Name: correlative light electron microscopy (clem) for tracking and imaging viral protein associated structures in cryo-immobilized cells
Uploaded: 2018-09-07T15:00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells at JoVE.com

We zijn zeer dankbaar aan de personeelsleden van het elektronenmicroscopie Core voorzieningen (EFMS) op EMBL (Heidelberg) en aan de Universiteit van Heidelberg. Wij ook bedank Ulrike Herian, Stephanie Kallis en Andrea Hellwig (Universiteit van Heidelberg), evenals Eberhardt Schmidt en Renate Kunz (Universiteit van Ulm) voor deskundige technische bijstand. Werk van R.B. en zijn team (U.H. en IR-B.) werd gesteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft, SFB1129, TP11 en TRR83, TP13.

De auteurs hebben niets te onthullen.

De hier voorgestelde om te bestuderen van de impact van een virale eiwituitdrukking op celmembranen CLEM-methodologie is met succes gebruikt voordat om te verhelderen van het HCV replicatie-geassocieerde structuren, vooral dubbel membraan blaasjes (DMVs)21, alsook om te het bepalen van de kritische bouwstenen die nodig zijn om te vormen van deze structuren HCV-geïnduceerde23. Merk op dat in onze eerste werk met behulp van CLEM te bestuderen van HCV replicatie21, een enigszins gewijzigde versie van het protocol hier beschreven werd toegepast. In die studie, conventionele 0,05 mm dik saffier schijven, zonder alfanumeriek patroon, werden gebruikt waarin een verwijzing patroon is gemaakt door carbon coating hen met een rooster van de finder op de top (Zie Tabel van materialen). Deze versie van het huidige protocol kan uiteindelijk worden toegepast, met het voordeel dat de "A" vervoerder voor HPF rechtstreeks, zonder de noodzaak voor het kappen zoals in Figuur 3Akan worden gebruikt. Als alternatief, zoals vermeld in het protocol, een dikkere "A" vervoerder kan worden gebruikt (Zie Tabel van materialen) met gedessineerde saffier schijven, zonder de behoefte aan een "B" luchtvaartmaatschappij.
Interessant, kan dit protocol worden toegepast, niet alleen om te studeren van BSL-1 monsters, zoals cellen transfected met virale eiwitten zoals beschreven hier en elders19,23, maar ook aan de studie van virus-geïnfecteerde cellen. Hoewel werken met menselijke pathogenen meestal beperkt tot BSL-2 en3 BSL laboratoria is, in sommige landen is het nog steeds mogelijk om uit te voeren cryo-immobilisatie onder deze omstandigheden inzake bioveiligheid. In die BSL-2 en de BSL-3 laboratoria waar verglazing niet mogelijk, als gevolg van de plaatselijke regelgeving of het ontbreken van een machine HPF is, kunnen virus-geïnfecteerde cellen nog steeds bereid worden met behulp van deze methode als chemische fixatie met aldehyden van tevoren, wordt uitgevoerd namelijk verlaten voordat de BSL-2 of BSL-3 faciliteiten. Bovendien dienen aldehyden te worden uitgeblust onmiddellijk na fixatie te houden van de fluorescentie, terwijl de rest van het protocol identiek aan de hier beschreven is. Deze techniek kan worden beschouwd als overbodig omdat de cellen zijn vaste tweemaal, chemisch en via verglazing. Dit protocol dubbele fixatie leidt echter inderdaad tot een veel beter behoud van de HCV-geïnduceerde DMVs in vergelijking met de DMVs gevonden in cellen die zijn blootgesteld aan chemische fixatie alleen21.
Voor verdere wijzigingen en het oplossen van problemen met de lezer wordt verwezen naar de toelichting in het protocol deel van dit manuscript. Deze nota's beschrijven valkuilen te vermijden, evenals alternatieven voor vermeende problemen die zich voordoen kunnen bij het uitvoeren van deze methode.
De belangrijkste voorwaarde voor het toepassen van deze techniek is een HPF machine. Wanneer de cellen via HPF is niet haalbaar (als gevolg van het ontbreken van een machine HPF) of niet verplicht is (wanneer het membraan behoud hoeft niet te worden optimaal), cryo immobilizing cellen kan worden chemisch vaste en vervolgens voorbereid en geanalyseerd door EM8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19. Deze optie hoeft niet het gebruik van sapphire schijven, maar cel cultuur gerechten met gerasterde patronen voor het verplaatsen van cellen of cel clusters. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van deze gerechten is hun grotere diameter in vergelijking met saffier schijven, waardoor de screening van grotere oppervlaktes. Dus, de toepassing van dit protocol CLEM is met succes toegepast te bestuderen van het effect van een antivirale samengestelde tegen HCV15 of te visualiseren de membraan herschikkingen geïnduceerd door de nonstructural eiwitten van norovirussen19. Een andere kwestie die de prestaties van deze methode beperken kan is het ontbreken van een commerciële FS-apparaat. Basissystemen zelfgemaakte FS kunnen in dit geval in plaats daarvan worden gebruikt. Hoewel automatische FS apparaten behandeling ongelukken verminderen kunnen, worden zelfgemaakte apparaten gebruikt met succes bijvoorbeeld bij Kent McDonald's30 en Paul Walther de labs.
Met betrekking tot chemische fixatie, het protocol beschreven hier zorgt voor een optimaal behoud van de intracellulaire structuren20. Daarom, in het geval dat de bovengenoemde HPF en FS apparaten beschikbaar zijn, de cellen van belang vitrifying zou de voorkeur.
