Name: live-cell imaging assays to study glioblastoma brain tumor stem cell migration and invasion
Uploaded: 2018-08-29T13:30:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion at JoVE.com

लेखकों ने उनके तकनीकी समर्थन के लिए Rozina Hassam और Orsolya Cseh का शुक्रिया अदा किया । इस अनुसंधान परियोजना के भाग में नवाचार के लिए कनाडा फाउंडेशन से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था (एच Artee Luchman और शमूएल Weiss) और कनाडा के स्टेम सेल नेटवर्क (भी एच Artee Luchman और शमूएल Weiss के लिए) ।

<ol>
	<li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma.">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).</li><li>Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+multiforme:+the+terminator.">Glioblastoma multiforme: the terminator.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6242-6244 (2000).</li><li>Heddleston, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cell+maintenance:+the+role+of+the+microenvironment.">Glioma stem cell maintenance: the role of the microenvironment.</a> Current Pharmaceutical Design. 17 (23), 2386-2401 (2011).</li><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).</li><li>Galli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Tumorigenic,+Stem-like+Neural+Precursors+from+Human+Glioblastoma.">Isolation and Characterization of Tumorigenic, Stem-like Neural Precursors from Human Glioblastoma.</a> Cancer Research. 64 (19), 1-12 (2004).</li><li>Kelly, J. J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+of+Human+Glioblastoma+Stem+Cells+Occurs+Independently+of+Exogenous+Mitogens.">Proliferation of Human Glioblastoma Stem Cells Occurs Independently of Exogenous Mitogens.</a> STEM CELLS. 27 (8), 1722-1733 (2009).</li><li>Cusulin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precursor+States+of+Brain+Tumor+Initiating+Cell+Lines+Are+Predictive+of+Survival+in+Xenografts+and+Associated+with+Glioblastoma+Subtypes.">Precursor States of Brain Tumor Initiating Cell Lines Are Predictive of Survival in Xenografts and Associated with Glioblastoma Subtypes.</a> Stem Cell Reports. 5 (1), 1-9 (2015).</li><li>Luchman, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+mTORC1/2+Blockade+Inhibits+Glioblastoma+Brain+Tumor+Initiating+Cells+In+Vitro+and+In+Vivo+and+Synergizes+with+Temozolomide+to+Increase+Orthotopic+Xenograft+Survival.">Dual mTORC1/2 Blockade Inhibits Glioblastoma Brain Tumor Initiating Cells In Vitro and In Vivo and Synergizes with Temozolomide to Increase Orthotopic Xenograft Survival.</a> Clinical Cancer Research. 20 (22), 5756-5767 (2014).</li><li>Jensen, K. V., Cseh, O., Aman, A., Weiss, S., Luchman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK2/STAT3+inhibitor+pacritinib+effectively+inhibits+patient-derived+GBM+brain+tumor+initiating+cells+in+vitro+and+when+used+in+combination+with+temozolomide+increases+survival+in+an+orthotopic+xenograft+model.">The JAK2/STAT3 inhibitor pacritinib effectively inhibits patient-derived GBM brain tumor initiating cells in vitro and when used in combination with temozolomide increases survival in an orthotopic xenograft model.</a> PLoS ONE. 12 (12), e0189670 (2017).</li><li>Nguyen, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+MSH6+Mutations+in+Treatment-Naive+Glioblastoma+and+Anaplastic+Oligodendroglioma+Contribute+to+Temozolomide+Resistance+Independently+of+MGMT+Promoter+Methylation.">Novel MSH6 Mutations in Treatment-Naive Glioblastoma and Anaplastic Oligodendroglioma Contribute to Temozolomide Resistance Independently of MGMT Promoter Methylation.</a> Clinical Cancer Research. 20 (18), 4894-4903 (2014).</li><li>Hemmati, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancerous+stem+cells+can+arise+from+pediatric+brain+tumors.">Cancerous stem cells can arise from pediatric brain tumors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (25), 15178-15183 (2003).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines.">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).</li><li>Menyh&#225;rt, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+selection+of+functional+assays+to+evaluate+the+hallmarks+of+cancer.">Guidelines for the selection of functional assays to evaluate the hallmarks of cancer.</a> BBA - Reviews on Cancer. 1866 (2), 300-319 (2016).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).</li><li>Albini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+in+Vitro+Assay+for+Quantitating+the+Invasive+Potential+of+Tumor+Cells.">A Rapid in Vitro Assay for Quantitating the Invasive Potential of Tumor Cells.</a> Cancer Research. 47 (12), 3239-3245 (1987).</li><li>Liang, C. -. C., Park, A. Y., Guan, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>Naber, H. P., Wiercinska, E., Ten Dijke, P., van Laar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+Assay+to+Measure+TGF-&#946;-induced+Invasion.">Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).</li></ol>

