Name: correlative light electron microscopy (clem) for tracking and imaging viral protein associated structures in cryo-immobilized cells
Uploaded: 2018-09-07T15:00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells at JoVE.com

Vi er meget taknemmelige for medarbejdere af elektronmikroskopi Core faciliteter (EFMS 's) på EMBL (Heidelberg) og på Universitet i Heidelberg. Vi også gerne takke Ulrike Herian, Stephanie Kallis og Andrea Hellwig (Heidelberg Universitet), samt Eberhardt Schmidt og Renate Kunz (Universitet i Ulm) til teknisk ekspertbistand. Arbejde ved R.B. og hans team (U.H. og I.R.-B.) blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft, SFB1129, TP11 og TRR83, TP13.

1. forberedelse af mønstrede Sapphire diske for cellekultur
<ol><li>Overføre de mønstrede safir diske (Se Tabel af materialer), med en alfanumerisk mønster ætset på en af deres overflader, ind i en 15 mL konisk centrifugering rør. Bemærk: Alternativt konventionel 0,05 mm tyk safir diske uden alfanumeriske mønster kan bruges som en reference mønster er lavet af kulstof belægning dem med et finder gitter på toppen. Til dette formål, skal de rengøres med ethanol før carbon mønster anvendes.</li>
	<li>Vask dem grundigt med ethanol. Spred dem ud i en petriskål med filtrerpapir og lad dem tørre. Placer dem på et glas dias adskilt fra hinanden ved hjælp af slanke sig lang pincet.</li>
	<li>Check med en inverteret mikroskop (4 X forstørrelse) om mønstret af koordinater kan læses på hver safir disk. Bemærk: Hvis dette ikke er tilfældet, flip safir-diske ved hjælp af pincet.</li>
	<li>Gemme de safir diske i en petriskål. Bemærk: Protokollen kan pause her.</li>
</ol>2. celle kultur med mønstrede safir diske
<ol><li>Sterilisere de mønstrede safir diske med en ultraviolet (UV) crosslinker i 5 min.</li>
	<li>Tage de safir diske til celle kultur biosikkerhed kabinet. Sterilisere den lange pincet med ethanol i biosikkerhed kabinet.</li>
	<li>Tilsæt halvdelen af cellekulturmedium (Se Tabel af materialer) til en celle kultur fad. Overføre de safir diske omhyggeligt med den lange pincet til celle kultur parabol.</li>
	<li>Frø 1 x 105 Huh7-Lunet celler, stabilt udtrykker T7 polymerase genopslemmes i anden halvdelen af cellekulturmedium på kultur parabol. Bemærk: Beregn antallet af celler, der skal forhåndsudfyldes på en sådan måde, at celle confluency bør på endepunktet for eksperimentet ikke over 20-30%. Høj celle tæthed vil hindre flytning af cellerne i senere faser af EM. Desuden kan over-confluency resultere i udstationering af celler fra safir-diske.</li>
	<li>Check at de safir diske forbliver i bunden af kultur parabol og at de alfanumeriske koordinater er stadig læsbar med omvendt mikroskop. Bemærk: Hvis diske float i cellekulturmedium, bruger den lange pincet til at skubbe diske til bunden og til sidst at vende dem tilbage til den korrekte orientering.</li>
	<li>Transfect cellerne næste dag som tidligere rapporteret i referencer21,23 efter Transfektion agenten fabrikant instruktioner.</li>
</ol>3. LM billeddannelse af celler vokser på mønstrede safir diske
<ol><li>Overføre de safir diske på slutpunktet for eksperimentet til en billeddannelse metalplade, der indeholder 30 – 50 µL / position af pH indikator-fri medium at reducere uspecifik baggrund fluorescens. Bemærk: Metalpladen beskrevet her (figur 2) er udformet på det europæiske molekylærbiologiske laboratorium (EMBL) værksted. I mangel af denne plade eller et lignende program, kan glas-bund celle kultur retter også bruges i stedet for LM. Det er vigtigt at ændre den normale cellekulturmedium for medie uden pH indikator. Bemærk også at lange eksponeringstider bør undgås, fordi de kan forårsage photobleaching, fører til reaktive ilt arter (ROS) ophobning og fysiologiske skader celler24,25.</li>
	<li>Image celler under en inverteret widefield fluorescens mikroskop. Bemærk: Når du bruger en grøn fluorescerende proteiner (NGL)-mærkede protein, som vist i de repræsentative resultater, 450-490 nm og 500 – 550 nm excitations- og filtre, henholdsvis burde blive brugt.</li>
	<li>Erhverve først en lav forstørrelse billede (10-20 X) af celler til at allokere celler, der udtrykker FPs. registrere koordinaterne for de mønstrede safir diske hvor celler af interesse er placeret ved hjælp af differential interferens kontrast (DIC) mikroskopi. Bemærk: Syninger flere områder kunne bidrage til at få et bedre overblik over placeringen af cellen/cellerne af interesse. Bemærk også at fasekonstrastmikroskopi kunne eventuelt bruges her.</li>
	<li>Erhverve høj forstørrelse (Fluorescens og DIC) billeder (63-100 X, oliebestan mål) af samme cellen/cellerne til at bedre skelne subcellulært lokaliseringen af protein af interesse i den intracellulære rum. Bemærk: DIC billeder levere kontekstafhængige oplysninger. Disse oplysninger er ofte kritisk at korrelere LM billeder med EM micrographs senere, fordi den endelige korrelation er mere præcis med "anatomiske" landemærker af cellen. Som nogle safir diske kan bryde under cryo-immobilisering, anbefales det stærkt at forberede tre pr. betingelse. Desuden, nogle celler løsnes fra diske under HPF og de efterfølgende trin i denne protokol, mens ultrastruktur af andre celler kan indeholde artefakter som følge af nedfrysning skader. Derfor, mindst to områder af diske skal være afbildet via LM til at sikre, at i sidste ende vil være nok celler der skal analyseres. Vigtigere, bør disse to områder være på modsatte sider af disken. På denne måde harpiks blokken hvor cellerne er indlejret kan blive skåret i to halvdele og dele af disse arealer kan indhentes.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig2.jpg"> Figur 2 : Skema til LM billeddannelse af celler vokser på mønstret safir diske. (A) safir-diske er overført med hjælp af fine pincet til en billeddannelse plade. (B-C) Denne plade er specielt designet til EMBL workshop i Heidelberg at passe ind i lysmikroskop, hvor de safir diske kan være afbildet med cellekulturmedium uden pH indikator. Det består af et metal dias, 75 mm x 25 mm x 1 mm, med fire-fem huller fræset ind i det med en 3 mm drill bit til at passe på størrelse med safir-diske. Derudover var små riller fræset på hver side af huller i en 90° vinkel. Disse huller gør det lettere at få adgang til diske med pincet når manipulere dem. For at muliggøre optimal imaging betingelser var glas coverslips nr. 0 (0.085 til 0,13 mm tyk) limet under hullerne med UV lim og placeret under UV-lys til at hærde. (D) høj forstørrelse billede af mønstrede safir disken skildrer de alfanumeriske koordinater, som er ætset på dens overflade. De mønstrede safir diske er kommercielt tilgængelige (Se Tabel af materialer). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