Toekomstige alternatieven voor deze aanpak CLEM omvatten de mogelijkheid van het gebruik van deze methode niet alleen om 2D informatie op ultrastructureel niveau te verwerven, maar ook om te krijgen 3D-informatie over de architectuur van membraan en organel wijzigingen veroorzaakt door virussen. De 3D-EM-methoden, met inbegrip van Elektronentomografie (ET) en gerichte ion beam-scanning elektronenmicroscopie (FIB-SEM) (uitgebreid beschreven in29), kunnen ook worden toegepast op cellen die zijn opgesteld na deze huidige protocol21, 31. Daarnaast kon 3D-informatie worden ook verkregen op het niveau van de LM, bij het gebruik van een confocal microscoop, waarmee de verwerving van z-stacks. Deze optie wordt echter nadrukkelijk aanbevolen wanneer een precieze correlatie tussen LM en EM datasets is gewenste (zie bijvoorbeeld17). De informatie opgenomen in 3D z-stacks aids ter verbetering van de correlatie met de 2D TEM beelden. Dus, in zulk een scenario, de best passende LM en EM afbeeldingen kunnen worden geselecteerd en vervolgens onderworpen aan een van de correlatie software beschikbaar, zoals de EG-CLEM plugin van ICY (http://icy.bioimageanalysis.org/)32 of de Landmark correspondenties plugin van Afbeelding J (http://imagej.net/Landmark_Correspondences), resulterend in de generatie van overlappende LM-EM beelden.
Wanneer temporele informatie is nodig om te begrijpen van de kinetiek van een bepaalde gebeurtenis, kan time-lapse beeldvorming worden gebruikt om te controleren van de dynamiek van levende cellen in combinatie met EM. Tijdens het evenement van belang, cellen vastliggen onmiddellijk, het genereren van een "bevroren momentopname" die later kan worden geanalyseerd via EM, gedetailleerde ultrastructurele voorlichting over dat moment op het moment van immobilisatie. Het verkrijgen van die "bevroren momentopname", na de observatie in real-time, kunnen cellen chemisch vaste33 of cryo-geïmmobiliseerd6. Aangezien veel cellulaire processen er sneller dan de processen van de verspreiding van chemische fixatie voorkomen, indien mogelijk, moet Ultra snelle invriezen worden uitgevoerd. Het is echter belangrijk om rekening te houden dat de HPF machines in hun effectieve tijd resolutie34verschillen.
Bovendien, hoewel dit protocol is ontworpen voor het insluiten van cellen in een epoxyhars, cellen kunnen worden ook ingebed in lage viscositeit harsen, zoals Lowicryls, LR wit of LR goud. Het gebruik van deze insluiten media stelt voor het behoud van de antigenicity35,36, evenals de fluorescentie37,38 en daarom worden meestal gebruikt voor het insluiten van post op-sectie immunolabeling39 , 40 en op-sectie CLEM41,42,43,44, waar de LM wordt gedaan na de insluiten. Beide benaderingen (immuno-EM en op-sectie CLEM) moeten worden cruciaal voor die experimenten in die niet-karakteristieke structuren kunnen gemakkelijk worden gevonden via TEM en/of als een besturingselement tegen miscorrelation tussen LM en EM signalen. Ook labelen met antilichamen die kunnen worden gevisualiseerd door beide beeldvormende modaliteiten (LM en EM) kan worden uitgevoerd45 om, bijvoorbeeld, het identificeren van transfected cellen in LM (vooraf insluiten fase) en bereiken een veel nauwkeurigere lokalisatie van de GFP signaal via haar specifieke etikettering door immuno-EM (post inbedden fase). Er moet rekening worden gehouden, echter, dat permeabilization wordt uitgevoerd voordat LM voor de toegang tot van de antilichamen tegen de intracellulaire ruimte, die in een suboptimale behoud van de architectuur van de cel op het niveau van de EM resulteren kan. Interessant is dat dit protocol is ook geschikt voor Multi-Color die experimenten met het gebruik van andere fluorescerende tags, dan GFP kan worden bereikt (zoals hier). Kortom, zijn er vele putatief mogelijkheden van aanpassing van dit protocol, zowel op de LM en/of op de zijkanten van de EM, afhankelijk van de vragen die worden aangepakt. Voor een uitgebreide beschrijving van andere alternatieve protocollen wordt de lezer verwezen naar5,46. Ongeacht hoe de microscopie modaliteiten worden gecombineerd, is het resultaat samen een winst van informatie, zodat we beter begrijpen hoe virussen en hun eiwitten interactie met hun legers in het echte leven.
De meest kritische stap binnen deze methode is de verzameling van seriële secties uit de cellen van belang. Zoals benadrukt in de sectie representatieve resultaten vereist dit deskundige medewerkers, evenals veel geduld. Nog belangrijker is, is deze stap is essentieel om te vinden de cellen terug op het niveau van de EM om twee redenen. Ten eerste, in dit soort CLEM protocol gebruikt vooraf te embedding LM, de coördinaten zijn alleen zichtbaar op de LM-niveau en op het gezicht van de blok hars na de insluiten. Echter, zij zal niet zichtbaar zijn op de trajecten door TEM. Gerichte trimmen op het blok naar beneden naar de regio's van belang (ROIs) moet daarom zorgvuldig worden uitgevoerd met een scheermesje om ervoor te zorgen dat de secties die vervolgens worden verkregen de cellen worden, uiting geven aan een bepaalde FP. Ten tweede is het noodzakelijk te vinden van de beste overlay tussen de LM en de overnames van EM "scannen" verschillende secties. In tegenstelling tot methoden waar LM in de post te embedding stadium wordt uitgevoerd, is in dit geval de LM-EM-overlay niet zo nauwkeurig. De lage overlay nauwkeurigheid is te wijten aan verschillen in axiale resolutie tussen LM en EM, krimp tijdens de verwerking van de steekproef van EM, en tijdens het segmenteren van42gecomprimeerd. Toch helpen efficiënt bijhouden methoden, zoals het gebruik van bezienswaardigheden, de cellen terug te vinden. Het gaat hierbij om de positie van één cel naar de andere, evenals de vorm van de cellen en hun kern. In dit opzicht zoals uiteengezet in het protocol, geven DIC-afbeeldingen "anatomische" informatie van de cellen die essentieel zijn voor het verbeteren van de correlatie. Als alternatief, de kernen of andere organellen goed herkenbare cel (zoals mitochondriën of lipide druppels) kunnen worden gekleurd voor LM en gebruikt als monumenten.
Tot slot is het opmerkelijk te noemen dat hoewel dit manuscript is gericht op het gebruik van deze techniek voor Virologie studies, het toepassingsgebied van deze proefopzet kan worden uitgebreid om aan te pakken van de meer algemene vragen van de biologische.