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

यह देखते हुए कि कैंसर की कोशिकाओं को सक्रिय रूप से proliferating हैं, यह सेल प्रवास के अध्ययन के लिए एक संभावित तकनीकी चुनौती बन गया है । प्रवास परख यहां वर्णित के लिए, BTSCs विकास कारकों, जो प्रसार सीमा के बिना चढ़ाया जाता है, और chemotaxis प्लेट के chemoattractant ढाल पूरी तरह से ७२ घंटे से अधिक नहीं equilibrate । इसके अलावा, के रूप में कोशिकाओं को समय के साथ रहते सेल इमेजिंग का उपयोग कर निगरानी की जा रही है, कोशिकाओं नेत्रहीन व्यापक कोशिका विभाजन सुनिश्चित करने के लिए नहीं होने वाली निगरानी की जा सकती है । प्रवास परख की सफलता के लिए, यह महत्वपूर्ण है के लिए neurospheres पूरी तरह से एकल कोशिकाओं को अलग कर देना और सही सेल संख्या चढ़ाना से पहले गिनती । क्षेत्रों चढ़ाना या भी कई कोशिकाओं चढ़ाना, जो का झुरमुट में परिणाम, छोटे pores (चित्रा 4a और 4B) के माध्यम से पलायन से कोशिकाओं को रोका जा सकता है । यह भी जब chemotaxis माइग्रेशन प्लेट में कोशिकाओं चढ़ाना या जब नीचे जलाशय पर झिल्ली डालने रखने बुलबुले बनाने से बचने के लिए महत्वपूर्ण है । बुलबुले ध्यान के विमान बदल सकते हैं और सही ठहराव (चित्रा 4c) को रोकने के. पूरी थाली कोलेजन की एक पतली परत के साथ लेपित होने की जरूरत है क्योंकि यह कोशिकाओं को एक सतह पर नेविगेट करने के लिए थाली में pores देता है, के रूप में इस परख कोशिकाओं का पालन करने के लिए और फिर chemoattractant की ओर एक जैविक रूप से प्रासंगिक सतह भर में माइग्रेट करने की आवश्यकता है ।
यहां वर्णित BTSC माइग्रेशन प्रोटोकॉल अलग-अलग सेल माइग्रेशन के काइनेटिक आकलन के लिए अनुमति देता है, मौजूदा प्रोटोकॉल की तुलना में विभिन्न उपचार शर्तों के परीक्षण के लिए कम कोशिकाओं की आवश्यकता होती है । यह संस्कृतियों के लिए महत्वपूर्ण है कि बहुत धीमी गति से बढ़ने के रूप में यह प्रयोग के लिए कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या में इकट्ठा करने के लिए मुश्किल हो सकता है । chemotaxis प्रवास प्लेट की कम ताकना घनत्व chemoattractant ढाल की एक धीमी equilibration के लिए अनुमति देता है, अधिक से अधिक ७२ ज, और अधिक प्रभावी ढंग से समय की एक लंबी अवधि में chemotactic प्रवास की जैविक प्रक्रिया की नकल । प्रोटोकॉल के लिए chemotaxis माइग्रेशन प्लेट पर कोलेजन कोटिंग की एक बहुत पतली परत को सुनिश्चित करने के लिए अनुकूलित किया गया है कि परख और प्रवास नहीं आक्रमण उपायों । यह भी इमेजिंग और एकल कोशिकाओं के ठहराव की सुविधा के रूप में वे कोलेजन मैट्रिक्स कोटिंग झिल्ली डालने के लिए पालन । हालांकि, तकनीक की एक सीमा है कि समय के साथ कई कुओं में प्रवास के ठहराव बहुत सरल है और वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर शीघ्र ( सामग्री की तालिकादेखें) । प्रवास परख का एक उल्लेखनीय लाभ के रूप में यहां वर्णित अंय प्रकार के सेल के लिए प्रोटोकॉल की व्यापक अनुकूलन क्षमता है । यह सेल लाइनों है कि या तो धीमी गति से बढ़ रहे हैं, का पालन करने के लिए मुश्किल है, या धीरे पलायन के chemotactic प्रवास को बढ़ाता है के लिए विशेष रूप से उपयोगी होगा ।
