הסטנדרטית של הנתונים שנאספו. תוכנת מחשב יכול לשמש כדי לעזור למדוד את שטח הפנים של התאים פולשים לכל תמונה.</li>
		<li>איסוף נתונים כמו cell סך הכל השטח (יחסית או מוחלטת) במשך כל כל הזמן-פוינט וקבע הממוצע של הבארות שכפל שלוש. גרף את הפלישה BTSCs ידי האזור תא הולך וגדל עם הזמן. הערה: איסוף נתונים באמצעות תוכנה מסחרית (ראו טבלה של חומרים) יכולה להתבצע על ידי שיגור ההגדרה עיבוד שנוצר בשלב 3.10.1, לחיצה על מדדים, ואז על גרף/ייצוא, ולאחר מכן על נתונים לייצא .</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma.">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).</li><li>Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+multiforme:+the+terminator.">Glioblastoma multiforme: the terminator.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6242-6244 (2000).</li><li>Heddleston, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cell+maintenance:+the+role+of+the+microenvironment.">Glioma stem cell maintenance: the role of the microenvironment.</a> Current Pharmaceutical Design. 17 (23), 2386-2401 (2011).</li><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).</li><li>Galli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Tumorigenic,+Stem-like+Neural+Precursors+from+Human+Glioblastoma.">Isolation and Characterization of Tumorigenic, Stem-like Neural Precursors from Human Glioblastoma.</a> Cancer Research. 64 (19), 1-12 (2004).</li><li>Kelly, J. J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+of+Human+Glioblastoma+Stem+Cells+Occurs+Independently+of+Exogenous+Mitogens.">Proliferation of Human Glioblastoma Stem Cells Occurs Independently of Exogenous Mitogens.</a> STEM CELLS. 27 (8), 1722-1733 (2009).</li><li>Cusulin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precursor+States+of+Brain+Tumor+Initiating+Cell+Lines+Are+Predictive+of+Survival+in+Xenografts+and+Associated+with+Glioblastoma+Subtypes.">Precursor States of Brain Tumor Initiating Cell Lines Are Predictive of Survival in Xenografts and Associated with Glioblastoma Subtypes.</a> Stem Cell Reports. 5 (1), 1-9 (2015).</li><li>Luchman, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+mTORC1/2+Blockade+Inhibits+Glioblastoma+Brain+Tumor+Initiating+Cells+In+Vitro+and+In+Vivo+and+Synergizes+with+Temozolomide+to+Increase+Orthotopic+Xenograft+Survival.">Dual mTORC1/2 Blockade Inhibits Glioblastoma Brain Tumor Initiating Cells In Vitro and In Vivo and Synergizes with Temozolomide to Increase Orthotopic Xenograft Survival.</a> Clinical Cancer Research. 20 (22), 5756-5767 (2014).</li><li>Jensen, K. V., Cseh, O., Aman, A., Weiss, S., Luchman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK2/STAT3+inhibitor+pacritinib+effectively+inhibits+patient-derived+GBM+brain+tumor+initiating+cells+in+vitro+and+when+used+in+combination+with+temozolomide+increases+survival+in+an+orthotopic+xenograft+model.">The JAK2/STAT3 inhibitor pacritinib effectively inhibits patient-derived GBM brain tumor initiating cells in vitro and when used in combination with temozolomide increases survival in an orthotopic xenograft model.</a> PLoS ONE. 12 (12), e0189670 (2017).</li><li>Nguyen, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+MSH6+Mutations+in+Treatment-Naive+Glioblastoma+and+Anaplastic+Oligodendroglioma+Contribute+to+Temozolomide+Resistance+Independently+of+MGMT+Promoter+Methylation.">Novel MSH6 Mutations in Treatment-Naive Glioblastoma and Anaplastic Oligodendroglioma Contribute to Temozolomide Resistance Independently of MGMT Promoter Methylation.</a> Clinical Cancer Research. 20 (18), 4894-4903 (2014).</li><li>Hemmati, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancerous+stem+cells+can+arise+from+pediatric+brain+tumors.">Cancerous stem cells can arise from pediatric brain tumors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (25), 15178-15183 (2003).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines.">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).</li><li>Menyh&#225;rt, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+selection+of+functional+assays+to+evaluate+the+hallmarks+of+cancer.">Guidelines for the selection of functional assays to evaluate the hallmarks of cancer.</a> BBA - Reviews on Cancer. 1866 (2), 300-319 (2016).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).</li><li>Albini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+in+Vitro+Assay+for+Quantitating+the+Invasive+Potential+of+Tumor+Cells.">A Rapid in Vitro Assay for Quantitating the Invasive Potential of Tumor Cells.</a> Cancer Research. 47 (12), 3239-3245 (1987).</li><li>Liang, C. -. C., Park, A. Y., Guan, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>Naber, H. P., Wiercinska, E., Ten Dijke, P., van Laar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+Assay+to+Measure+TGF-&#946;-induced+Invasion.">Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