Het idee van het combineren van twee microscopie modaliteiten te verkrijgen van een beter beeld van een specifieke biologisch proces is vrij oud. Dus, de allereerste studie over virussen met behulp van "oereenstemming microscopie" werd gepubliceerd in 1960 als twee aparte publicaties1,2. In deze studie analyseerde de auteurs de veranderingen in de morfologie van de kern geïnduceerd door adenovirussen door middel van twee microscopie technieken. In de eerste publicatie waren elektronenmicroscopie (EM) opmerkingen met een beschrijving van de morfologische details adenovirus infectie gekoppeld gerapporteerde1. In een tweede publicatie, werden de verschillende structuren waargenomen door EM gecorreleerd met lichte microscopie (LM) beelden van histochemische kleuring patronen, vast te stellen van de aard van de structuren die eerder waargenomen door EM2.
In deze vroege studies, werden hun opmerkingen echter uitgevoerd met behulp van verschillende geïnfecteerde cellen bereid als onafhankelijke experimenten. De "correlatie" was, inderdaad, bedoeld als de combinatie van informatie die afkomstig is uit twee beeldvormende modaliteiten te begrijpen van een bepaalde verschijnsel, alle bevindingen die zijn verkregen met verschillende testen om te begrijpen van een bepaalde biologische vergelijken proces.
Tegenwoordig wordt de term oereenstemming microscopie, ook bekend als oereenstemming licht- en elektronenmicroscopie (CLEM), toegepast op een toenemend aantal methoden (herzien in verwijzingen3,4,,5), met de gemeenschappelijkheid dat beide beeldvormingstechnieken (LM en EM) worden uitgevoerd op de zeer dezelfde steekproef. De combinatie van beide methoden resulteert daardoor in een multimodale Multi-Scale en multi-dimensionale analyse van dat monster3. De voordelen zijn dat LM een breed overzicht van vele verschillende cellen bieden kan, waardoor de identificatie van cel subpopulaties uiting van een eiwitten of proteïnen van belang in een heterogene-celpopulatie. EM overwint de resolutie limiet van LM, bieden een hogere resolutiebeeld van een bepaalde intracellulaire gebeurtenis. EM maakt bovendien de visualisatie van de niet-belichting fluorescerende subcellular context, met inbegrip van alle membraan gebonden organellen, grote macromoleculaire complexen (bijvoorbeeld ribosomen, centrioles, enz.) en cytoskeletal elementen, waardoor aanvullende ruimtelijke informatie, de zogenaamde "verwijst naar ruimte",6, en geven context naar de fluorescerende plek gedetecteerd door LM.
Tijdens de laatste jaren, CLEM is uitgegroeid tot een krachtig instrument, niet alleen voor cel biologen5, maar ook voor virologen (herzien in referentie7) bereid zijn om te begrijpen van de complexe virus-cel interactie die tot een succesvol virus verspreiding leiden. Begrijpen hoe virussen wijzigen celmembranen en organellen in hun eigen voordeel is dus essentieel voor het ontwikkelen van antivirale middelen voor de uitroeiing van pathogene virussen.
Hier, wordt een CLEM methode beschreven waarmee de detectie door LM van cellen uiten van virale eiwitten gesmolten aan een fluorescente proteïne (FP). Deze cellen zijn vervolgens cryo-geïmmobiliseerd en verder voorbereid voor Ultrastructurele analyse via transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) te krijgen van nieuwe inzichten in hoe de expressie van deze proteïnen herschikken intracellulaire membranen (Figuur 1). CLEM is uitgevoerd met chemisch vaste cellen in de meeste van de virologie studies gepubliceerd naar datum8,9,10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19. Dit is voornamelijk te wijten aan de noodzaak van het inactiveren van besmettelijk materiaal voor bioveiligheid redenen in biosafety level-2 en -3 (BSL-2 en BSL-3) laboratoria, waar cryo-immobilisatie van cellen meestal niet mogelijk is. Deze vragen vereisen een optimaal behoud van de celmembranen, is, verglazing via hogedruk bevriezing (HPF) echter raadzaam20. In deze gevallen, kan het protocol van de CLEM hier beschreven worden toegepast. Interessant, met name bij het werken met infectieuze specimens, kan HPF worden uitgevoerd op monsters die eerder chemisch geïnactiveerd, bijvoorbeeld in BSL-2 en3 BSL laboratoria zijn. De combinatie van chemische fixatie gevolgd door HPF is een mogelijkheid om op zijn minst gedeeltelijk profiteren van de voordelen van cryo-behoud methoden21,22.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig1.jpg"> Figuur 1 : Schematische weergave van de workflow voor de analyse van cellen via CLEM. Cellen groeien op patroon saffier schijven worden eerst geanalyseerd door LM te lokaliseren cellen uiten FPs vóór de verwerking ervan voor EM. Zodra gevonden, worden cellen meteen opgelost door HPF en FS vervolgens in de hars ingesloten. Bij de polymerisatie van de hars, de steun waar de cellen groeiden (= saffier schijven) moeten worden verwijderd uit het blok hars. Het blok met de ingesloten cellen is bijgesneden tot een kleine trapezium waaruit de resterende cellen, uiting van FPs, met een mes van de diamant worden gesegmenteerd. Uiterst dunne secties worden verzameld op slot rasters en verder onderzocht door TEM ultrastructurele informatie verkrijgen van deze cellen. Dit cijfer is aangepast en bewerkt met toestemming van referentie29. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2451px;" width="2450">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">UV Crosslinker</td>