BTSC आक्रमण परख की सफलता सुनिश्चित करने के लिए, यह neurospheres इकट्ठा करने से पहले वे २०० µm से बड़ा बनने के लिए आवश्यक है । बड़े क्षेत्रों ध्यान केंद्रित है कि लगातार छवि और यों तो (चित्रा 5C) के लिए बहुत बड़ा है की एक विमान है । इसके अलावा, neurospheres अंय neurospheres के साथ झुरमुट और समग्र करने के लिए शुरू कर सकते हैं । यह सटीक और सुसंगत डेटा के अधिग्रहण को प्रभावित करता है । इसके अलावा, यह आवश्यक है कि neurospheres को अच्छी तरह के तल पर बसने की अनुमति दी जाती है, जबकि कोलेजन बर्फ पर अभी भी है, neurospheres की अनुमति के लिए ध्यान की एक एकल विमान में छवि है (चित्रा 5d) । इसी तरह, यह कोलेजन पूरी तरह प्लेट चलती के रूप में यह एक भी मैट्रिक्स, जो नकारात्मक छवि गुणवत्ता (चित्रा 5d) को प्रभावित कर सकता है के गठन को बाधित कर सकते है बिना सेट करने की अनुमति महत्वपूर्ण है । BTSC आक्रमण परख के लिए यहां वर्णित है, प्रमुख लाभ में से एक यह है कि neurospheres के रूप में BTSCs संस्कृति के लिए सीधे आक्रमण के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है, की आवश्यकता के बिना हो adherently । इसके अलावा, BTSC neurospheres किसी भी extracellular मैट्रिक्स में एंबेड किया जा सकता है, या तो एक विशिष्ट ऊतक से extracellular मैट्रिक्स के व्यक्तिगत घटकों का उपयोग कर या एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तहखाने झिल्ली मिश्रण का उपयोग कर । extracellular मैट्रिक्स को निर्दिष्ट करने की पहचान करने या आक्रमण के विशिष्ट तंत्र का परीक्षण करने में मदद कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल के साथ, यह जीन है, जो विशिष्ट मैट्रिक्स घटकों को नीचा करने के लिए जाना जाता है के मैट्रिक्स metallopeptidase परिवार के व्यक्तिगत सदस्यों को लक्षित करने के प्रभाव का आकलन संभव है । वैकल्पिक रूप से, हालांकि इस प्रोटोकॉल BTSC neurospheres के लिए विशिष्ट है, क्षेत्रों के रूप में उगाया किसी भी कोशिकाओं को एक समान फैशन में इस्तेमाल किया जा सकता है । उदाहरण स्तन कैंसर mammospheres या प्राथमिक कोलोरेक्टल कैंसर tumorspheres के रूप में प्रसंस्कृत कोशिकाओं के रूप में प्रसंस्कृत कोशिकाओं में शामिल; हालांकि, इस तकनीक को एक संस्कृति में क्षेत्रों के रूप में विकसित कर सकते है कि कोशिका प्रकार को सीमित करता है । दोनों प्रवास और आक्रमण परख के अंय लाभ है कि वे स्थापित करने के लिए आसान कर रहे हैं, वे एक ९६-अच्छी तरह से प्रारूप में काम करते हैं, और डेटा समय के साथ quantifiable है ।
कुल मिलाकर, आदेश के बाद उपचार जीबीएम पुनरावृत्ति को रोकने के लिए, यह है कि BTSC प्रवास और आक्रमण की जांच की सुविधा के तरीके विकसित करने के लिए आवश्यक है । माइग्रेशन प्रोटोकॉल वर्णित यहां पहले से स्थापित प्रवास परख पर कई लाभ प्रदान करता है, विशेष रूप से जीबीएम BTSCs के अध्ययन के लिए । यह बेहतर माइग्रेशन प्रोटोकॉल dissociating BTSCs neurosphere शर्तों और चढ़ाना एकल कोशिकाओं में एक ९६-अच्छी तरह से कोलेजन-लेपित chemotaxis माइग्रेशन प्लेट के अंतर्गत cultureed शामिल है । एक जीवित सेल इमेजिंग प्रणाली का उपयोग करना, BTSCs के प्रवास पर नजर रखी जा सकता है और समय के साथ quantified । आक्रमण परख यहां वर्णित एक मैट्रिक्स में neurospheres से BTSC हमलों की निगरानी के लिए अनुमति देता है । यह परख एक कोलेजन मैट्रिक्स, या एक और प्रोटीन से भरपूर extracellular मैट्रिक्स में neurospheres embedding शामिल है, एक ९६ में अच्छी तरह से थाली । एक जीवित सेल समय चूक इमेजिंग प्रणाली के साथ प्लेट की इमेजिंग समय के साथ विभिंन उपचार की स्थिति के तहत BTSC हमलों के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है । इन परख, इसलिए, बेहतर करने के लिए BTSC प्रवास और आक्रमण अंतर्निहित तंत्र को समझने की उंमीद वैज्ञानिकों को एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करते हैं ।

ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) मस्तिष्क कैंसर का सबसे आम और आक्रामक रूप है और, वर्तमान सर्जिकल विकिरण और कीमोथेरेपी के बाद लकीर शामिल चिकित्सा के बावजूद, रोगियों के औसत जीवित रहने के एक मात्र 15 महीने1है । जीबीएम आक्रामक, उच्च दवा प्रतिरोधी है, और अंत में, एक लाइलाज बीमारी है कि अपने निहित जीव विज्ञान में जारी अनुसंधान की आवश्यकता है ताकि उपंयास चिकित्सीय रास्ते की पहचान करने के लिए । जीबीएम रोगियों की उच्च मृत्यु दर मुख्य रूप से आसन्न सामान्य मस्तिष्क ऊतक में व्यापक सेलुलर आक्रमण और रक्त वाहिकाओं के साथ प्रवास, जो उपचार निम्नलिखित रोग की पुनरावृत्ति की ओर जाता है की वजह से है2,3 . कोशिकाओं का एक सबसेट, शब्द मस्तिष्क ट्यूमर स्टेम सेल (BTSCs), कि धीमी गति से साइकिल चालन और चिकित्सकीय प्रतिरोधी रहे हैं, रोग पुनरावृत्ति के लिए नेतृत्व की कल्पना की गई है । जीबीएम BTSCs प्रदर्शन के गुण clonogenic स्व-नवीकरण, multipotency, और ट्यूमर-प्रारंभिक क्षमता4,5,6। BTSCs भी आनुवंशिक, आणविक, और phenotypic विविधता उनके जनक जीबीएम ट्यूमर7,8,9,10को बनाए रखने । इन संपत्तियों जीबीएम के अध्ययन के लिए और उपंयास चिकित्सीय रणनीतियों की खोज के लिए BTSCs एक अत्यंत उपयोगी मॉडल प्रणाली बनाते हैं । vivo में, इन स्टेम की तरह कोशिकाओं ट्यूमर गठन में सक्षम हैं, विकास, और आक्रमण जब नवजात चूहों के दिमाग में प्रत्यारोपित11 और गैर-मोटापे से ग्रस्त मधुमेह/गंभीर संयुक्त इम्यूनो (मंजूरी/SCID) चूहों4. BTSCs की क्षमता अपने मूल ट्यूमर की सेलुलर और ऊतकवैज्ञानिक विशेषताओं दृढ़ता से दोहराऊंगा कोशिकाओं ट्यूमर की शुरुआत12के रूप में उनकी भूमिका का समर्थन करता है कि vivo में इनवेसिव ट्यूमर फार्म के लिए.
उपंयास चिकित्सीय दृष्टिकोण BTSCs लक्ष्य को विकसित किया जा रहा है और मदद जीबीएम रोगियों के लिए दीर्घकालिक परिणाम में सुधार होगा । वर्तमान में, वहां सेलुलर प्रवासन और आक्रमण प्रक्रियाओं है कि उपचारात्मक प्रतिरोध और पुनरावृत्ति के साथ जुड़े रहे है की समझ सीमित है । प्रवास और आक्रमण अलग घटनाएं हैं; प्रवास कोशिकाओं के निर्देश आंदोलन अंतर्निहित प्रक्रिया है और cytoskeleton के पुनर्गठन शामिल है, आसंजन अणुओं, और विधानसभा/फोकल संपर्क अंक के विधानसभा, जबकि आक्रमण भी बाधाओं के भौतिक विनाश की आवश्यकता है जैसे कि एक extracellular मैट्रिक्स13. सेल प्रवास और आक्रमण के अध्ययन की एक व्यापक रूप से स्वीकार की पद्धति Boyden चैंबर परख14,15है । इस तकनीक के लिए, एक डबल चैंबर मीडिया से भर जाता है, नीचे चैंबर में मीडिया के साथ एक chemoattractant के साथ पूरक । Chemotaxis विशिष्ट विकास कारकों या साइटोकिंस, या एक गैर विशिष्ट chemoattractant के रूप में भ्रूण गोजातीय सीरम का उपयोग शुरू हो रहा है । chemoattractant के ढाल के बाद, कोशिकाओं को छिद्रित झिल्ली के माध्यम से स्थानांतरित । समापन बिंदु पर, माइग्रेट किए गए कक्षों को विज़ुअलाइज़ किया जा सकता है और कोशिकाविज्ञान या फ्लोरोसेंट रंगों के साथ धुंधला करके झिल्ली के नीचे quantified. Boyden प्रवासन परख कोटिंग द्वारा एक आक्रमण परख के लिए संशोधित किया जा सकता है extracellular मैट्रिक्स घटकों के साथ इस तरह के रूप में मैं प्रकार कोलेजन या एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स की तरह असुरक्षित फ़िल्टर । आक्रामक कोशिकाओं मैट्रिक्स नीचा, छिद्रित फिल्टर के नीचे करने के लिए कदम के माध्यम से, और प्रवास परख करने के लिए एक समान तरीके से quantified जा सकता है । अंय आमतौर पर इस्तेमाल किया प्रवास परख खरोंच घाव और कोशिका अपवर्जन क्षेत्र13परख शामिल हैं । खरोंच घाव परख एक सेलुलर monolayer में एक अंतर खरोंच द्वारा किया जाता है और खरोंच बंद हो जाता है जब तक नियमित अंतराल पर इमेजिंग द्वारा घाव के किनारे से कोशिकाओं के प्रवास को देख रहा है । कोशिका अपवर्जन परख में, एक शारीरिक बाधा कोशिकाओं के बोने से पहले एक सेल मुक्त क्षेत्र बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है । एक बार जब कोशिकाओं को धाराप्रवाह और सेल मुक्त क्षेत्र में कोशिकाओं के प्रवास नियमित रूप से16imaged है बाधा हटा दिया जाता है ।