4. Cryo-immobilisering af celler vokser på mønstrede Sapphire diske via HPF
<ol><li>Placer "A" og "B" aluminium luftfartsselskaberne for HPF (Se Tabel af materialer) i en petriskål med filtrerpapir gennemvædet med 1-hexadecene. Fordybe de mønstrede safir diske med cellerne i en petriskål med 1-hexadecene. Bemærk: Flytte skiverne lidt at vaske cellekulturmedium væk.</li>
	<li>Samle de safir diske mellem et "A" og et "B" aluminium luftfartsselskab i HPF indehaveren som følger (fig. 3B). I bunden, skal du placere et "B" luftfartsselskab med sin flade side vender opad. Placer de safir diske på denne flade side med celler opad. Tilføje en "A" transportør med sin 0,1 mm dybde vender cellerne. Bemærk: Fordi de mønstrede safir diske er tykkere end de konventionelle safir diske, kommercielt tilgængelige "A" transportør (designet til brug med ikke-mønstrede 0,05 mm safir diske) havde skal skæres ned til 0,05 mm på denne 0,2 mm dybde side på EMBL workshop for at passe ind i HPF holderen (fig. 3A). Dette mål, er "En" Flyselskabet indsat i slutningen af et metalrør saa sin 0,2 mm side er udsat og forbliver stadig mens skære det ned. Skære ned side er derefter slebet så de er flade. Alternativt, en særlig aluminium luftfartsselskab kan bruges oven på den mønstrede safir disc (kommercielt tilgængelige, se Tabel af materialer), i dette tilfælde HPF "sandwich" består kun af safir disken og dette luftfartsselskab.</li>
	<li>Luk indehaveren af HPF maskine og fryser cellerne. Bemærk: Denne protokol er specifikke for en bestemt HPF maskine. Andre HPF maskiner kunne alternativt brugte6,26. Under alle omstændigheder skal du være klar over eksistensen af nye generation maskiner fra leverandørerne. Forsigtig: Brug beskyttelsesbriller og hørelse beskyttelse headset.</li>
	<li>
Læg den frosne "sandwich" i en Varmekrympende boks med flydende nitrogen til midlertidig oplagring. Forsigtig: Brug beskyttelsesbriller og komme i kontakt med de lokale sikkerhedsrepræsentanter til at blive informeret om de potentielle farer ved håndtering af flydende kvælstof.<ol>
<li>At undgå forvirring, placere hver "sandwich" i en separat 0,5 mL microcentrifuge tube (inde i Varmekrympende boks) er markeret med et nummer. Bemærk: Protokollen kan pause her. Hvis fryse substitution (FS) ikke kan udføres øjeblikkeligt, prøverne kan gemmes i cryo-rør (med et hul huller i toppen) inde bokse, der er afholdt i en rist i en kryogen flydende kvælstof dewar (Se Tabel af materialer). Denne flydende kvælstof container bør være placeret i et rum med ilt gas sensorer, at undgå kvælning i tilfælde af et iltsvind. Advarsel: Alle de procedurer, der er beskrevet nedenfor (trin 5 og 6) skal der foretages i en biosikkerhed kabinet. Endvidere, de fleste af de reagenser er farlige. Før du bruger dem, er det obligatorisk at læse omhyggeligt sikkerhedsdatablade leveret af producenterne, samt stille sikkerhed officerer om de lokale regler for at sikre sikker håndtering. For korrekt bortskaffelse af disse anvendte materialer, samt for den korrekte anvendelse af det udstyr, der er beskrevet nedenfor, er det også nødvendigt at høre de lokale institute's sundheds- og sikkerhedsprocedurer.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig3.jpg"> Figur 3 : Skema af mønstrede sapphire forsamling diske mellem to aluminium luftfartsselskaber for HPF. (A) Cut-away udsigt over en konventionel "A" transportør, der skal skæres på sin dybere side fra 0,2 mm til 0.05 mm. (B) 0.16 mm tyk safir disken med den alfanumeriske mønster ætset på overfladen er samlet i to aluminium luftfartsselskaber for HPF , som følger: safir disken er placeret på den flade side af en "B" luftfartsselskab med celler opad. Et hakket "A" transportør med sin 0,1 mm dybde vender cellerne er placeret på toppen til at nære den "HPF sandwich". Aluminium luftfartsselskaber og mønstrede safir skiverne er kommercielt tilgængelige (Se Tabel af materialer). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
5. FS af Cryo-fast celler
<ol><li>Fylde FS maskine (Se Tabel af materialer) med flydende kvælstof. Indstil temperaturen til-90 ° C og vente, indtil maskinen når denne temperatur.</li>
	<li>Forberede FS medium indeholdende 0,2% osmium dinitrogentetraoxid (OsO4) (v/v), 0,1% uranyl acetat (UA) (w/v) i glas-destilleret acetone mens FS maskine nedkøling. Bemærk: For at forberede, (for eksempel) 12 mL af FS medium, mix 600 µL af 4% OsO4med 0.012 g af UA i et lille glasbeholder. Opløse denne blanding i et ultralydsbad enheden for 5 min. tilføje 11.4 mL glas-destilleret acetone med en pipette og bland godt.</li>
	<li>Fylde 1,5 mL microcentrifuge rør med 200-500 µL af FS medium, lukker låget og overføre dem til FS maskine. Vente 10 min for FS medium at køle ned.</li>
	<li>Overføre de frosne "sandwich" indeholdende de safir diske med celler i flydende kvælstof ved hjælp af afkølet lang pincet til rør indeholdende FS medium. Forsigtig: Brug cryo-beskyttende handsker og beskyttelsesbriller. Bemærk: HPF "sandwich" kunne skilles spontant under deres håndtering. I dette tilfælde, Sørg for, at de frosne safirer diske er overført til microcentrifuge rør. Aluminium luftfartsselskaber kan kasseres.</li>
	<li>Køre FS som følger indtil den næste dag27: fra-90 ° C til-80 ° C til 8 h; fra-80 ° C-50 ° C til 8 h; fra-50 ° C-20 ° C i 2 timer; fra-20 ° C til 0 ° C i 2 timer.</li>
</ol>6. harpiks indlejring af frysetørrede substitueret prøver
Advarsel: Alle procedurerne nedenfor skal der foretages i en biosikkerhed kabinet. Endvidere, de fleste af de reagenser er farlige. Før du bruger dem, er det obligatorisk at læse omhyggeligt sikkerhedsdatablade leveret af producenterne, samt stille sikkerhed officerer om de lokale regler for at sikre sikker håndtering. For korrekt bortskaffelse af disse anvendte materialer, samt for den korrekte anvendelse af det udstyr, der er beskrevet nedenfor, er det også nødvendigt at høre de lokale institute's sundheds- og sikkerhedsprocedurer.
<ol><li>Tage ud de substituerede enheder fra FS maskine og placere dem på isen i 20 min.</li>
	<li>Holde prøverne ved stuetemperatur i 20 min. og vask dem grundigt (3 gange, 10 min hver) med glas-destilleret acetone. Kassér aluminium luftfartsselskaber med lange pincet, hvis de er stadig i microcentrifuge rør efter FS.</li>
	<li>Infiltrere celler (på de resterende safir diske) i en fire-trins epoxy harpiks serien ved hjælp af 1 h inkubationer i 25%, 50% og 75% harpiks i glas-destilleret acetone, efterfulgt af natten inkubation med 100% resin. Udveksle 100% resin næste dag for 1h.</li>