			<td style="width:392px;">Stratagene</td>
			<td style="width:149px;">400072</td>
			<td style="width:1539px;">Stratalinker 1800, 230Vac, equipped with 254-nm UV light bulbs, 8-watts/each.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Patterned sapphire discs</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td>
			<td>627</td>
			<td>They have a 0.3-mm diameter and are 0.16-mm thick, as well as an an etched alphanumeric pattern to allow for re-location of the cells. They can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Slim and long tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>72919-SS</td>
			<td>&#34;Style SS&#34;, for handling sapphire discs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Cell culture medium</td>
			<td style="width:392px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:149px;">41965-062</td>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle medium (DMEM) supplemented with 2 mM L-glutamine, nonessential amino acids, 100 units penicillin per ml, 100 &#181;g streptomycin per ml and 10% fetal calf serum (DMEM complete, see below). Package containing 10 bottles, 500 ml/each.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:392px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:149px;">25030-123</td>
			<td style="width:1539px;">Package containing 20 bottles of 100 ml/each.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Nonessential amino acids</td>
			<td style="width:392px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:149px;">11140-068</td>
			<td style="width:1539px;">Package containing 20 bottles of 100 ml/each.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:392px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:149px;">15140-163</td>
			<td style="width:1539px;">Package containing 20 bottles of 100 ml/each.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:392px;">Sigma Aldrich, St. Louis, MI, USA</td>
			<td>F7524</td>
			<td style="width:1539px;">Bottle of 50 ml.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:392px;">Olympus Deutschland, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:149px;">CKX41</td>
			<td>It is an inverted microscope with trinocular head options and fluorescence upgrade capability.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Huh7-Lunet cells stably expressing the T7 RNA-polymerase</td>
			<td style="width:392px;">Avaliable at Prof. Dr. Ralf Bartenschlager laboratory</td>
			<td style="width:149px;">Not available</td>
			<td style="width:1539px;">Contact Prof. Bartenschlager at: ralf.bartenschlager@med.uni-heidelberg.de.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Mirus TransIT-LT1 Transfection Reagent</td>
			<td>Mirus Bio LLC, Madison, USA</td>
			<td style="width:149px;">MIR 2304</td>
			<td style="width:1539px;">Broad spectrum, low toxicity, DNA transfection reagent. Vial of 0.4 ml.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Inverted widefield fluorescence microscope</td>
			<td style="width:392px;">Carl Zeiss Microscopy GmbH, Germany</td>
			<td style="width:149px;">Zeiss Observer.Z1</td>
			<td style="width:1539px;">Inverted fluorescence microscope for experiments involving living cell cultures.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-hexadecene</td>
			<td style="width:392px;">Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>8220640100</td>
			<td style="width:1539px;">Bottle of 100 ml.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#34;A&#34; aluminium holders for high pressure frezing (HPF)</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td>
			<td>241</td>
			<td>This is the holder that has been used for this protocol and has 2 different depths of 0.1 and 0.2-mm. It can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#34;B&#34; aluminium holders for HPF</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td>
			<td>242</td>
			<td>This is the holder that has been used for this protocol.It is 0.3-mm thick.They can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">&#34;A&#34; aluminium holder for HPF (special for working with patterned sapphire discs)</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td>
			<td style="width:149px;">737</td>
			<td style="width:1539px;">This is the holder than can be used alone with the patterned sapphire disc (as an alternative to the current protocol), without the need of a &#34;B&#34; holder or the edition of the &#34;A&#34; holder. It is 0.84-mm thick. It can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Sapphire discs</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td>
			<td style="width:149px;">405</td>