ये पहले से स्थापित की परख अक्सर प्रवास या अनुयाई और सजातीय कोशिका आबादी के आक्रमण का अध्ययन, लेकिन काफी नुकसान जब जीबीएम BTSCs या अंय विषम कैंसर कोशिका आबादी का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । Boyden चैंबर परख ही समापन बिंदु माप बनाम सेल आंदोलन के एक काइनेटिक मूल्यांकन उत्पंन कर सकते हैं । समय के साथ एक प्रेक्षण BTSC प्रवास की माप के लिए उच्च प्रासंगिकता का है, दिया है कि विभिंन संस्कृतियों से कोशिकाओं को अक्सर अलग दरों पर पलायन । इस तरह के रूप में, शर्तों और परख के समय प्रत्येक संस्कृति प्रकार के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए और पर्याप्त नमूना और ठहराव के लिए समय की आवश्यकता है गहन परिश्रम । खरोंच और कोशिका अपवर्जन परख अच्छी तरह से BTSC संस्कृतियों के रूप में अनुकूल नहीं हैं, यहां तक कि जब BTSCs laminin पर monolayer शर्तों के तहत प्रसंस्कृत कर रहे है लेपित प्लेटें, हमने देखा है कि BTSCs को खुले स्थान में आंदोलन का विरोध और बंद में रहना पसंद करते दिखाई अंय कोशिकाओं से निकटता । इसके अलावा, इन स्थापित प्रवास परख एक प्रयोग में दृश्य और व्यक्तिगत कोशिकाओं की निगरानी के लिए अनुमति नहीं देते । समय के साथ व्यक्तिगत कोशिकाओं की निगरानी विषम कोशिका आबादी में प्रवास के आकलन के लिए इस तरह के BTSCs के रूप में मूल्यवान है । Boyden चैंबर, खरोंच के अतिरिक्त नुकसान, और सेल-BTSC संस्कृतियों के लिए अपवर्जन क्षेत्र परख रहे है कि वे अपेक्षाकृत उच्च कोशिका संख्या की आवश्यकता होती है, समय की स्थापना के लिए लेने वाली हो सकता है, और या तो तेजी से equilibrate या एक chemoattractant ढाल नहीं है । जैसे, इन परख के लिए दुर्लभ या धीमी गति से बढ़ती कोशिका आबादी या दवा स्क्रीनिंग के लिए उपयोग करने के लिए आदर्श नहीं हैं । इसके अलावा, इन परख एक तीन आयामी (3 डी) प्रारूप है, जो neurosphere शर्तों के तहत हो BTSCs के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है में एक आक्रमण को मापने के लिए अनुकूल नहीं हैं ।
यहां, हम विशेष रूप से अवलोकन और व्यक्तिगत BTSCs के लिए प्रवास के ठहराव के लिए संशोधित परख का वर्णन है, और जीबीएम के आक्रमण के लिए BTSCs neurospheres के रूप में संस्कृति । पहली परख Boyden चैंबर परख के एक अनुकूलन रहते सेल समय-चूक इमेजिंग और एक chemotaxis माइग्रेशन प्लेट का उपयोग करने के लिए chemotactic सेल माइग्रेशन13मापने का वर्णन करता है । Live-एक बहु-अच्छी तरह से प्रारूप में सेल इमेजिंग दृश्य और कई उपचार शर्तों के तहत सेल प्रवास के ठहराव के लिए अनुमति देता है । दूसरी परख यहां वर्णित एक अंडाकार आकृति आक्रमण परख13,17, जो neurosphere शर्तों के तहत BTSCs के इनवेसिव गुण उपायों और विभिंन उपचार के तहत एक 3 डी extracellular मैट्रिक्स में एंबेडेड है शर्तों. कुल मिलाकर, इन परख बहुत अधिक पहले से विषम BTSC संस्कृतियों के प्रवासी और इनवेसिव गुणों का अध्ययन करने के लिए तरीके वर्णित संगत कर रहे हैं । उंहोंने यह भी उपंयास चिकित्सकीय रणनीतियों की जांच के लिए बेहतर अवसर प्रदान करने के लिए दोनों प्रवास और आक्रमण है, जो महत्वपूर्ण रोग पुनरावृत्ति और घातकता को लक्षित करते हैं ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rat Collagen I</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3440-100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH3247-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AX0073-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30730119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Nunc EasYFlask</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15ml conical tube</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte ClearView 96-Well Chemotaxis plate</td>
			<td>Essen Bioscience</td>
			<td>4582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System</td>
			<td>Essen Bioscience</td>
			<td>4545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis Software</td>
			<td>Essen Bioscience</td>
			<td>2016A Rev1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accumax cell detachment solution</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AM105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin, streptomycin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture grade water</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>17-724Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-cell imaging assays to study glioblastoma brain tumor stem cell migration and invasion

ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) खराब वर्तमान में उपलब्ध उपचार के विकल्प के साथ नियंत्रित किया जाता है कि एक आक्रामक मस्तिष्क ट्यूमर है । GBMs की मुख्य विशेषताओं में तेजी से प्रसार और सामांय मस्तिष्क में व्यापक आक्रमण शामिल हैं । पुनरावृत्ति रेडियो की उपस्थिति से परिणाम के लिए सोचा है-और chemo प्रतिरोधी मस्तिष्क ट्यूमर स्टेम सेल (BTSCs) कि प्रारंभिक कैंसर द्रव्यमान से दूर आक्रमण और, इस प्रकार, शल्य चिकित्सा लकीर से बचने । इसलिए, चिकित्सा कि लक्ष्य BTSCs और उनके इनवेसिव क्षमताओं इस रोग के अंयथा गरीब रोग का निदान में सुधार हो सकता है । हमारे समूह और दूसरों को सफलतापूर्वक स्थापित किया है और जीबीएम रोगी नमूनों से BTSC संस्कृतियों विशेषता । इन BTSC संस्कृतियों मौलिक कैंसर इस तरह के clonogenic आत्म नवीकरण, बहु वंश भेदभाव, और प्रतिरक्षा की कमी चूहों में ट्यूमर दीक्षा के रूप में कोशिका के गुणों स्टेम प्रदर्शित करता है । आदेश में जीबीएम, BTSC प्रवास और आक्रमण के तंत्र की एक बेहतर समझ के लिए वर्तमान चिकित्सीय दृष्टिकोण पर सुधार करने के लिए आवश्यक है । जीबीएम में, प्रवास और आक्रमण का अध्ययन प्रतिबंधित है, भाग में, मौजूदा तकनीक की सीमाओं के कारण जो पूरी तरह से इन विट्रो विकास के लिए नहीं खाते में BTSCs की विशेषताओं के रूप में विकसित neurospheres । यहां, हम तेजी से और मात्रात्मक जीवित सेल इमेजिंग परख का वर्णन करने के लिए दोनों प्रवास और BTSCs के आक्रमण गुणों का अध्ययन । पहली विधि वर्णित BTSC प्रवास परख जो एक chemoattractant ढाल की ओर पलायन उपाय है । दूसरी विधि वर्णित BTSC आक्रमण परख जो छवियां और neurospheres से एक मैट्रिक्स में एक सेलुलर आक्रमण quantifies है । यहां वर्णित परख समय के साथ और विभिंन उपचार की स्थिति के तहत BTSC प्रवास और आक्रमण के ठहराव के लिए उपयोग किया जाता है ।