נתון כי התאים הסרטניים הם מתרבים באופן פעיל, זה מציב אתגר טכני פוטנציאליים לחקר נדידת תאים. עבור ההעברה וזמינותו המתוארים כאן, BTSCs הם מצופים ללא גורמי גדילה, אשר מגביל את ההתפשטות, מעבר הצבע chemoattractant של צלחת כימוטקסיס לא מלא equilibrate מעל 72 שעות. בנוסף, כמו התאים להיות מנוטרים באמצעות הדמיה לחיות תאים לאורך זמן, התאים ניתן באופן חזותי לנטר כדי להבטיח נרחבת תאית אינה מתרחשת. על ההצלחה של ההעברה וזמינותו, חשוב לבטל את neurospheres לחלוטין כדי תאים בודדים ולספור במדויק את מספרי הטלפון הנייד לפני ציפוי. ציפוי הספירות או ציפוי תאים רבים מדי, אשר תוצאות clumping, באפשרותך למנוע תאים נודדים דרך הנקבוביות קטן (איור 4A , 4B). זה חשוב גם להימנע מיצירת בועות בעת ציפוי התאים בצלחת ההעברה כימוטקסיס או בעת הצבת את תותב קרום על גבי המאגר התחתון. בועות ניתן לשנות למישור המוקד ולמנוע כימות מדויק (איור 4C). הלוח כולו צריך להיות מצופה בשכבה דקה של קולגן כי זה נותן התאים משטח כדי לנווט על הנקבוביות בצלוחית, כמו assay הזה דורש תאים לדבוק ולאחר מכן לנדוד בין משטח ביולוגית רלוונטית לקראת chemoattractant.
פרוטוקול העברה BTSC המתוארים כאן מאפשר ההערכה קינטי של נדידת תאים בודדים, הדורשים פחות תאים עבור בדיקות תנאי טיפול שונה בהשוואה הפרוטוקולים הקיימים. זה חשוב אשר גדלים באיטיות, כפי שהוא יכול להיות קשה לאסוף מספר רב של תאים לניסויים. צפיפות נמוכה נקבובית של צלחת ההעברה כימוטקסיס מאפשר equilibration איטי יותר של המילוי ההדרגתי chemoattractant, גדול מ- 72 h, ביעילות רבה יותר מחקה את התהליך הביולוגי של הגירה chemotactic לאורך תקופה ארוכה יותר של זמן. הפרוטוקול היה מותאם שיש שכבה דקה מאוד של קולגן ציפוי בצלחת ההעברה כימוטקסיס כדי להבטיח את assay אמצעי ההעברה ואת לא הפלישה. זה מאפשר גם הדמיה, כימות של תאים בודדים כפי הם דבקים קולגן המטריצה ציפוי את תותב ממברנה. עם זאת, מגבלה אחת של הטכניקה היא כי כימות של ההעברה על-פני מספר בארות לאורך זמן היא מאוד פשוטה and מזורז באמצעות תוכנה מסחרית (ראו טבלה של חומרים). יתרון בולט של וזמינותו ההעברה כפי שמתואר כאן הוא הסתגלות רחב של הפרוטוקול סוגי תאים אחרים. זה יהיה שימושי במיוחד עבור לכימות, ההגירה chemotactic של שורות תאים שנמצאים גם איטי הגוברת, שקשה לדבוק, או להעביר לאט.
כדי להבטיח את ההצלחה של וזמינותו הפלישה BTSC, זה הכרחי לאסוף את neurospheres לפני שהם הופכים גדולים יותר 200 מיקרומטר. גדול יותר כדורים. יש מטוס ריכוז גדול מדי כדי התמונה ולכמת באופן עקבי (איור 5C). יתר על כן, neurospheres יכול להתחיל נדבקות וצבירת עם neurospheres אחרים. הדבר משפיע על רכישת נתונים מדויקים ועקביים. בנוסף, זה חיוני כי neurospheres מותר להתיישב בתחתית הבאר, בעוד הקולגן נמצא עדיין על קרח, כדי לאפשר את neurospheres לדימות במטוס יחיד של המוקד (איור 5D). בדומה לכך, חשוב לאפשר הקולגן להגדיר באופן מלא מבלי להזיז את הצלחת כמו זה יכול לשבש את היווצרות מטריקס אפילו, אשר עלול להשפיע לרעה על איכות התמונה (איור 5D). הפלישה BTSC assay המתוארים כאן, אחד היתרונות העיקריים היא כי BTSCs תרבותי כמו neurospheres יכול להיות מוערך לפלישה ישירות, ללא צורך גדל adherently. יתר על כן, ניתן להטביע BTSC neurospheres כל מטריצה חוץ-תאית, או באמצעות רכיבים בודדים של מטריצות של רקמה ספציפית או בעזרת תערובת קרום המרתף זמינים מסחרית. ציון של מטריצה חוץ-תאית יכול לעזור לזהות או בדיקה למנגנונים הספציפיים של פלישה. לדוגמה, עם פרוטוקול זה, אפשרי להעריך את ההשפעה של פילוח בודדים מבני משפחת metallopeptidase מטריצה של גנים, אשר ידועים לבזות רכיבים ספציפיים מטריקס. לחלופין, פרוטוקול זה אמנם ספיציפית BTSC neurospheres, כל תא גדל כמו כדורים יכול לשמש באופן דומה. דוגמאות כוללות תאים סרטניים בשד תרבותי כמו mammospheres או סרטן המעי הגס ראשוני התאים בתרבית כמו tumorspheres; עם זאת, זה מגביל את הטכניקה על סוגי תאים גדלים ככל התחומים בתרבות. יתרונות נוספים של מבחני ההעברה והן הפלישה הם כי הם קל להגדיר, הם עובדים בתבנית 96-ובכן, שהנתונים לכימות לאורך זמן.
בסך הכל, על מנת למנוע הישנות GBM שלאחר הטיפול, זה חיוני לפתח מתודולוגיות המאפשרים את החקירה BTSC הגירה ו הפלישה. פרוטוקול העברה המתוארים כאן יתרונות רבים על מבחני ההעברה שנקבעו קודם, במיוחד לצורך המחקר של GBM BTSCs. פרוטוקול העברה משופרים זה כרוך בריא BTSCs תרבותי בתנאים neurosphere, ציפוי תאים בודדים בצלחת ההעברה 96-ובכן מצופים קולגן כימוטקסיס. באמצעות מערכת הדמיה לחיות תאים, ההעברה של BTSCs יכול להיות במעקב, לכמת לאורך זמן. וזמינותו הפלישה המתוארים כאן מאפשר פיקוח על פלישות BTSC מן neurospheres לתוך מטריצה. Assay הזה כרוך הטבעה neurospheres לתוך מטריצה קולגן או עשירים בחלבון אחר מטריצה חוץ-תאית, בצלחת 96-ובכן. הדמיה של הצלחת עם מערכת הדמיה בצילום מואץ לחיות תאים מאפשרת הניתוח של פלישות BTSC בתנאים שונים הטיפול לאורך זמן. מבחני האלה, ומכאן, לספק כלי רב ערך מדענים מקווים להבין טוב יותר את המנגנונים BTSC ההעברה ואת הפלישה.