			<td style="width:1539px;">These sapphires discs are the &#34;conventional&#34; one, with a 0.3-mm diameter and a thickness of 0.05 mm . They can be also used for CLEM as an alternative instead of patterned sapphire discs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Finder grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, Philadelphia, USA</td>
			<td>LF135-Cu</td>
			<td style="width:1539px;">These 135 mesh grids are used to create an alphanumeric pattern on &#34;conventional&#34; sapphire discs (described above) via carbon coating, so that they can be used for CLEM. 100 grids/vial.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPF machine</td>
			<td style="width:392px;">ABRA Fluid AG, Widnau, Switzerland</td>
			<td style="width:149px;">HPM 01</td>
			<td style="width:1539px;">This HPF machine has been used for this protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HPF machine</td>
			<td style="width:392px;">Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td style="width:149px;">EMPACT 2</td>
			<td style="width:1539px;">&#34;EMPACT 2&#34;, as an alternative to the use of the HPM machine that it has been used in this protocol (described above).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Cryo-tubes</td>
			<td style="width:392px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:149px;">Z763667-500EA</td>
			<td style="width:1539px;">For long term-storage of cryo-immobilized samples in liquid nitrogen. Package containing 500 cryovials.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Liquid nitrogen dewar</td>
			<td>Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany</td>
			<td style="width:149px;">GZ-05094-60</td>
			<td style="width:1539px;">For long term-storage of cryo-immobilized samples in liquid nitrogen, equipped with cryo-racks with a capacity of 1600 cryo-tubes.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Automatic freeze substitution (AFS) machine</td>
			<td style="width:392px;">Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td style="width:149px;">EM AFS2</td>
			<td>This machine performs freeze substitution and progressive lowering of temperature (PLT) techniques and allows low temperature embedding and polymerization of resins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Osmium tetroxide (OsO4)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>19150</td>
			<td>4% aqueous solution, one box containing 10 x 2 ml ampules.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uranyl-Acetate (UA)</td>
			<td>Serva, Heidelberg, Germany</td>
			<td>77879.01</td>
			<td>Bottle containing 25 grs of (UA)-2 H2O.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Sonicator</td>
			<td style="width:392px;">Bandelin Electronic, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:149px;">329</td>
			<td style="width:1539px;">&#34;Sonorex Super RK 31&#34; is a high-power ultrasonic cleaning bath for aqueous cleaning solution that is used in this protocol to mix OsO4 and Ua when preparing the FS medium.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass-distilled acetone</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>10015</td>
			<td>Bottle of 100 ml.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:392px;">Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td style="width:149px;">Leica M80</td>
			<td style="width:1539px;">Routine stereomicroscope for daily inspections, equipped with a camera for capturing images.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Epoxy resin</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td style="width:149px;">14120</td>
			<td style="width:1539px;">Embed 812 is a kit containing several components that must be mix together in the proportions given by the manufacturers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Flow through rings</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td>16707157</td>
			<td>Package containing 100 pieces.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Reagent baths</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td>16707154</td>
			<td>Package containing 100 pieces.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td>Leica EM UC7</td>
			<td>Ultramicrotome for preparation of semi- and ultrathin sections at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra 35&#176; diamond knife</td>
			<td>Diatome Ltd., Nidau 
			Switzerland</td>
			<td>AGG339-735</td>
			<td>This knife have an edge length of 3 mm.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra fine tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>E78318</td>
			<td style="width:1539px;">&#34;Style 3X&#34;, for handling EM grids.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EM slot grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>G2010-Cu</td>
			<td>100 grids/vial.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EM grid storage box</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>71155</td>
			<td>It has capacity for 100 grids.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