	<li>Omhyggeligt placere safir-diske i gennemstrømnings-ringe monteret i reagens bade fyldt med 100% resin. Disse ringe bruges som polymerisering forme til 10 safir diske. Bemærk: Safir-diske skal være helt skubbet til bunden med koordinaterne opad i en læsbar måde. Dette kan kontrolleres med hjælp af en kikkert, der er knyttet til en røg emhætte. Alternativt, en kikkert inde i et skab biosikkerhed kunne bruges i stedet. Vigtigere, der er numre (1-10) indgraveret i bunden af de reagenser, der hjælper til at identificere prøverne.  Derudover kunne en papir tag til identifikation af prøverne medtages i harpiks blok.</li>
	<li>Polymerisere prøver i ovnen ved 60 ° C for 48 h.</li>
</ol>7. fjernelse af mønstrede safir diske fra polymeriseret Resin blokke
<ol><li>Fjern de hårde resin blokke med celler fra ovnen. Bemærk: Protokollen kan pause her. Hvis ikke, så lad blokke køle ned til stuetemperatur før skære dem.</li>
	<li>Skære indlejring formene med et barberblad adgang til harpiks blokke. Fjerne de cylindriske harpiks blokke med pincet. Bemærk: Hvis et papir tag ikke er indeholdt i harpiksen blokere før polymerisering, antal blokke med en permanent markør og gemme dem i 1,5 mL microcentrifuge rør. Protokollen kan være midlertidigt her.</li>
	<li>Fordyb spidsen af harpiks blokken indeholder safir disken i en Varmekrympende boks med flydende kvælstof, indtil det stopper "boblende". Derefter, fordybe spidsen af harpiks blok i kogende H2O.</li>
	<li>Gentag de to foregående trin så mange gange som nødvendigt indtil safir disken falder ud af harpiks blok. Forsigtig: Brug beskyttelsesbriller og cryo-beskyttende handsker. Bemærk: Hvis dette ikke virker, bruge et barberblad til at fjerne lidt af den polymeriseret resin omkring skiverne før du prøver igen. Protokollen kan være midlertidigt her.</li>
</ol>8. målrettet trimning og ultratynde skæring for TEM
<ol><li>Identificer området på harpiks blok ansigt hvor celler af interesse er til stede ved at undersøge blok ansigt med kikkerten af en ultramicrotome. Bemærk: Den negative aftryk af koordinere mønsteret fra de mønstrede safir diske bevares på blok ansigt. Dette giver mulighed for identificering af det område, hvor cellerne af interesse er placeret for målrettede trimning. LM billeder skal vendes vertikalt for at lette konstateringen af den samme holdning i blok ansigt.</li>
	<li>Trimme den integrerede celle éncellelag der indeholder cellen/cellerne af interesse for en lille flad pyramide med form som et trapez (~ 200 µm × 250 µm gennemsnitlige størrelse) med en ren barberblad.</li>
	<li>Opnå 70-nm ultratynde sektioner af indlejrede celler med en 35° diamantkniven.</li>
	<li>Placer sektionerne på EM slot gitre med hjælp af ultrafine pincet. Bemærk:: brug af mesh Grid bør undgås, fordi afsnittene kan være maskeret af gitter barer.</li>
	<li>Gemme gitrene i et gitter felt. Bemærk: Protokollen kan pause her.</li>
</ol>9. TEM analyse af ultratynde sektioner
<ol><li>Placer gitteret slot til indehaveren af transmissions-elektronmikroskop. Erhverve lav forstørrelse (oversigt) billeder, hvor profilen komplet celle for celle af interesse er synlige. Bemærk:: cellen/cellerne i interesse kan være fundet tilbage ved hjælp af celle profiler og placeringen af celler til hinanden som referencer, sammenligning af DIC synspunkter erhvervet før af LM.</li>
	<li>Erhverve høj forstørrelse billeder af cellen/cellerne af interesse, at forsøge at finde på ultrastrukturelle niveau, funktioner, der svarer til de fluorescerende signaler observeret tidligere af LM. Bemærk: Montage billeder kan fås ved henvendelse til høj forstørrelse at have overblik i høj opløsning af cellen/cellerne af interesse. Derudover er det ofte nødvendigt at erhverve billeder af den samme celle i fortløbende serie sektioner til at være i stand til at rekonstruere cellen i 3D før sammenligne med fluorescens billeder.</li>
</ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Metoden CLEM præsenteret her for at studere virkningerne af en viral protein udtryk på cellemembraner har held været anvendt inden for at belyse HCV replikation-associerede strukturer, især dobbelt membran vesikler (DMVs)21, samt at bestemme de kritiske byggesten kræves for at danne disse HCV-induceret strukturer23. Bemærk, at i vores første arbejde ved hjælp af CLEM for at studere HCV replikering21, en let ændret udgave af protokollen beskrevet her blev anvendt. I denne undersøgelse, konventionelle 0,05 mm tyk safir diske, uden alfanumeriske mønster, blev brugt som en reference mønstret blev skabt af kulstof belægning dem med et finder gitter på toppen (Se Tabel af materialer). Denne version af den aktuelle protokol kan anvendes til sidst, med den fordel, at "A" transportøren for HPF kan anvendes direkte, uden behov for at skære det som i figur 3A. Alternativt, som nævnt i protokollen, en tykkere "A" transportør kan udnyttes (Se Tabel af materialer) med mønstrede safir diske, uden brug af en "B" luftfartsselskab.
Interessant, kan denne protokol anvendes ikke kun til at studere BSL-1 prøver, som celler transfekteret med virale proteiner som beskrevet her og andetsteds19,23, men også at studere virus-inficerede celler. Selv om arbejdet med menneskers patogener er normalt begrænset til BSL-2 og BSL-3 laboratorier, i nogle lande er det stadig muligt at udføre cryo-immobilisering disse biosikkerhed betingelser. I disse BSL-2 og BSL-3 laboratorier hvor vitrifikation ikke er mulig på grund af de lokale regler eller fraværet af en HPF maskine, kan virus-inficerede celler stadig forberedes ved hjælp af denne metode hvis kemisk fiksering med aldehyder udføres på forhånd nemlig inden de forlader BSL-2 eller BSL-3 faciliteterne. Endvidere skal aldehyder være slukkes straks efter fiksering at holde fluorescens, mens resten af protokollen er identisk med den, der er beskrevet her. Denne teknik kan betragtes som overflødig, fordi cellerne er fast to gange, kemisk og via vitrifikation. Men denne dobbelt fiksering protokol fører faktisk til en meget bedre bevarelse af HCV-induceret DMVs i forhold til DMVs fundet i celler udsat for kemisk fiksering alene21.
For yderligere ændringer og fejlfinding læseren henvises til noter i hele protokol del af dette manuskript. Disse noter beskrive faldgruber for at undgå, såvel som alternativer til at overvinde formodede vanskeligheder, der måtte opstå, når du udfører denne metode.