גליובלסטומה (GBM) היא צורה אגרסיבית ביותר של סרטן המוח, למרות הטיפול הנוכחי מעורבים כריתה כירורגית ולאחריו הקרנות, כימותרפיה, חציון ההישרדות של חולים הוא רק 15 חודשים1. GBM הוא פולשני, סמים עמידים מאוד, והמשיך בסופו של דבר, ממחלה חשוכת מרפא הדורשת מחקר לביולוגיה הגלום שלה כדי לזהות השדרות טיפוליים חדשניים. אחוזי התמותה הגבוהים של חולי GBM נגרמת בעיקר על ידי הפלישה הסלולר נרחב לתוך רקמת מוח נורמלי סמוכים, ההעברה לאורך כלי הדם, מה שמוביל הישנות של המחלה לאחר טיפול2,3 . יש כבר שיערו תת-קבוצה של תאים, כינה את המוח גידול תאי גזע (BTSCs), כי הם איטיים רפואית עמיד, וההליכה להוביל הישנות המחלה. GBM BTSCs להציג מאפיינים של התחדשות עצמית clonogenic, multipotency וייזום הגידול הפוטנציאלי4,5,6. BTSCs גם לשמור את הטרוגניות גנטית מולקולרית, פנוטיפי של הוריהם GBM גידולים7,8,9,10. תכונות אלו עושות את BTSCs מערכת מודל מאוד שימושי עבור חקר GBM, לחקור אסטרטגיות טיפוליות מקוריות. In vivo, אלה בתאי גזע דמוי מסוגלים של היווצרות הגידול, צמיחה, הפלישה כאשר השתילו לתוך מוחותיהם של חולדות neonatal11 , סוכרת שאינו שמנים/חמור בשילוב עכברים כשל חיסוני (הנהון/SCID)4. היכולת של BTSCs כדי ליצור שוב ושוב גידולים פולשניים ויוו אשר מסכם את הדברים המאפיינים הסלולר ואת היסטולוגית של גידולים המקורי שלהם חריפה תומך את תפקידם כמו תאי הגידול. מתחילה12.
רומן גישות טיפוליות שפותחו למטרה BTSCs ולעזור לשפר את התוצאה ארוכת הטווח של חולי GBM. כיום, שם הוא מוגבל להבין ההעברה ופלישה תהליכים תאיים הקשורים הישנות והתנגדות טיפולית. ההעברה ופלישה תופעות נפרדות; ההעברה היא התהליך המשמש כבסיס התנועה מכוונת של תאים והיא כוללת לארגונו מחדש של שלד התא, מולקולות אדהזיה, הרכבה/פירוק של מוקד נקודות מגע, בעוד הפלישה דורש גם ההרס הפיזי של מחסומים כגון מטריצה חוץ-תאית13. מתודולוגיה מוסכמת של הלומדים נדידת תאים, הפלישה היא ה14,assay בוידן קאמרית15. טכניקה זו, חדר זוגי מלא מדיה, עם התקשורת בתא התחתון בתוספת של chemoattractant. כימוטקסיס מופעלת באמצעות גורמי גדילה ספציפי או ציטוקינים או סרום שור בעובר כמו chemoattractant שאינם ספציפיים. בעקבות ה גרדיאנט chemoattractant, תאים נודדים דרך קרום נקבובי. על הקצה, התאים שהועברו יכול להיות דמיינו, לכמת על החלק התחתון של הקרום על ידי צביעת עם צבעי cytological או פלורסנט. בוידן assay ההעברה יכול להיות שונה כדי וזמינותו הפלישה על ידי ציפוי של נקבובי לסנן עם מטריצה חוץ-תאית רכיבים כגון סוג אני קולגן או מטריצה כמו קרום המרתף. תאים פולשנית לבזות את המטריקס, לעבור לחלק התחתון של המסנן נקבובי, ניתן לכמת באופן דומה כדי וזמינותו ההעברה. מבחני ההעברה נפוצים אחרים כוללים השריטה פצע, מבחני תא הדרה13. וזמינותו פצע שריטה מתבצע על ידי גירוד פער טפט הסלולר והתבוננות ההעברה של תאים מהקצה של הפצע על ידי הדמיה במרווחי זמן קבועים עד השריטה סגורה. ב תא הדרה וזמינותו, מכשול פיסי משמש ליצירת אזור ללא תא לפני זריעה של תאים. המכשול הוסר ברגע שהתאים confluent והוא ההעברה של התאים לאיזור נטול תאים עם תמונה באופן קבוע16.