correlative light electron microscopy (clem) for tracking and imaging viral protein associated structures in cryo-immobilized cells

Als gevolg van de hoge resolutie is elektronenmicroscopie (EM) een onmisbaar hulpmiddel voor virologen. Een van de belangrijkste problemen bij het analyseren van virus-geïnfecteerde of transfected cellen via EM zijn echter de lage efficiëntie van infectie of transfectie, het onderzoek van deze cellen belemmeren. Om deze moeilijkheid te overwinnen, kan de lichte microscopie (LM) eerst worden uitgevoerd om de subpopulatie van besmette of transfected cellen toewijzen. Zo profiteren van het gebruik van fluorescente proteïnen (FPs) gesmolten aan virale eiwitten, LM wordt hier gebruikt om op te nemen van de standpunten van de "positieve-transfected" cellen, uiting geven aan een FP en groeien op een ondersteuning met een alfanumeriek patroon. Vervolgens cellen worden verder verwerkt voor EM via hogedruk bevriezing (HPF), bevriezen van substitutie (FS) en hars inbedding. De ultra snelle bevriezing stap zorgt voor uitstekende membraan behoud van de geselecteerde cellen die kunnen vervolgens worden geanalyseerd op ultrastructureel niveau door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). Hier, wordt een stapsgewijze oereenstemming licht-elektronenmicroscopie (CLEM) workflow verstrekt, bereiding van de monsters, beeldvorming en correlatie in detail beschrijven. De proefopzet kan ook worden toegepast om aan te pakken veel cel biologie vragen.