Den vigtigste forudsætning for at anvende denne teknik er en HPF maskine. Hvornår cryo-immobilisere celler via HPF er ikke mulig (på grund af manglende en HPF maskine) eller ikke påkrævet (når membranen bevarelse ikke behøver at være optimale), celler kan være kemisk fast og efterfølgende udarbejdet og analyseret af EM8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19. Denne indstilling kræver ikke brug af safir diske, men celle kultur retter med inddelte mønstre for at flytte celler eller celle klynger. Den største fordel ved brugen af disse retter er deres større diameter sammenlignet med safir diske, tillade screening af større overfladearealer. Således har CLEM protokollens anvendelse været anvendt med succes til at studere effekten af et antiviralt stof mod HCV15 eller at visualisere membran rearrangementer induceret af de strukturmaessige proteiner af norovira19. Et andet spørgsmål, der kan begrænse effektiviteten af denne metode er fraværet af en kommerciel FS enhed. I dette tilfælde kan grundlæggende hjemmelavet FS systemer udnyttes i stedet. Selv om automatiske FS enheder kan reducere håndtering uheld, er hjemmelavede anordninger anvendt med succes for eksempel på Kent Mcdonald's30 og Paul Walther labs.
Med hensyn til kemisk fiksering sikrer protokollen beskrevet her en optimal bevarelse af den intracellulære strukturer20. Derfor, i tilfælde af den ovennævnte HPF og FS hjælpemidler er tilgængelige, vitrifying celler af interesse vil blive foretrukket.
Fremtidige alternativer til denne CLEM tilgang omfatter mulighed for at anvende denne metode ikke blot at erhverve 2D oplysninger på ultrastrukturelle niveau, men også at få 3D-oplysninger om arkitekturen af membranen og organelle ændringer forårsaget af virus. De 3D-EM metoder, herunder elektron tomografi (ET) og fokuseret ion beam-scanning elektronmikroskopi (FIB-SEM) (udførligt beskrevet i29), kunne også anvendes til celler, der er udarbejdet efter denne aktuelle protokol21, 31. Derudover kan 3D-oplysninger også fås ved henvendelse til LM niveau, når ved hjælp af en Konfokal mikroskop, som giver mulighed for erhvervelse af z-stakke. Denne indstilling er i virkeligheden, anbefales når en præcis sammenhæng mellem LM og EM datasæt er ønskede (Se for eksempel17). Oplysningerne i 3D z-stakke aids at forbedre sammenhængen med 2D TEM billeder. Således, i et sådant scenario, de bedste montering LM og EM billeder kan vælges og derefter udsat for en af de korrelation software til rådighed, som EF-CLEM plugin af ICY (http://icy.bioimageanalysis.org/)32 eller Landmark korrespondancer plugin af Billede Jørgensen (http://imagej.net/Landmark_Correspondences), hvilket resulterer i generation af overlappende LM-EM billeder.
Når tidsmæssige oplysninger er nødvendige for at forstå kinetik af en bestemt begivenhed, kan time-lapse billedbehandling bruges til at overvåge dynamikken i levende celler i kombination med EM. Under arrangementet af interesse rettes celler straks, generere en "frossen snapshot", der efterfølgende kan analyseres via EM, der giver detaljerede ultrastrukturelle oplysninger om det pågældende tidspunkt på tidspunktet for immobilisering. For at opnå den "frosne snapshot", efter observation i realtid, kan celler være enten kemisk fast33 eller cryo-immobiliseret6. Da mange cellulære processer forekomme hurtigere end diffusion processer af kemisk fiksering, hvis det er muligt, skal ultra-hurtig nedfrysning udføres. Det er dog vigtigt at tage i betragtning at HPF maskiner adskiller sig i deres effektive tid beslutning34.
Desuden, selv om denne protokol har været designet til integrering af celler i en epoxy-harpiks, celler kan også integreres i lav viskositet harpikser, såsom Lowicryls, LR hvid eller LR guld. Brugen af disse indlejring medier gør det muligt for at bevare antigenicity35,36, samt fluorescens37,38 , og derfor bruges mest til post indlejring på afsnit immunolabeling39 , 40 og på afsnit CLEM41,42,43,44, hvor LM er gjort efter integrering. Begge tilgange (immuno-EM og på afsnit CLEM) skal være afgørende for de eksperimenter, hvor ikke-karakteristiske strukturer kan nemt findes via TEM og/eller som en kontrol mod miscorrelation mellem LM og EM signaler. Ligeledes, mærkning med antistoffer, der kan visualiseres ved begge billeddiagnostiske modaliteter (LM og EM) kan transporteres ud af45 for at, for eksempel, identificere transfekteret celler i LM (pre indlejring fase) og opnå en mere nøjagtig lokalisering af den Normal god landbrugspraksis signal via sin særlige mærkning af immuno-EM (post indlejring fase). Det skal tages i betragtning, dog at permeabilization foregår før LM til at tillade adgang for antistoffer mod det intracellulære rum, som kan resultere i en optimal bevarelse af celle arkitektur på EM-niveau. Interessant, denne protokol er også velegnet for multi-farve eksperimenter der kan opnås med brugen af andre fluorescerende tags, end normal god landbrugspraksis (som vist her). Afslutningsvis er der mange formodede mulighederne for tilpasning af denne protokol, både LM og/eller EM sider, afhængigt af de spørgsmål, der behandles. En omfattende beskrivelse af andre alternative protokoller henvises læseren til5,46. Uanset hvordan mikroskopi metoder kombineres, er resultatet sammen en gevinst på information, giver mulighed for os til bedre at forstå hvordan vira og deres proteiner sammen med deres værter i det virkelige liv.
Det mest afgørende skridt inden for denne metode er samlingen af seriel afsnit fra celler af interesse. Som fremhævet i afsnittet repræsentative resultater kræver dette ekspert personale, samt en masse tålmodighed. Vigtigere, er dette trin vigtigt at finde cellerne tilbage på niveauet EM af to grunde. Først, i denne slags CLEM protokol bruger pre indlejring LM, koordinater er kun synlige på LM-niveau og på harpiks blok ansigt efter integrering. Dog vil de ikke være synlig på sektioner af TEM. Derfor skal målrettet trimning i blok ansigtet ned til områder af interesse (ROIs) udføres omhyggeligt med et barberblad til at sikre, at de dele, der er efterfølgende indhentet indeholder de celler, der udtrykker en bestemt FP. For det andet er "scanning" flere sektioner nødvendigt at finde den bedste overlay mellem LM og EM erhvervelser. I modsætning til metoder hvor LM er udført på stadiet post indlejring, er i dette tilfælde LM-EM overlay ikke så præcis. Lav overlay nøjagtighed skyldes forskelle i aksial beslutning mellem LM og EM, svind under prøve behandling af EM og komprimering ved skæring42. Ikke desto mindre hjælpe effektiv sporingsmetoder, såsom brugen af landemærker, med at finde cellerne tilbage. Dette omfatter én celle til en anden position og form af celler og deres kerne. I denne forbindelse som anført i protokollen, give DIC billeder "anatomiske" information af de celler, der er afgørende for at forbedre sammenhængen. Alternativt, kerner eller andre godt-genkendelige celle organeller (mitokondrier eller lipid dråber) kan farves før LM og anvendes som vartegn.
Endelig er det værd at nævne, at selvom dette manuskript er fokuseret på anvendelsen af denne teknik for virologi undersøgelser, omfanget af denne eksperimentelle design kan udvides for at løse mere almindelige biologiske spørgsmål.