אלה בעבר הקים מבחני משמשים לעתים קרובות ללמוד את ההעברה או פלישה של אוכלוסיות תאים חסיד ולא הומוגנית אך החסרונות ניכר פוזה כשלמדתי GBM BTSCs או אחרים אוכלוסיות תאים סרטן הטרוגנית. וזמינותו בוידן קאמרית ניתן להפיק רק הקצה של מדידות לעומת הערכה קינטי של תנועת התא. תצפית לאורך זמן היא של רלוונטיות גבוהה לשקילת BTSC ההעברה, בהתחשב בכך תאים מתרבויות שונות לעיתים קרובות להעביר בקצב שונה. ככזה, התנאים ואת העיתוי של וזמינותו חייב להיות מותאם עבור כל סוג תרבות ואינו דורש עבודה אינטנסיבית על הדגימה נאותה ועל כימות. הדרה שריטה ותא מבחני אינן ולסדרם לתרבויות BTSC כפי, גם כאשר BTSCs מתורבתים בתנאים חד שכבתי על צלחות מצופה laminin, הבחנו כי BTSCs להופיע להתנגד התנועה אל החלל הפתוח ומעדיף להישאר קרוב הקרבה לתאים אחרים. יתר על כן, אלה הקימה העברת מבחני אל תאפשר את הפריט החזותי וניטור של תאים בודדים במהלך ניסוי. ניטור של תאים בודדים לאורך זמן יקר, להערכה של הגירה באוכלוסיות הטרוגניות התא כגון BTSCs. חסרונות נוספים של בוידן קאמרית, שריטה, להדרה תא אזור מבחני עבור תרבויות BTSC הם כאלה הם דורשים יחסית מספרי הטלפון הנייד גבוהה, יכול להיות זמן רב כדי להגדיר, גם במהירות equilibrate או שאין מעבר צבע chemoattractant. ככזה, מבחני אלה אינן אידיאלי לשימוש עבור אוכלוסיות תאים נדיר או הגדלים לאט או והתרופות הקרנה. יתר על כן, מבחני אלה אינם מתאימים למדידת כוח-פלישה עיצוב תלת מימדי (3D), אשר חשוב במיוחד עבור BTSCs גדל בתנאים neurosphere.
כאן, אנו מתארים את מבחני שונה במיוחד כדי להפוך את התצפית כימות של ההעברה BTSCs נפרדים, ולכל הפלישה BTSCs GBM תרבותי כמו neurospheres. וזמינותו הראשון מתאר עיבוד של וזמינותו קאמרית בוידן באמצעות הדמיה בצילום מואץ לחיות תאים צלחת ההעברה כימוטקסיס כדי למדוד את ההעברה תא chemotactic13. הדמיה לחיות תאים בתבנית רב טוב מאפשר ויזואליזציה של כימות של נדידת תאים בתנאים טיפול מרובים. הבדיקה השנייה המתוארת כאן היא ספרואיד הפלישה assay13,17, אשר מודד מאפייני BTSCs פולשנית תרבותי בתנאים neurosphere ומוטבעים לתוך מטריצה חוץ-תאית 3D תחת טיפול שונים תנאים. באופן כללי, מבחני אלה תואמים הרבה יותר ממה שתואר לעיל מתודולוגיות לימוד המאפיינים נודדות ו פולשני של תרבויות BTSC הטרוגנית. הם גם מציעים הזדמנויות טובות יותר עבור החקירה של אסטרטגיות טיפוליות הרומן למטרה ההעברה והן פלישה, אשר תורמים באופן משמעותי הישנות המחלה, הקטלניות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rat Collagen I</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3440-100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH3247-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AX0073-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30730119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Nunc EasYFlask</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15ml conical tube</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte ClearView 96-Well Chemotaxis plate</td>
			<td>Essen Bioscience</td>
			<td>4582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System</td>
			<td>Essen Bioscience</td>
			<td>4545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis Software</td>
			<td>Essen Bioscience</td>
			<td>2016A Rev1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accumax cell detachment solution</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AM105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin, streptomycin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture grade water</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>17-724Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-cell imaging assays to study glioblastoma brain tumor stem cell migration and invasion