Met behulp van de procedure die hier gepresenteerd (Figuur 1), Huh7-Lunet cellen stabiel uiten de T7-RNA-polymerase werden zaadjes op patroon saffieren schijven en vervolgens transfected met een plasmide uiten twee domeinen van het Hepatitis C-virus (HCV) nonstructural eiwit NS5A, gelabeld met GFP (pTM_AH-D1-GFP) (Figuur 4). De volgende dag, werden het patroon saffier schijven, waar de cellen groeiden, genomen uit de cel cultuur gerechten en beeld door middel van LM (Figuur 4, Figuur 2). Die cellen uiten van de AH-D1-GFP werden geïdentificeerd door de aanwezigheid van groene fluorescentie in het cytosol en geregistreerd om op te slaan hun posities binnen het coördinaat-patroon van de saffier schijven (cijfers 5A, 5B). Onmiddellijk na hun LM-onderzoek, de sapphire schijven met de cellen die van belang waren tussen twee aluminium dragers (Figuur 3) is geassembleerd en onderworpen aan cryo-immobilisatie door HPF. Cellen werden vervolgens blokkeert gesubstitueerde en vervolgens ingesloten in een epoxyhars.
Na verwijdering van de saffier schijven uit de gepolymeriseerde hars blokken was de opdruk van de alfanumerieke patroon zichtbaar op het gezicht van het blok, waardoor het ophalen van de gebieden waar de cellen van belang gelegen waren. De rest van de hars blok was weg geknipt voor het genereren van een kleine trapezium herbergen van de cellen van belang. Seriële uiterst dunne secties verkregen is van deze trapezium, verzameld op EM sleuf rasters en verder geanalyseerd door TEM (Figuur 5C). Opmerking dat verkrijgen van handmatig seriële opeenvolgende secties, hoewel haalbaar28 is intensieve arbeid en goed opgeleide en geschoolde personeel vereist. Het is ook belangrijk dat de cellen een lage confluentie hebben wanneer onderworpen aan dit protocol CLEM (Figuur 5A) teneinde een snelle herkenning van dezelfde cel eerder aangeduid door LM. Anders, met hogere cel confluentie kan dramatisch vertragen de succesvolle lokaliseren van cellen op het niveau van de EM.
TEM analyse van verschillende uiterst dunne secties van de cel van belang (cijfers 5D, 5E), de aanwezigheid in de intracellulaire ruimte van grote opeenhopingen van blaasjes van variabele morfologie gescheiden van uiting van de AH-D1-GFP, bleek de Omringende cytosol door een enkele lipide dubbelgelaagde (Figuur 5E).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig4.jpg"> Figuur 4 : Schematische weergave van de werkstroom gevolgd voor het uitvoeren van het afgebeelde CLEM voorbeeld Figuur 5 . Huh7-Lunet cellen transfected stabiel uiten de T7-RNA-polymerase werden met een DNA plasmide codering de amphipathic helix (AH) en het domein 1 (D1) van de eiwitten van het HCV NS5A, tagged op de C-terminal met GFP (pTM_AH-D1-GFP). De uitdrukking van dit deel van het NS5A-eiwit wordt transcriptionally gecontroleerd door een T7 promotor (T7 Pm) en translationally door een encefalomyocarditis virus (EMCV) IRES (interne ribosome entry site) element, aangegeven door een secundaire structuur. Vierentwintig uur na transfectie (24 hpt) cellen groeien op patroon saffier schijven en uiten van de AH-D1-GFP werden gedetecteerd door LM en onmiddellijk onderworpen aan HPF-FS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig5.jpg"> Figuur 5 : Voorbeeld van een procedure van CLEM. (A) Huh7-Lunet cellen stabiel uiten de T7 polymerase geanalyseerd door fluorescentie microscopie GFP-positieve cellen geteeld op patroon saffier schijven, 24 uur na de transfectie met de plasmide pTM_AH-D1-GFP toewijzen. (B) hogere vergroting afbeelding van een enkele cel binnen de witte onderbroken rechthoek geselecteerd om te worden geanalyseerd door CLEM. (C) TEM afbeelding van een uiterst dunne sectie van dezelfde cel na HPF, FS en hars inbedding. (D) schematische weergave van seriële 70-nm uiterst dunne secties op een grid van de sleuf EM met de cel van belang. (E) aan de linkerkant: TEM overzichten van twee secties van de cel van belang. Aan de rechterkant: hoge vergroting TEM beelden van de intracellulaire gebieden geselecteerd in gele rechthoeken aan de linkerkant, hoge aantal blaasjes gescheiden van het cytosol via een één membraan onthullen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells at JoVE.com