Idé om at kombinere to mikroskopi metoder til at få et bedre billede af en bestemte biologiske proces er temmelig gammel. Således, den første undersøgelse om virus ved hjælp af "korrelationsmaalinger mikroskopi" udkom i 1960 som to særskilte publikationer1,2. I denne undersøgelse analyserede forfatterne ændringer i morfologi af kernen induceret af adenovirus ved hjælp af to mikroskopi-teknikker. I den første publikation var elektronmikroskopi (EM) bemærkninger beskriver de morfologiske oplysninger tilknyttet adenovirus infektion rapporteret1. I en anden publikation, var de forskellige strukturer observeret af EM korreleret med lysmikroskopi (LM) billeder af histokemiske farvning mønstre, til at definere karakteren af de strukturer, tidligere observeret af EM2.
I disse tidlige studier, var deres observationer imidlertid udføres, ved hjælp af forskellige inficerede celler forberedt som uafhængige forsøg. "Korrelation" var, ja, ment som kombinationen af oplysninger fra to billeddiagnostiske modaliteter til at forstå et bestemt fænomen, sammenligne alle de resultater, der er opnået med forskellige assays for at forstå en given biologiske proces.
I dag er anvendes udtrykket korrelationsmaalinger mikroskopi, også kendt som korrelationsmaalinger lys og elektronmikroskopi (CLEM), til et stigende antal metoder (gennemgik i referencer3,4,5), med fællestrækkene at både Billeddannende teknikker (LM og EM) er udført på samme prøve. Kombinationen af begge metoder resulterer derved i et multimodalt, multi-skala og multi-dimensional analyse af at prøve3. Fordelene er, at LM kan give et bredt overblik over mange forskellige celler, muliggør identifikation af celle delpopulationer udtryk for et protein eller proteiner af interesse inden for en heterogen celle population. EM overvinder opløsning grænsen for LM, hvilket giver en højere opløsning billede af en bestemt intracellulære begivenhed. Derudover EM giver mulighed for visualisering af ikke-fluorescerende subcellulært sammenhæng, herunder alle membran bundet organeller, store makromolekylære komplekser (fx ribosomer, centrioler, etc.) og cytoskeletal elementer, således giver yderligere geografisk information, den såkaldte "refererer til rum"6, og giver forbindelse til fluorescerende stedet opdaget af LM.
I løbet af de sidste par år, CLEM er blevet et stærkt værktøj for celle biologer5, men også for virologer (gennemgik i reference7) villig til at forstå de komplekse virus-celle interaktioner, der fører til en vellykket virus formering. Dermed, forståelse af hvordan virus ændre cellemembraner og organeller til deres egen fordel er vigtigt at udvikle antivirale lægemidler for at udrydde lavpatogen virus.
Her, er en CLEM metode beskrevet der giver mulighed for påvisning af LM af celler, der udtrykker virusproteiner smeltet til en fluorescerende proteiner (FP). Disse celler er efterfølgende cryo-immobiliseret og yderligere rede for ultrastrukturelle analyse via transmissions Elektron Mikroskopi (TEM) at få ny indsigt i hvordan udtryk for disse proteiner omarrangere intracellulære membraner (figur 1). CLEM er udført med kemisk fast celler i de fleste af de virologi undersøgelser offentliggjort til dato8,9,10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19. Dette er hovedsagelig på grund af behovet for at inaktivere smitsomme materiale for Biosikkerhed grunde i biosikkerhed niveau-2 og -3 (BSL-2 og BSL-3) laboratorier, hvor cryo-immobilisering af celler ikke er normalt muligt. For disse spørgsmål, der kræver en optimal bevarelse af cellemembraner, vitrifikation via højtryk frysning (HPF), dog anbefales20. I disse tilfælde kan CLEM protokollen beskrevet her anvendes. Interessant, især når du arbejder med smitsomme prøver, kan HPF udføres på prøver, der har været tidligere kemisk inaktiveret, for eksempel i BSL-2 og BSL-3 laboratorier. Kombinationen af kemisk fiksering efterfulgt af HPF er en mulighed for at profit i det mindste delvist fra fordelene ved cryo-bevarelse metoder21,22.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig1.jpg"> Figur 1 : Skematisk fremstilling af arbejdsgangen for analysen af celler via CLEM. Celler vokser på mønstrede safir diske analyseres først af LM til at lokalisere celler, der udtrykker FPs før deres forarbejdning til EM. Når fundet, fast celler straks af HPF og FS at være efterfølgende indkapslet i harpiks. Efter polymerisering af harpiks, støtte hvor celler voksende (= safir diske) skal fjernes fra harpiks blok. Blokken indeholder de indlejrede celler er trimmet til en lille trapez, hvorfra de resterende celler, udtrykker FPs, er delt med en diamant kniv. Ultratynde sektioner er indsamlet på slot gitre og yderligere undersøgt af TEM ultrastrukturelle oplysninger af disse celler. Dette tal er tilpasset og ændret med tilladelse fra reference29. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2451px;" width="2450">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">UV Crosslinker</td>
			<td style="width:392px;">Stratagene</td>
			<td style="width:149px;">400072</td>
			<td style="width:1539px;">Stratalinker 1800, 230Vac, equipped with 254-nm UV light bulbs, 8-watts/each.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Patterned sapphire discs</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td>
			<td>627</td>
			<td>They have a 0.3-mm diameter and are 0.16-mm thick, as well as an an etched alphanumeric pattern to allow for re-location of the cells. They can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Slim and long tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>72919-SS</td>
			<td>&#34;Style SS&#34;, for handling sapphire discs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Cell culture medium</td>
			<td style="width:392px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:149px;">41965-062</td>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle medium (DMEM) supplemented with 2 mM L-glutamine, nonessential amino acids, 100 units penicillin per ml, 100 &#181;g streptomycin per ml and 10% fetal calf serum (DMEM complete, see below). Package containing 10 bottles, 500 ml/each.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:392px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:149px;">25030-123</td>
			<td style="width:1539px;">Package containing 20 bottles of 100 ml/each.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Nonessential amino acids</td>
			<td style="width:392px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:149px;">11140-068</td>
			<td style="width:1539px;">Package containing 20 bottles of 100 ml/each.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:392px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:149px;">15140-163</td>
			<td style="width:1539px;">Package containing 20 bottles of 100 ml/each.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:392px;">Sigma Aldrich, St. Louis, MI, USA</td>
			<td>F7524</td>
			<td style="width:1539px;">Bottle of 50 ml.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:392px;">Olympus Deutschland, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:149px;">CKX41</td>
			<td>It is an inverted microscope with trinocular head options and fluorescence upgrade capability.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Huh7-Lunet cells stably expressing the T7 RNA-polymerase</td>
			<td style="width:392px;">Avaliable at Prof. Dr. Ralf Bartenschlager laboratory</td>
			<td style="width:149px;">Not available</td>
			<td style="width:1539px;">Contact Prof. Bartenschlager at: ralf.bartenschlager@med.uni-heidelberg.de.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Mirus TransIT-LT1 Transfection Reagent</td>
			<td>Mirus Bio LLC, Madison, USA</td>
			<td style="width:149px;">MIR 2304</td>
			<td style="width:1539px;">Broad spectrum, low toxicity, DNA transfection reagent. Vial of 0.4 ml.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Inverted widefield fluorescence microscope</td>
			<td style="width:392px;">Carl Zeiss Microscopy GmbH, Germany</td>
			<td style="width:149px;">Zeiss Observer.Z1</td>
			<td style="width:1539px;">Inverted fluorescence microscope for experiments involving living cell cultures.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-hexadecene</td>
			<td style="width:392px;">Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>8220640100</td>
			<td style="width:1539px;">Bottle of 100 ml.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#34;A&#34; aluminium holders for high pressure frezing (HPF)</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td>
			<td>241</td>
			<td>This is the holder that has been used for this protocol and has 2 different depths of 0.1 and 0.2-mm. It can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#34;B&#34; aluminium holders for HPF</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td>
			<td>242</td>
			<td>This is the holder that has been used for this protocol.It is 0.3-mm thick.They can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">&#34;A&#34; aluminium holder for HPF (special for working with patterned sapphire discs)</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td>
			<td style="width:149px;">737</td>
			<td style="width:1539px;">This is the holder than can be used alone with the patterned sapphire disc (as an alternative to the current protocol), without the need of a &#34;B&#34; holder or the edition of the &#34;A&#34; holder. It is 0.84-mm thick. It can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Sapphire discs</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td>
			<td style="width:149px;">405</td>
			<td style="width:1539px;">These sapphires discs are the &#34;conventional&#34; one, with a 0.3-mm diameter and a thickness of 0.05 mm . They can be also used for CLEM as an alternative instead of patterned sapphire discs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Finder grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, Philadelphia, USA</td>
			<td>LF135-Cu</td>
			<td style="width:1539px;">These 135 mesh grids are used to create an alphanumeric pattern on &#34;conventional&#34; sapphire discs (described above) via carbon coating, so that they can be used for CLEM. 100 grids/vial.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPF machine</td>
			<td style="width:392px;">ABRA Fluid AG, Widnau, Switzerland</td>
			<td style="width:149px;">HPM 01</td>
			<td style="width:1539px;">This HPF machine has been used for this protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HPF machine</td>
			<td style="width:392px;">Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td style="width:149px;">EMPACT 2</td>
			<td style="width:1539px;">&#34;EMPACT 2&#34;, as an alternative to the use of the HPM machine that it has been used in this protocol (described above).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Cryo-tubes</td>
			<td style="width:392px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:149px;">Z763667-500EA</td>
			<td style="width:1539px;">For long term-storage of cryo-immobilized samples in liquid nitrogen. Package containing 500 cryovials.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Liquid nitrogen dewar</td>
			<td>Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany</td>
			<td style="width:149px;">GZ-05094-60</td>
			<td style="width:1539px;">For long term-storage of cryo-immobilized samples in liquid nitrogen, equipped with cryo-racks with a capacity of 1600 cryo-tubes.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Automatic freeze substitution (AFS) machine</td>
			<td style="width:392px;">Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td style="width:149px;">EM AFS2</td>
			<td>This machine performs freeze substitution and progressive lowering of temperature (PLT) techniques and allows low temperature embedding and polymerization of resins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Osmium tetroxide (OsO4)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>19150</td>
			<td>4% aqueous solution, one box containing 10 x 2 ml ampules.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uranyl-Acetate (UA)</td>
			<td>Serva, Heidelberg, Germany</td>
			<td>77879.01</td>
			<td>Bottle containing 25 grs of (UA)-2 H2O.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Sonicator</td>
			<td style="width:392px;">Bandelin Electronic, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:149px;">329</td>
			<td style="width:1539px;">&#34;Sonorex Super RK 31&#34; is a high-power ultrasonic cleaning bath for aqueous cleaning solution that is used in this protocol to mix OsO4 and Ua when preparing the FS medium.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass-distilled acetone</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>10015</td>
			<td>Bottle of 100 ml.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:392px;">Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td style="width:149px;">Leica M80</td>
			<td style="width:1539px;">Routine stereomicroscope for daily inspections, equipped with a camera for capturing images.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Epoxy resin</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td style="width:149px;">14120</td>
			<td style="width:1539px;">Embed 812 is a kit containing several components that must be mix together in the proportions given by the manufacturers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Flow through rings</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td>16707157</td>
			<td>Package containing 100 pieces.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Reagent baths</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td>16707154</td>
			<td>Package containing 100 pieces.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td>Leica EM UC7</td>
			<td>Ultramicrotome for preparation of semi- and ultrathin sections at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra 35&#176; diamond knife</td>
			<td>Diatome Ltd., Nidau 
			Switzerland</td>
			<td>AGG339-735</td>
			<td>This knife have an edge length of 3 mm.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra fine tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>E78318</td>
			<td style="width:1539px;">&#34;Style 3X&#34;, for handling EM grids.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EM slot grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>G2010-Cu</td>
			<td>100 grids/vial.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EM grid storage box</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>71155</td>
			<td>It has capacity for 100 grids.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