גליובלסטומה (GBM) הוא גידול אגרסיבי המוח שמופעל לקוי עם אפשרויות טיפול הזמינות כיום. תכונות עיקריות של GBMs כוללים התפשטות מהירה הפלישה מתפשט לתוך המוח נורמלי. מופע חוזר נחשב לנבוע בנוכחות של רדיו, כימותרפיה-עמידים המוח גידול תאי גזע (BTSCs) כי לפלוש מן המסה סרטני ראשוני, לפיכך, להתחמק כריתה כירורגית. לפיכך, טיפולים שכוונו BTSCs ויכולות פולשנית שלהם עשוי לשפר את פרוגנוזה אחרת של המחלה. הקבוצה שלנו ואחרים יש בהצלחה הוקמה, מאופיין BTSC תרבויות מדגימות החולה GBM. תרבויות אלה BTSC להפגין היסוד סרטן תאי גזע מאפיינים כגון בידול התחדשות עצמית, שושלת היוחסין מרובה clonogenic, או הגידול חניכה בעכברים חיסונית לקויה. על מנת לשפר הגישות הטיפוליות הנוכחי עבור GBM, הבנה טובה יותר של המנגנונים BTSC הגירה ו הפלישה הכרחי. ב- GBM, המחקר של הגירה, הפלישה הוא מוגבל, בין השאר, בגלל מגבלות קיימות טכניקות אשר לא במלואו בחשבון מאפייני צמיחה במבחנה של BTSCs גדל כמו neurospheres. כאן, אנו מתארים מהיר ולא כמותית לחיות תאים מבחני הדמיה ללמוד מאפייני ההעברה והן פלישה של BTSCs. השיטה הראשונה המתוארת היא וזמינותו ההעברה BTSC אשר מודד את ההעברה לכיוון מעבר צבע chemoattractant. השיטה השנייה המתוארת וזמינותו הפלישה BTSC אילו תמונות, מכמת פלישה הסלולר של neurospheres לתוך מטריצה. מבחני המתוארים כאן משמשים עבור כימות של הגירה BTSC ופלישה לאורך זמן ובתנאים טיפול שונה.