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Oereenstemming lichte elektronenmicroscopie (CLEM) voor het bijhouden en Imaging virale eiwitten verbonden structuren in Cryo-geïmmobiliseerd cellen

Een oereenstemming lichte elektronenmicroscopie (CLEM) methode wordt toegepast op afbeelding virus-geïnduceerde intracellulaire structuren via elektronenmicroscopie (EM) in de cellen die eerder door de lichte microscopie (LM) zijn geselecteerd. LM en EM worden gecombineerd als een hybride beeldvorming aanpak om een geïntegreerde visie van virus-gastheer interacties.

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Drie-dimensionale Optische resolutie Fotoakoestisch Microscopie

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

Low-Cost Cryo-Light Microscopie Stage Fabrication voor Gecorreleerde Light / Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Virale nanopartikels voor<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Correlatieve microscopie voor 3D Structural Analysis van Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

In situ drukbelasting en Correlatieve Niet-invasieve beeldvorming van de Bone-parodontale ligament-tooth Stapel Joint

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescentie-blussen van een liposomaal ingekapseld nabij-infrarood Fluorofoor als een instrument voor<em&gt; In Vivo</em&gt; Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

Het bestuderen van de stoichiometrie van de epidermale groeifactor receptor in intacte cellen met Correlatieve Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

Correlatieve licht- en elektronenmicroscopie met behulp van Quantum Dot Nanodeeltjes

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Licht vel fluorescentie microscopie voor de studie van het lymfkliertest hart

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualiseren van hechting vorming in cellen door middel van geavanceerde draaiende schijf-totale interne reflectie fluorescentie microscopie

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...