correlative light electron microscopy (clem) for tracking and imaging viral protein associated structures in cryo-immobilized cells

På grund af sin høje opløsning er elektronmikroskopi (EM) et uundværligt redskab for virologer. En af de største problemer når du analyserer virus-inficerede eller transfekteret celler via EM er dog de lave effektivitet af infektion eller Transfektion, hindrer behandlingen af disse celler. For at overvinde denne vanskelighed, kan lysmikroskopi (LM) blive udført først for at allokere delpopulation af inficerede eller transfekteret celler. Således at drage fordel af brugen af fluorescerende proteiner (FPs) smeltet til virusproteiner, LM bruges her til at registrere positioner "positive-transfekteret" celler, udtrykker en FP og vokser på en støtte med en alfanumerisk mønster. Efterfølgende celler behandles yderligere til EM via højtryk frysning (HPF), fryse substitution (FS) og harpiks indlejring. Den ultra-hurtig nedfrysning trin sikrer fremragende membran bevarelsen af de markerede celler, der kan analyseres derefter på ultrastrukturelle niveau af transmissions Elektron Mikroskopi (TEM). Her tilbydes en trinvis korrelationsmaalinger lys elektronmikroskopi (CLEM) arbejdsproces, der beskriver prøveforberedelse, billedbehandling og korrelation i detaljer. Den eksperimentelle design kan også anvendes for at løse mange celle biologi spørgsmål.