Watch this Scientific Journal Video about Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion at JoVE.com

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

यहाँ, हम लाइव सेल इमेजिंग तकनीक का वर्णन मात्रात्मक समय के साथ और कई उपचार की स्थिति के तहत ग्लियोब्लास्टोमा मस्तिष्क ट्यूमर स्टेम कोशिकाओं के प्रवास और आक्रमण को मापने के लिए.

लाइव सेल इमेजिंग परख ग्लियोब्लास्टोमा ब्रेन ट्यूमर स्टेम सेल प्रवासन और आक्रमण का अध्ययन करने के लिए

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture Assays अध्ययन करने के लिए ग्लयोब्लास्टोमा आक्रमण की बृहतभक्षककोशिका और Microglia उत्तेजना

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

रेडियोन्यूक्लाइड-प्रतिदीप्ति रिपोर्टर जीन इमेजिंग कुतर ट्यूमर मॉडल में ट्यूमर प्रगति को ट्रैक करने के लिए

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

लंबे समय तक रहते सेल इमेजिंग Paclitaxel के जवाब में सेल भाग्य का आकलन करने के लिए

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

The Clinical Application of Tumor Treating Fields Therapy in Glioblastoma

ट्यूमर के नैदानिक आवेदन ग्लियोब्लास्टोमा में खेतों चिकित्सा उपचार

Glioblastoma is the most common and lethal form of brain cancer, with a median survival of 15 months after diagnosis and a 5 year survival rate of only 5% ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

स्वचालित लाइव-सेल Imager का उपयोग करके एक साधारण माइग्रेशन/

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

एक इनवेसिव सर्जिकल बायोप्सी के जवाब में मस्तिष्क ट्यूमर सेल व्यवहार के दीर्घकालिक Intravital इमेजिंग

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

बाधा आधारित वास्तविक समय कैंसर सेल प्रवास और आक्रमण के माप

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

प्रवासन और सेलुलर इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए पैटर्न वाले न्यूरॉन्स पर ग्लियोब्लास्टोमा स्टेम जैसी कोशिकाओं की सह-संस्कृति

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

स्तन कैंसर मस्तिष्क मेटास्टैटिक ट्यूमर विकास का अध्ययन और लक्ष्य करने के लिए एक पूर्व वीवो मस्तिष्क स्लाइस मॉडल

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

आंतों के स्टेम सेल फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए मुराइन कोलोनिक क्रिप्ट्स की त्रि-आयामी संस्कृति

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...