כאן, אנו מתארים דוגמאות של נתונים שניתן להשיג באמצעות מבחני הדמיה לחיות תאים ללמוד BTSC הגירה ו הפלישה. BTSCs הם מצופה כמו תאים בודדים, ניתן לגדל כמו לתרשים neurospheres (איור 1). אנו מראים כי BTSCs יכול להיות חלופה מועדפת, מצופה ב הבארות של הקדמי ממברנה בצלחת ההעברה כימוטקסיס זה מצופה בשכבה דקה של סוג אני קולגן (איור 2 א). BTSCs בודדים מופצים בצורה שווה על החלק העליון תותב ממברנה בתחילת וזמינותו. על פני תקופה של 24-72 h, תאים לדבוק הקרום לנוע לאורך פני השטח מצופים קולגן, להעביר דרך לאחד הנקבוביות קטן 96 בצד התחתון של הקרום, לכיוון chemoattractant בתוך המאגר. טוב. לאחר סימון התאים על קרום צהוב, את הנקבוביות בכחול, את התאים על החלק התחתון של הקרום באדום, התאים ניתן לראות הזנת בתוך הנקבובית על החלק העליון (צהוב תא מתקרב נקבובית כחול) והיוצאים הנקבובית בתחתית (יציאה תא אדום ing הנקבובית כחול) (איור 3). חשוב לציין, התאים ניתן שטופלו בסמים מצופה בצלחת ההעברה כימוטקסיס אותו כמו תאים שטופלו הרכב שליטה לחקור את ההשפעה של התערבויות טיפוליות על הגירה BTSC (איור 2B). הצלחת ההעברה כימוטקסיס מאפשר ההדמיה של תאים על החלק העליון, וגם בתחתית תותב ממברנה. לכן, כימות של נדידת תאים לאורך זמן אפשרי על ידי ספירת התאים נדדו אל הצד התחתון של הקרום (איור 2C).
מצאנו כי אם BTSCs לא הפומבית באופן מלא, התאים לא דרך הנקבוביות ואז להישאר קטן neurospheres (איור 4A). חשוב גם לא הצלחת יותר מ 2,500 BTSCs/טוב כמו התוצאה בתא clumping ולא בהגירה אל הצד התחתון של הקרום (איור 4B). לבסוף, זה חיוני כדי למנוע ביצוע בועות ממברנה להוסיף בארות בעת ציפוי תאים, כאשר הצבת הקרום הוספת המאגר התחתון, כמו זה מונע דימות מדויק, כמת (איור 4C).
בשלב הבא, אנו מראים כי הפלישה BTSC, מ neurospheres לתוך מאטריקס שמסביב, יכול להיות עם תמונה, לכמת לאורך זמן בתבנית 96-ובכן צלחת (איור 5A). הפלישה נמדד על ידי לכימות את פני השטח של התאים כפי שהם פולשים המטריקס לאורך זמן. באמצעות תוכנת ניתוח תמונה, עיבוד הגדרה הוחל כי שכבות מסיכה על גבי התא משטח האזור, אשר מאפשר כימות אוטומטית לאורך זמן (איור 5B). קטעי וידאו בצילום מואץ של פלישות BTSC ניתן גם ליצור, כדי להבחין בקלות את התהליך הכולל של פלישה BTSC (איור 6). בנוסף, ניתן להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי לתמונה BTSCs המבטאים חלבונים פלורסנט, כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) או חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP). . הנה, יצרנו וידאו בצילום מואץ של BTSCs המבטאות צורה cytosolic של ה-GFP כדי לסייע באיתור BTSCs בודדים כפי שהם פולשים כמו קרום המרתף מטריצה (איור 7). Assay הפלישה neurosphere הזה BTSC גם מאפשר טיפולים תרופות שיתווספו בבארות שכפל להעריך ישירות והשפעותיהם על הפלישה BTSC מן neurospheres לתוך מטריצה (איור 8A). כימות של neurospheres מרובים בבארות שכפל יכול להיות מחושב, בגרף לאורך זמן כדי להעריך את השפעת סמים בריכוזים מרובים (איור 8 ב').
כישלון לדבוק הפרוטוקול המתואר לעיל יכול להוביל לחוסר יכולת לקבל נתונים אמינה ומדויקת. הטבעה neurospheres BTSC גדולים מדי, עם קוטר גדול מ- 200 מיקרומטר, מוביל אל מטוס ריכוז גדול מדי כדי לכמת במדויק בכל התחומים בתצוגה של שדה (איור 8C). באופן דומה, כשל כדי לשמור על המטריצה ב 4 ° C בשעת הטמעת neurospheres את יכולה גם לגרום הספירות שאינם על אותו מישור המוקד ואת של מטריצה חוץ-תאית זה לא התחזק בצורה שווה, אשר מונע את האוסף של נתונים מדויקים (איור 8D ).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58152/58152fig1.jpg"> איור 1: Culturing BTSCs. לוחות אלה הם דוגמה מייצגת של BTSCs גדלו של תאים בודדים כדי neurospheres על פני תקופה 14-d בתרבות. Neurospheres המוצגת כאן ביום 14 הם בגודל המתאים עבור passaging. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58152/58152fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58152/58152fig2.jpg"> איור 2: הדמיה לחיות תאים של העברה BTSC. (א) זוהי דוגמה של צלחת ההעברה 96-ובכן כימוטקסיס מצופה בשכבה דקה של סוג אני קולגן לפני ביצוע וזמינותו הגירה עם BTSCs. התמונות להראות i) צלחת עם כל שלושת חלקי (המכסה, ממברנה insert ומאגר) מניחים יחד, ii) בכל שלושת החלקים מופרדים, iii) תמונה של צילום המקרוב של העליון התצוגה של קרום הקדמי, iv) תמונה של צילום המקרוב של התחתון התצוגה של קרום הקדמי ו- v) תמונה של צילום המקרוב של המאגר התחתון. (B) אלו להחליפן בתמונות של העברה BTSC בתחילת (0 h) של הניסוי ו- 24 שעות ביממה. המוקד תמונה הוא בראש תותב ממברנה שבו התאים במקור מצופים. תאים היגרו לתחתית הצלחת ההעברה כימוטקסיס מסומנים באדום. -הו, כמה תאים היגרו אל הצד התחתון של הקרום. לאחר 24 שעות ביממה, מספר התאים שהועברו גדל באופן דרמטי. ההשוואה של התמונות ב- 24 שעות ביממה עבור תאים שטופלו הרכב לעומת תרופה X מדגים כי הטיפול בסמים מקטין העברה BTSC. סולם ברים מייצגים 600 מיקרומטר. (ג) לוח זה מציג כימות של העברה BTSC בעקבות טיפול קדם עם הרכב או סמים X. הגרף מראה כי הטיפול בסמים יש השפעה חזקה על ההעברה של BTSCs. נקודות הנתונים הממוצע של שלוש בארות שכפל טכני, קווי השגיאה לייצג סטיית תקן (SD). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58152/58152fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58152/58152fig3.jpg"> אנימציה איור 3: BTSC ההעברה צילומי הווידאו. סרטון וידאו זה מראה את ההעברה של BTSCs באמצעות סוג הקולגן-תליתי כימוטקסיס ההעברה לצלחת. תאים בחלק העליון תותב ממברנה מודגשים בצהוב, תאים היגרו לתחתית תותב ממברנה מובלטים באדום, הנקבוביות ממברנה מסומנים בכחול. מישור המוקד מוגדרת התמונה תאים בצד התחתון של הקרום. הסרטון נוצר באמצעות תמונות בצילום מואץ לקחו כל שעה במשך 51 h, הידור 4 מסגרות לשנייה. סרגל קנה מידה מייצג 200 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58152/JOVE_Fig_3.mov" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58152/58152fig4.jpg"> איור 4: דוגמאות של שגיאות בקביעת assay ההעברה. (א) לוח זה מראה דוגמה BTSCs זה לא היו הפומבית במלואו לפני ציפוי תותב קרום העליון של צלחת ההעברה כימוטקסיס. בשל גודלו של הספירות גודל קטן של הנקבוביות ממברנה, התאים אינם יכולים להעביר למאגר המים התחתונה. (B) לוח זה מציג דוגמה assay ההעברה שבו תאים רבים מדי מצופים. הצליעה של התאים מפריע נדידת תאים, פוגע כמת. (ג) לוח זה מציג דוגמה של היווצרות בועה תותב ממברנה איפה מצופים BTSCs. בועות תוצאה באיכות התמונה המסכנה ולמנוע של כימות מדויק של ההעברה. פסי בקנה מידה מייצגים 600 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58152/58152fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58152/58152fig5.jpg"> איור 5: assay הפלישה neurosphere BTSC. לוחות אלה להראות דוגמה של BTSCs פולשים מן neurosphere לסוג 0.4 מ"ג/מ"ל אני מטריצת קולגן במשך 6 שעות. כאן, (א) שלב תמונות חדות בכל זמן-נקודה מוצגים (B) עם המסכה כמותיים נציג בשכבות, כפי שיתואר בפירוט פרוטוקול בשלב 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58152/58152fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58152/58152fig6.jpg"> איור 6: BTSC neurosphere הפלישה צילומי הווידאו ב מסוג קולגן. זה מראה וידאו הפלישה של BTSCs מ neurosphere לתוך 0.4 מ"ג/מ"ל מסוג קולגן מטריצה (מוצג גם תמונות סטילס ב איור 5A). התמונות נרכשו באמצעות מטרה X 10 בכל שעה במשך 12 שעות, נאספים 4 מסגרות לשנייה. סרגל קנה מידה מייצג 300 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58152/JOVE_Fig_6.mov" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58152/58152fig7.jpg"> איור 7: BTSC neurosphere הפלישה צילומי הווידאו במטריצה כמו קרום המרתף. סרטון וידאו זה מראה פלישה של BTSCs, הזה GFP אקספרס cytosolic, מ neurosphere לתוך מטריצה כמו קרום המרתף. התמונות נרכשו באמצעות מטרה X 4 כל 30 דקות במשך 48 שעות, הודרו 8 מסגרות לשנייה. סרגל קנה מידה מייצג 800 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58152/JOVE_Fig_7.mov" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58152/58152fig8.jpg"> איור 8: BTSC neurosphere assay הפלישה עם הטיפול. (א) BTSC neurospheres הוטבעו במטריצה כמו קרום המרתף שהוכנו עם הרכב או ריכוז המצוין של סם אקס תמונות נרכשו בכל שעה; המוצג כאן תמונות נלקחים בזמנו של ציפוי ואחרי 16 h. סרגל קנה מידה מייצג 200 מיקרומטר. (B) פלישה של BTSCs של neurospheres לתוך מאטריקס שמסביב הייתה לכמת כל שעה, כפי שמתואר בשלב פרוטוקול 3. נקודות הנתונים הן הממוצע של שלוש בארות שכפל טכני, ומייצגות קווי השגיאה שגיאת התקן של הממוצע (SEM). (ג) לוח זה מראה BTSC neurospheres מוטבע בסוג אני קולגן עם כדור גדול מדי על כימות. סרגל קנה מידה מייצג 300 מיקרומטר. (D) לוח זה מראה BTSC neurospheres נעוץ סוג אני קולגן כי לא קבע באופן מלא. סרגל קנה מידה מייצג 300 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58152/58152fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">הכנה פתרון קולגן</td>
		</tr>
<tr>
<td>מניות [קולגן] (mg/ml)</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>גמר [קולגן] (mg/ml)</td>
			<td>0.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>מספר בארות הדרושים:</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>הנפח הכולל (μl)</td>
			<td>500</td>
		</tr>
<tr>
<td>כמות מלאי הקולגן (μl)</td>
			<td>40</td>
		</tr>
<tr>
<td>נפח של NaOH 1N (μl)</td>
			<td>0.92</td>
		</tr>
<tr>
<td>אמצעי התקשורת (μl)</td>
			<td>459</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: הכנת 0.4 mg/mL מסוג קולגן פתרון. הרשומים הם החל ידוע ו ריכוזים הסופית הרצויה של הסוג אני הפתרון קולגן. אמצעי האחסון המפורטים מספיקים כדי neurospheres את הצלחת לתוך משלוש בארות שכפל, ועוד שניים עבור עודף ולאחר יכולים לכלול תנאי הטיפול יחיד, כפי שיתואר בפירוט פרוטוקול בשלב 3.