Ved hjælp af den procedure, der præsenteres her (figur 1), Huh7-Lunet celler stabilt udtrykker T7-RNA-polymerase var seedet på mønstrede safirer diske og efterfølgende transfekteret med et plasmid udtrykker to domæner af Hepatitis C virus (HCV) nonstructural protein NS5A, markeret med normal god landbrugspraksis (NGL-pTM_AH-D1) (figur 4). Den følgende dag, blev de mønstrede safir diske, hvor cellerne voksede, taget ud af celle kultur retter og afbildet ved LM (figur 4, figur 2). De celler, der udtrykker AH-D1-NGL blev identificeret ved tilstedeværelsen af grønne fluorescens i cytosol og registreres for at redde deres positioner i koordinat-mønster af safir diske (tal 5A, 5B). Umiddelbart efter deres LM undersøgelse, safir diske med celler af interesse blev samlet mellem to aluminium luftfartsselskaber (figur 3) og udsat for cryo-immobilisering af HPF. Celler blev derefter fryse substituerede og efterfølgende indkapslet i en epoxyharpiks.
Efter udtagning af safir diske fra polymeriseret resin blokke var aftryk af de alfanumeriske mønster synlig på blok ansigt, som er tilladt under hentning af de områder, hvor cellerne i interesse var placeret. Resten af harpiks blok var trimmet væk for at generere en lille trapez husly celler af interesse. Seriel ultratynde sektioner hidrører fra denne trapez, indsamlet på EM slot gitre og yderligere analyseres af TEM (figur 5C). Bemærk at opnå manuelt seriel fortløbende afsnit selv om muligt28 er labor intensive og kræver veluddannet og kvalificeret personale. Det er også vigtigt, at cellerne har en lav confluency når de udsættes for denne CLEM protokol (figur 5A) for at sikre en hurtig anerkendelse af den samme celle tidligere identificeret af LM. Ellers, at have højere celle confluency kan dramatisk bremse den succesfulde lokalisering af celler på niveauet EM.
TEM analyse af flere ultratynde sektioner af cellen af interesse (tal 5 d, 5E), udtrykker AH-D1-NGL, afslørede tilstedeværelsen i den intracellulære rum af store ophobninger af vesikler af variabel morfologi afgrænset fra den omkring cytosol af en enkelt lipid tolagede (figur 5E).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig4.jpg"> Figur 4 : Skematisk gengivelse af arbejdsprocessen efterfulgt for at udføre eksemplet CLEM afbildet i Figur 5 . Huh7-Lunet celler stabilt udtrykker T7-RNA-polymerase var transfekteret med en DNA plasmid kodning amphipathic helix (AH) og domæne 1 (D1) af HCV NS5A protein, markeret ved dens C-terminal med normal god landbrugspraksis (pTM_AH-D1-NGL). Udtryk for denne del af NS5A proteinet kontrolleres transcriptionally af en T7 promotor (T7 Pm) og translationally af et encephalomyocarditis virus (EMCV) IRES (intern ribosom indrejse site) element, angivet med en sekundær struktur. 24 h efter Transfektion (24 hpt) celler vokser på mønstret safir diske og udtrykker AH-D1-NGL blev opdaget af LM og straks udsat for HPF-FS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig5.jpg"> Figur 5 : Eksempel på en CLEM procedure. (A) Huh7-Lunet celler stabilt udtrykker T7 polymerase analyseret af Fluorescens mikroskopi til at allokere normal god landbrugspraksis-positive celler dyrkes på mønstrede safir diske, 24 h efter Transfektion med plasmidet pTM_AH-D1-normal god landbrugspraksis. (B) højere forstørrelse billede af en enkelt celle markeret i hvide stiplede rektanglet skal analyseres ved CLEM. (C) TEM billede af en ultratynde afsnit af den samme celle efter HPF, FS og harpiks indlejring. (D) skematisk gengivelse af serie 70-nm ultratynde sektioner på en slot EM gitter, der indeholder cellen af interesse. (E) på venstre: TEM oversigter over to sektioner af cellen af interesse. Til højre: høj forstørrelse TEM billeder af de intracellulære områder markeret i gul rektangler til venstre, afsløre et højt antal vesikler afgrænset fra cytosol via en enkelt membran. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells at JoVE.com

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Korrelationsmaalinger lys Elektron Mikroskopi (CLEM) til sporing og Imaging Viral Protein associeret strukturer i Cryo-immobiliserede celler

En korrelationsmaalinger lys elektronmikroskopi (CLEM) metode kan anvendes på billedet virus-induceret intracellulære strukturer via elektronmikroskopi (EM) i celler, der er tidligere vælges ved lysmikroskopi (LM). LM og EM er kombineret som en hybrid imaging tilgang til at opnå en integreret visning af virus-værtssammenspil.

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Virale Nanopartikler for<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Korrelativ mikroskopi til 3D Strukturel analyse af dynamiske vekselvirkning

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

In situ trykbelastning og korrelationsmaalinger Noninvasiv Imaging af Bone-parodontal ligament-tand Fiber Joint

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescens-quenching af et liposomalt indkapslet Near-infrarøde fluorofor som et værktøj til<em&gt; In Vivo</em&gt; Optisk Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

Undersøgelse af støkiometrien af ​​epidermal vækstfaktor receptor i intakte celler ved hjælp af korrelative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

Korrelative lys- og Electron Microscopy Brug Quantum Dot Nanopartikler

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Lys-ark Fluorescens mikroskopi for studiet af Murine hjertet

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisere vedhæftning dannelse i celler ved hjælp af avancerede Spinning Disk-Total interne Reflection Fluorescens mikroskopi

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...