Watch this Scientific Journal Video about Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion at JoVE.com

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

כאן, אנו מתארים טכניקות הדמיה לחיות תאים למדוד באופן כמותי את ההעברה ואת הפלישה בתאי גזע המוח גידול גליובלסטומה לאורך זמן, תחת תנאים מרובים של הטיפול.

מבחני הדמיה לחיות תאים מחקר המוח גליובלסטומה גידול תאי גזע ההעברה, הפלישה

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

מבחני Coculture ללמוד מקרופאג Microglia גירוי של גליובלסטומה הפלישה

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

רדיונוקלידים-זריחה מדווח הדמיה כדי לעקוב אחר התקדמות הגידול במודלים הגידול מכרסמים

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

לטווח ארוך לחיות תאים הדמיה כדי להעריך את גורל בתגובה פקליטקסל

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

The Clinical Application of Tumor Treating Fields Therapy in Glioblastoma

היישום הקליני של הגידול לטיפול שדות טיפול ב גליובלסטומה

Glioblastoma is the most common and lethal form of brain cancer, with a median survival of 15 months after diagnosis and a 5 year survival rate of only 5% ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

זרימת עבודה פשוטה הגירה/הפלישה באמצעות Imager אוטומטיות של תאים חיים

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

האורך הדמיה של התנהגות המוח תאים סרטניים בתגובה ביופסיה פולשנית כירורגית

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

עכבה מבוססי מדידה בזמן אמת של סרטן הגירה תאים ופלישה

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

תרבות משותפת של תאים דמויי גזע גליובלסטומה על נוירונים בדוגמת ללמוד הגירה ואינטראקציות הסלולר

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

מודל פרוסת מוח Ex Vivo כדי לחקור ולמקד את צמיחת הגידול הגרורתי של סרטן השד במוח

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

תרבית תלת-ממדית של קריפטות המעי הגס של מורין לחקר תפקוד תאי גזע במעיים ex vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...